小鼠主动脉内免疫细胞的流式细胞术分析

摘要

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。

摘要

动脉粥样硬化是一种累及中等和大血管的慢性炎症过程，其特征是形成斑块，斑块由泡沫细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞、血小板、细胞外基质以及富含脂质的核心组成，并伴有周围组织的广泛坏死和纤维化¹。固有免疫和适应性免疫在动脉粥样硬化的起始、发展和持续过程中均发挥重要作用^2,3。大量证据表明，在健康小鼠和易发动脉粥样硬化小鼠的主动脉中均存在不同亚群的免疫细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞⁴。此外，在主动脉外膜周围也发现有免疫细胞存在，提示该组织在动脉粥样形成过程中具有重要作用²。

长期以来，针对不同类型免疫细胞的定量检测、其活化状态以及主动脉壁内的细胞组成的研究，在动脉粥样硬化领域主要受限于RT-PCR和免疫组织化学方法。尽管已有少数研究尝试在人主动脉样本中进行流式细胞术分析，但存在诸多问题，例如较高的自发荧光现象，已有文献对此进行了报道^5,6。既往研究中，采用胶原酶1消化人动脉粥样硬化斑块，收集游离细胞后通过CD14+/CD11c+染色以识别巨噬细胞来源的泡沫细胞。在该研究中，使用了一个“虚拟”通道以避免假阳性染色⁶。然而，在消化过程中积累的坏死物质会产生大量碎片，导致主动脉样本中出现强烈的自发荧光。为解决这一问题，曾提出采用一系列阳性和阴性对照，但在这些样本中仅能实现双重染色。我们已开发出一种基于流式细胞术的新方法⁷，可用于分析健康及易发动脉粥样硬化主动脉中免疫细胞的组成，并表征免疫细胞的活化、增殖与分化状态。该方法使得对主动脉壁免疫细胞组成的深入研究成为可能，并为应用广泛的免疫学技术探讨该疾病的免疫学特征开辟了新途径。

方案

1. 小鼠主动脉的分离

使用小鼠进行实验需获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 通过将1000单位肝素钠加入50 ml PBS中并倒置混匀，制备含肝素的PBS。为待采集的血液准备一个空收集管，为每根待采集的主动脉准备一个含PBS的收集管。所有管子均置于冰上保存。
2. 准备用于采血的肝素化注射器（0.1 ml浓度为1000 U/ml的肝素钠），并准备好手术器械（两把弯镊、一把解剖剪和一把显微剪）以及解剖用解剖板。
3. 按照美国国立卫生研究院（NIH）及机构IACUC委员会关于啮齿类动物安乐死的政策，使用经批准的二氧化碳安乐死装置对小鼠实施安乐死。在将小鼠转移至解剖板前，确认安乐死效果。
4. 用70%乙醇短暂浸泡小鼠，并将其固定在解剖板上。通过心脏穿刺法从小鼠体内采集血液。
5. 打开腹腔和胸腔。使用装有25号针头的10 ml注射器，经心脏穿刺以含2%肝素的PBS彻底灌注血管系统，完全清除血管内的血液。确保主动脉组织内无残留血液。灌注过程应缓慢进行，压力宜低，以保证血管壁上的所有斑块保持完整。
6. 解剖并移除内脏器官、泌尿生殖器官、膈肌和脾脏，保留肾脏、心脏和主动脉完整。
7. 小心剥离主动脉周围的脂肪组织和主动脉旁淋巴结，保持主动脉及其外膜完整。采集整段主动脉，包括主动脉弓、升主动脉、降主动脉、胸主动脉和腹主动脉部分。将分离出的主动脉放入含PBS的收集管中。在分离过程中，应尽量保持血管湿润。

