制备啮齿类动物创伤后癫痫发生的潜伏期模型

摘要

部分分离的皮层（“下切”）是一种研究创伤后癫痫发生的有效动物模型。本文将演示如何制作一种新型外科手术装置，并利用该装置制造更精确且可重复的病灶，以建立此模型。

摘要

部分分离皮层（“下切”）是一种创伤后癫痫发生的动物模型。该手术操作包括切开感觉运动皮层及其下方的白质（下切），从而使大脑皮层的特定区域在很大程度上与邻近皮层及皮层下区域隔离开来^1-3。术后经过两周或更长时间的潜伏期后，可在啮齿类动物的脑片中记录到癫痫样放电¹；而在其他物种（如猫和猴）中则可观察到体内（in vivo）的电生理发作或行为性癫痫发作^4-6。这一成熟的动物模型能够有效模拟创伤性脑损伤的多个重要特征。然而，在小型啮齿类动物脑组织中徒手进行精确的皮层损伤在技术上具有挑战性。基于斯坦福大学David Prince博士实验室最初建立的手术方法¹，本文介绍了一种改进的技术，用于在小鼠和大鼠中制备该动物模型。我们展示了如何制作一种简易的手术装置，并利用该装置更好地控制切割深度和角度，从而获得更精确且可重复性更高的结果。该装置制作简便，操作方法易于掌握。该动物模型的建立为研究创伤后癫痫发生的机制提供了一个高效的实验体系。

方案

1. 制作一种用于 undercut 手术的简易装置

1. 我们设计的 undercut 装置由三个部分组成（图 1）：（1）由不锈钢或塑料制成的支撑板，用于固定导管和针头，在手术过程中横跨颅窗；（2）导管，用于固定针头位置并允许针头旋转；（3）针头，在距离尖端约 3 mm 处呈 90 度弯曲，可通过旋转和插入进行移动。
2. 取一块 1-1.5 mm 厚、7~10 × 30 mm 的矩形不锈钢或透明塑料（1），用于制作支撑板。准备一支 1.5 英寸 22 号（BD 公司，#305156）和一支 1.5 英寸 25 号（BD 公司，#305127）的注射针头。制作导管时，将 22 号注射针头的塑料端和下部针尖切除，使其总长度约为 31-32 mm（2）。打磨金属端，使其平整光滑。该导管的最终长度应比 25 号注射针头短约 5-6 mm。
3. 使用氰基丙烯酸盐胶水将导管固定在支撑板上，确保针头与金属边缘垂直。
4. 将 25 号注射针头插入导管中，并在距离尖端 2.5-3 mm 处将针头弯曲 90 度（图 1）。
5. 通过在针头上端粘接一段小塑料管来调节针头的垂直移动范围（图 1，针头限位器）。针头的最终移动范围决定了其可插入皮层的深度，P21 大鼠应为 1.6-1.8 mm，P21 小鼠应为 1.3-1.5 mm。此长度需根据动物的不同种类和年龄进行调整。
6. 在针头上端沿弯曲尖端方向粘接一段细铜丝或一小段胶带（图 1，针头指示器）。该铜丝或胶带用于指示 undercut 手术过程中针头的旋转角度（图 1）。

2. 动物准备

1. 所有手术器械均需经过高压灭菌、玻璃珠灭菌器灭菌，或使用70%乙醇消毒。
2. 我们使用出生后20至22天（P20-22）的Sprague/Dawley大鼠或同龄CD1小鼠。根据不同研究项目的需要，也可选用其他品系的小鼠或大鼠。
3. 通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg的氯胺酮和8 mg/kg的赛拉嗪进行麻醉。当动物对尾部夹捏无反应时，开始手术操作。在手术过程中，如必要，可追加原麻醉混合剂剂量的三分之一作为补充剂量，以恢复原有的麻醉状态。
4. 使用电动理发器剪除动物头皮上的毛发。在动物眼睛上涂抹少量眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。先用10%聚维酮碘溶液对头皮进行消毒，再用70%乙醇擦拭。
5. 将动物固定于立体定位仪上，以保持头部稳定不动。在整个手术过程中，将动物置于加热垫上，以防低体温。
6. 使用手术刀沿中线从前向后做一纵行切口，切口范围从人字缝延伸至两眼之间。用止血钳将皮肤拉开，充分暴露左侧颅骨。
7. 在左侧颅骨上做一矩形切口，并用手术刀刮除骨膜。此步骤可减少出血，并有利于后续颅骨钻孔操作。

