流式细胞仪分析小鼠主动脉内流的免疫细胞

Summary

本文介绍一个基于流式细胞仪的方法进行调查的主动脉免疫组成。该文件还说明了一个额外的技术，允许单独审视周围的外膜和血管壁。这种方法打开执行主动脉白细胞表型分析，适用于动脉粥样硬化研究的几种免疫检测的可能性。

Abstract

动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程大中型船只的特点是形成泡沫细胞，免疫细胞，血管内皮细胞和平滑肌细胞，血小板，细胞外基质，具有广泛坏死富含脂质核心组成的斑块和周围组织纤维化¹先天免疫和适应性免疫反应的武器是参与动脉粥样硬化的启动，发展和^持久2，3是一个显着的证据机构，不同亚群的免疫细胞，如巨噬细胞，树突状细胞，T和B淋巴细胞，在目前的健康，易发生动脉粥样硬化^小鼠 4主动脉。此外，免疫细胞被发现在周围，这表明这个组织的重要作用，在动脉粥样^硬化的主动脉外膜2。

一段时间以来，不同类型的免疫细胞，它们的激活状态，和主动脉壁内细胞成分的定量检测RT - PCR和免疫组织化学方法对动脉粥样硬化的研究是有限的。作了一些尝试执行流式细胞仪利用人体的主动脉，和一些问题，如高自体荧光，已^报告 5,6 。人类动脉粥样硬化斑块1胶原酶消化，收集游离细胞和CD14的染色+ /表面CD11c +突出的巨噬细胞源性泡沫细胞。在这项研究中，一个"模拟"通道使用，以避免假阳性染色^。6坏死性材料，在消化过程中积累了大量的碎片，产生在主动脉样品的自体荧光上升。要解决这个问题，阴性和阳性对照小组已经提出，但只有双染色可以应用于这些样本。我们已经开发出一个新的流式细胞仪为基础的方法，分析免疫细胞的组成和特征的活化，增殖，免疫细胞分化的健康，易发生动脉粥样硬化主动脉。此方法使主动脉壁的免疫细胞组成的调查，并打开使用广谱的免疫学方法对这种疾病的免疫方面的调查的可能性。

Protocol

1。分离小鼠主动脉

机构IACUC委员会批准的程序是必需的工作与小鼠。

1. 准备加入肝素钠1000个单位，50毫升PBS和反相混合管heparinzed PBS。准备一个空的收集管的血液和集合管中，PBS为每个要收集的主动脉。所有管置于冰上。
2. Heparinize一个注射器吸取血（1000 U / ml的肝素钠0.1毫升），准备手术工具（两对弯钳，一双解剖剪刀，和一双的microshears），并为解剖解剖阶段。
3. 安乐死鼠标使用二氧化碳，在核准的商会，美国国立卫生研究院和机构IACUC委员会关于啮齿类动物安乐死的政策。将鼠标解剖阶段之前检查的有效性。
4. 简要地用70％乙醇浸泡鼠标和鼠标固定清扫阶段。鼠标通过心脏穿刺吸取血。
5. 打开腹部和胸部腔。使用一个25克针的10毫升注射器，完全用PBS含有肝素的2％，彻底清除血液从心脏穿刺血管的血管灌注。确保没有主动脉组织内的血液。应进行灌注，慢慢地与小的压力，以确保所有斑块在血管壁保持不变。
6. 解剖并取出内脏器官，泌尿生殖系统器官，膈肌和脾，使肾脏，心脏和主动脉完好无损。
7. 仔细解剖脂肪组织和腹主动脉旁淋巴结离主动脉，使主动脉和外膜完好。收集包括整个主动脉主动脉弓，升，降，胸，腹部分。将收集管中，用PBS的离体主动脉。在隔离过程中，尽量保持船只的湿润。

2....

Discussion

在这里，我们提出了一个基于流式细胞仪检测的免疫细胞组成的小鼠主动脉的调查方法。这种方法的主要优点是能够分析主动脉免疫细胞在单细胞水平和表征主动脉白细胞的激活状态。这种方法不仅限于小鼠主动脉和我们（未发表数据）和^其他 10用这种方法来分析人体标本，如乳内动脉，主动脉瓣和冠状动脉。这种方法的一个限制是恢复单一主动脉小鼠主动脉白细胞数量相对较少。虽然从单一的动脉粥样硬化主动脉恢复白细胞数量是足够的流式细胞仪检测实验，细胞丰度低，可能很难检测到在一个单一的主动脉细胞悬液。如果必要的话，这个问题是可以规避使用2-4流式细胞仪染色的主动脉合并样品。此外，由于酶处理可能会影响表面抗原的表达，酶处理的阻力应为所有感兴趣的抗原决定的。之前我们已经验证了几个抗原的标记，这是由^酶消化7的影响。但是，未经测试的抗体克隆，应确认使用流式细胞仪检测^实验 7前的调查。

竞争继转移归位检测是一个功能强大的方法来分析动力学和机制的炎症部位的白细胞招聘。我们成功地应用于流流式细胞仪分析受体小鼠主动脉的主动脉调查白细胞迁移的机制。分析最近增殖细胞，加入溴.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料	产品编号	公司
胶原酶第十一	C7657	Sigma - Aldrich公司
透明质酸	H3506	Sigma - Aldrich公司
我脱氧核糖核酸酶，2型	D4527	Sigma - Aldrich公司
胶原酶我	C0130	Sigma - Aldrich公司
胶原酶二	LS004174	沃辛顿生化公司
弹性蛋白酶	LS002292	沃辛顿生化公司