2. 单细胞悬液的制备

1. 制备1X主动脉解离酶储存液（ADES）（在2.5 ml PBS中加入125 U/ml XI型胶原酶、60 U/ml I-s型透明质酸酶、60 U/ml I型DNase和450 U/ml I型胶原酶，改良自Galkina et al.⁷）。所有酶均来自Sigma-Aldrich。将储存酶溶液置于冰上。
2. 移除含有主动脉的收集管中的PBS。向每根主动脉中加入2.5 ml 1X ADES。将主动脉切成小块以促进酶消化，或保持主动脉完整。将主动脉与1X酶溶液在37°C孵育1小时（可选缓慢振荡）。
3. 孵育1小时后，通过机械剪切将消化后的主动脉分散，并经70 μm细胞筛滤入5 ml聚丙烯FACS管（BD Falcon），制备单细胞悬液。离心收集细胞（400×g，5分钟，4°C）。
4. 将细胞重悬于1 ml FACS缓冲液（含1% BSA和0.05% NaN₃的PBS）中，使用台盼蓝染色、血细胞计数板和光学显微镜测定主动脉细胞悬液中的细胞数量。消化后获得的总细胞数取决于小鼠年龄、饮食或动脉粥样硬化严重程度。

3. 流式细胞术染色

1. 标记适量的新FACS管。通常，流式细胞术实验应包括未染色对照管、单色染色管组、适当的荧光减一对照（FMO）⁸、适当的同型对照以及实验组管。由于可分离的主动脉白细胞数量有限，可使用脾脏白细胞进行单色对照染色。
2. 我们采用标准的流式细胞术方案对主动脉细胞悬液进行染色。简言之，将主动脉细胞悬液中的0.5–1×10⁶个细胞分装至FACS管中。加入1 ml FACS缓冲液，通过离心沉淀细胞。倾倒去除沉淀细胞的上清液。
3. 为实验管、荧光减一对照管和同型对照管配制Fc阻断液和抗体混合液。向所有管中加入100 μl Fc阻断液（FACS缓冲液中含14.2 μg/ml，克隆号2.4G2），轻弹管壁或轻微涡旋以重悬细胞。室温孵育15–20分钟。
4. 配制抗体染色、同型对照染色或FMO对照染色混合液。根据预实验中的滴定结果确定抗体的最佳浓度。在存在Fc阻断的条件下，向样品管中加入抗体混合液（100 μl/0.5–1.0×10⁶个细胞）。4°C避光孵育20–30分钟。
5. 向每管中加入1 ml FACS缓冲液，涡旋混匀后离心沉淀细胞。重复该步骤一次。
6. 倾倒上清液，将沉淀细胞重悬于300 μl 2%多聚甲醛（PFA）中。将样品上机进行流式细胞术检测。
   • 注意：通常向所有样品中加入抗CD45抗体（常见的白细胞抗原标记），以便后续设门圈选CD45⁺白细胞⁷。此外，应初始使用CD45的FMO和同型对照来设定CD45⁺白细胞门，因为不同白细胞间的CD45表达水平可能存在差异。
   • 注意：为检测低密度表达的表面抗原或稀有事件抗原，建议使用“高亮度荧光染料”，如R-藻红蛋白（PE）或别藻蓝蛋白（APC）。此外，可通过合并多个匹配的主动脉样本以提高稀有事件的检出率；但若使用超过一百万个细胞，应按比例增加每次检测所用的抗体用量。
   • 注意：为确保分离的主动脉样本及其细胞悬液中血液污染最少，在部分实验中额外进行了TER-119⁷染色，该抗原由红细胞（RBC）表达。血液中红细胞与白细胞（WBC）的数量比约为10×10⁶个细胞/μl 对 8×10³个细胞/μl。根据主动脉样本中TER-119的表达情况，可计算出样本中来源于血液的白细胞百分比。通常我们在主动脉样本中检测到的血液来源WBC比例低于0.02%。（图1）
   • 注意：由于酶处理可能影响表面抗原的表达，应对目标抗原的酶消化耐受性进行评估。简言之，将外周淋巴结（pLN）或脾脏小块组织在37°C下与或不与酶混合液共同孵育1小时。1小时后，通过流式细胞术检测抗原表达水平。酶混合液对多种表面抗原无影响（图2）⁷。但在其他情况下，酶处理可能导致抗原表达显著下降。此问题可通过选用替代性细胞标记物来规避。
   • 注意：如需，可在第4步后进行活/死细胞活力染色。通常使用Live/Dead可固定死细胞染色试剂盒（Invitrogen, Molecular Probes）。为进行活/死染色，将1 μl重新溶解的活/死染料加入1 ml PBS中配制成1×染色液，涡旋混匀。向活/死单染、混合抗体、FMO及同型对照样品中各加入100–200 μl 1×活/死染料。室温避光孵育10分钟。活/死单染对照管应在56°C避光孵育10分钟，以热激方式杀死细胞。用1 ml PBS洗涤细胞并离心沉淀。随后从第5步继续实验流程。
   • 注意：本方案适用于细胞内抗原和细胞因子的胞内染色。简言之，可使用BD Pharmingen、eBioscience或Caltag实验室的细胞固定/通透试剂进行胞内染色——具体选择取决于目标抗原。为进行固定和通透处理，在完成胞外染色步骤（第3节第5步）后，按照制造商说明书执行固定/通透步骤。完成胞内洗涤步骤后，从第6步（第3节第6步）继续本方案。