3. 制作倒凹

1. 在暴露的颅骨区域滴加少量无菌生理盐水，然后使用若干棉签清除血液并擦干该区域。
2. 在手术显微镜下，于左侧颅骨中央（大约位于左侧感觉运动皮层上方）钻出一个矩形沟槽（大鼠约为 5 × 7 mm，小鼠为 4 × 5 mm）。在颅骨上滴加一滴生理盐水有助于钻孔并散热。当钻至骨层深度约 2/3 时，吸除多余生理盐水，并用棉签清洁钻孔区域。随后缓慢而小心地继续加深钻孔，直至中央骨片在镊子轻触下可移动。
3. 将镊子尖端插入骨片边缘，缓慢抬起镊子，小心移除中央骨片，以暴露左侧大脑半球。
4. 在手术显微镜下，手持 undercut 装置，使针头朝向旁矢状方向，支撑板垂直于中线，并将装置轻微向尾侧倾斜，以便持续观察针尖及目标皮层区域。将针尖对准冠状窗中部、上矢状窦外侧 1–2 mm 的区域，避免直接穿透大血管。
5. 将针头水平方向穿过硬脑膜并在软脑膜下推进，以避开血管。将 undercut 装置底部置于颅骨窗两侧边缘，使针头垂直于皮层表面（图 1）。用手将装置稳定地置于颅骨窗边缘，可显著减少或消除后续操作中的手部抖动。将针头抬升至软脑膜下方，然后缓慢下放，进行横穿皮层的切割，直至针头无法继续深入。随后将针头朝远离中线方向旋转约 135°，形成一个半圆形的白质/深层 VI 层 undercut。再次将针头抬升至软脑膜下方，向后倾斜装置并撤出针头。
6. 可选步骤：可重复上述操作（步骤 2.5），但在过程中不旋转针头，以在颅骨窗的外侧边缘额外制作一条横穿皮层的切口，从而实现更完全的皮层隔离。
7. 将一片塑料薄膜（6 × 6 mm）覆盖在颅骨窗上以作保护，缝合头皮。将动物置于加热垫上，直至其从麻醉中完全恢复。

4. 代表性结果：

冠状皮层切片可用于验证减压切开手术的成功。在制备的切片中可进行确认 >术后2周，在显微镜低倍镜下可辨认出经皮质切口和潜切切口（图2）。部分分离的皮质通常会略微变薄，且在大多数皮质脑片中可通过场电位记录检测到癫痫样活动（图3）。

相比之下，白质或深层皮质层中形成较大的孔洞、病变皮质显著变薄，或切片位置偏离白质上方或下方，均会导致脑组织无法用于后续实验。

图1. 潜切装置的结构与应用。 一根导管（2）被粘附在由不锈钢或透明塑料制成的支撑板（1）上。一根注射器针头（3）穿过导管，并在其尖端前约3 mm处弯曲。在针头上端粘附一个由塑料管制成的针止位器，使针头的垂直移动范围分别限制在约1.2 mm（用于P21小鼠）和约1.5 mm（用于大鼠）。一段细铜丝固定在手柄下方，作为弯针方向的指示标志。请注意，该装置呈倾斜状态，并与颅窗边缘两侧接触，以便制作与软脑膜表面平行的切口。

图2. 深层切片的代表性图像。A. 对P48大鼠在造模后两周制备的脑片进行荧光成像。切割损伤部位用荧光染料DiI标记。右侧白色箭头指示穿过皮层的切口，底部箭头指示穿过第四层与白质边界处的深层切口。

图 3. 来自切开式脑片的场电位记录。 来自切开式脑片的场电位记录显示出癫痫样活动，提示受损皮层组织存在过度兴奋性。

讨论

潜掘模型是研究创伤后癫痫发生的一种高效系统。典型的手术仅需约20-30分钟即可完成，术后两周可在大多数动物的脑片中记录到诱发性或自发性癫痫样活动^1-2。更重要的是，该模型模拟了创伤性脑损伤后的一些变化特征，如出血、炎症、水肿、轴突切断和神经元死亡⁷。不仅在啮齿类及其他动物中观察到癫痫样活动，而且在具有类似皮层损伤的人类患者中也已记录到癫痫发作⁸。近年来，在阐明其潜在机制方面已取得显著进展。在损伤后>2周的脑片中已记录到自发性和诱发性痫样间歇放电，这些活动被发现起源于大鼠皮层第五层¹。已有证据表明存在神经环路重组、GABA能中间神经元丢失及去抑制现象、神经元膜兴奋性增强以及兴奋性突触连接增强，这些变化尤其明显地出现在皮层第五层^2,9-13。

本文介绍了一种用于制作潜行性损伤（undercut lesions）的新型仪器。当徒手进行潜行手术时，手部震颤常导致难以稳定且精确地制作皮层损伤。尽管通过练习和经验积累可提高手术质量，但损伤的深度和质量仍存在显著差异。本文所介绍的装...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
福多姆微型电机套装	设备	Foredom	K.1070
1.5 英寸 22 号注射器针头	材料	BD Biosciences	305156
1.5 英寸 25 号注射器针头	材料	BD Biosciences	305127
氰基丙烯酸酯胶水	材料	Ted Pella, Inc.	14450