4. 分离的外膜及血管壁的流式细胞术分析

由于白细胞可迁移至主动脉外膜以及主动脉壁内的动脉粥样硬化斑块，为了通过流式细胞术检测外膜和主动脉中的白细胞，已建立了一种分离并针对这两个解剖部位进行流式细胞术分析的方案⁹。简言之，在整段主动脉用ADES消化（第2节，步骤2）之前，先对外膜进行部分消化，并将其从血管其余部分剥离。一旦外膜被剥离并单独保存，其余主动脉组织则用ADES进行消化，以从血管壁中释放白细胞。

• 主动脉外膜分离方案

1. 在制备1X ADES（第2节步骤1）后，为每根主动脉准备2.5 ml的1X主动脉外膜消化酶溶液（AADES）（在2.5 ml PBS中含781.25 U胶原酶II和14.0625 U弹性蛋白酶（Worthington Biochemical Corp.，Lakewood, NJ））。⁹ 将该储备液置于冰上待用。
2. 从含有主动脉的收集管中移除PBS。向每根主动脉中加入2.5 ml的1X AADES。不要将主动脉切成小段。在37°C下，用1X外膜消化酶溶液孵育主动脉10–20分钟。
3. 经过10–20分钟的消化后，将部分消化的主动脉从1X AADES中转移至含有新鲜PBS的培养皿中。使用两对弯头镊子非常小心地将外膜层作为一个整体从主动脉上剥离。
   • 注意：较长的消化时间有助于更易去除外膜；然而，若外膜消化过度，则容易撕裂。
4. 当外膜完全去除后，将外膜和主动脉分别转移至不同的FACS管中。向盛有外膜的FACS管中加入1 ml PBS，并将该管置于冰上。向盛有主动脉的FACS管中加入2.5 ml的1X主动脉解离酶溶液，并在37°C下孵育40分钟。
   • 注意：为促进酶消化，此时可将主动脉切成更小的片段。
5. 经过40分钟的消化后，将主动脉FACS管置于冰上，通过机械剪切主动脉和外膜组织，并使其通过70 μm细胞筛滤器，分别制备主动脉和外膜的单细胞悬液，收集至5 ml聚丙烯FACS管（BD Falcon）中。离心收集细胞（400×g，5分钟，4°C）。返回第2节步骤4，继续后续实验流程。

5. 代表性结果

本文展示了一系列图示，用于说明通过流式细胞术染色分析整个主动脉、主动脉血管壁及其周围主动脉外膜的免疫细胞组成。首先，我们展示了一个典型的FACS图，显示了全血和分离的主动脉细胞悬液中TER-119的染色情况（图1）。在主动脉细胞悬液中，TER-119阳性的红细胞占细胞总数的18%，这表明从主动脉细胞悬液中分离出的细胞中仅有0.014%来源于血液。这是一个重要的对照实验，明确证明所分析的主动脉细胞悬液中的大多数白细胞来源于消化后的血管组织，而非循环的外周血。此外，为了验证该方法的可靠性，我们评估了主动脉解离用酶混合液对脾细胞表面抗原的影响（图2）。结果显示，该酶混合液对多种表面抗原的表达无影响，包括CD45、CD19、CD3、TCRαβ、TCRγδ以及其他多个表面抗原⁷。

通过结合使用CD45染色、活/死细胞活力染料以及适当的同型对照，可在分析过程中检测并亚群门控主要目标细胞群体，并排除细胞碎片。在图3中，对活的主动脉CD45⁺白细胞进行门控，以确定两只年轻的Apoe^-/-小鼠合并主动脉样本中IFN_Υ+ T细胞所占的比例。为突出本方法的通用性，我们采用图3所示的门控策略，在图4中展示了两隻饲喂西方饮食12周的Apoe^-/-小鼠主动脉中CD68+CD11b+巨噬细胞和IFNγ+TCRαβ+细胞的代表性胞内染色结果。如预期所示，在饲喂西方饮食的Apoe^-/-小鼠主动脉中，主动脉内的大多数白细胞为巨噬细胞（40% CD68+CD11b+）或其他髓系细胞（CD11b+CD68^low 和 CD11b+CD68-）。此外，Th1细胞构成了主动脉浸润性TCRαβ T细胞的主要部分（图4）。由于主动脉白细胞及其亚群的整体比例会因小鼠年龄和动脉粥样硬化严重程度而异，因此针对主要目标细胞群体的最佳门控策略应通过实验确定。

为了证明从主动脉外膜分离细胞并进行流式细胞术染色的可行性，我们展示了主动脉和外膜细胞悬液中白细胞标志物CD45⁺的代表性染色结果（图5）。简言之，将三只老龄Apoe^-/-小鼠的主动脉按前述方法（第2和第4节）进行消化并合并处理。在外膜（占细胞悬液的18%）和剩余主动脉组织（占细胞悬液的11%）中均检测到浸润的CD45⁺白细胞。

图 1.消化后主动脉细胞悬液中的 TER-119 染色。 通过心脏穿刺以含 2% 肝素的 PBS 灌注主动脉，随后在 37°C 下使用酶混合液消化 1 小时。将主动脉细胞悬液和血液样本（作为阳性对照）用抗 TER-119-PE 抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。TER-119 阳性的红细胞占主动脉细胞悬液中所有细胞的 18%，表明从主动脉分离的所有白细胞中仅有约 0.014% 可能为血液来源的白细胞。

图2.酶混合液处理对淋巴细胞上CD45（上图）或CD19（下图）的表达无影响。 分别从未经处理（A、B）和经酶混合液处理（C、D）的淋巴结（LN）中获得细胞悬液，并使用APC-Cy7标记的抗CD45抗体和APC标记的抗CD19单克隆抗体进行染色。（A，C）数字表示R1门中CD45+白细胞所占的百分比。（B，D）数字表示CD45⁺/CD19⁺淋巴细胞所占的百分比。图谱均基于CD45⁺白细胞设门。

图 3. 主动脉白细胞分析的分选策略。 从易发生动脉粥样硬化的 Apoe^-/- 小鼠中分离并合并两根主动脉，并按上述方法制备主动脉单细胞悬液。细胞悬液使用 CD45（PerCP）、TCRαβ（FITC）、IFNγ（eFluor 450）和活/死细胞染料 Aqua 进行染色，并采用经升级的 Cytek DXP 8 色 BD FACS Calibur 流式细胞仪进行分析。简言之，首先圈选 CD45⁺ 白细胞（B），并进一步分析（C–F）。根据活/死细胞染料 Aqua 的染色结果（D）和 FSC 图谱（E）排除死细胞。随后分析活细胞中主动脉白细胞的 TCRαβ 和 IFNγ 表达情况（F）。

图 4. 细胞内抗原和细胞因子的胞内染色。 根据前述方法，从完整的 Apoe^-/- 小鼠主动脉和脾脏制备单细胞悬液。主动脉（A）和脾脏（B，C）细胞悬液使用 BD Cytofix/Cytoperm™ 试剂盒（BD Biosciences）进行 CD45、CD11b 和 CD68 染色，或同型对照染色。细胞设门基于前向散射和侧向散射排除碎片，并选择 CD45⁺ 白细胞。对于胞内 IFNγ 染色，主动脉和脾脏细胞悬液在 RPMI 1640 培养基中培养 5 小时，培养基中添加 Golgi Stop、PMA 和 Ionomycin C，具体如前所述。⁹ 刺激后的主动脉单细胞悬液（D）和脾脏单细胞悬液（E，F）随后使用 CD45（PerCP）、TCRαβ（FITC）、CD3（APC-Cy7）、Live Dead Aqua 和 IFNγ（eFluor 450；E）或同型对照（IgG1-eF450，F）进行染色。T 细胞（D–F）从活的 CD45+CD3+ 白细胞（CD45+Live/Dead Aqua-）中设门，并分析 TCRαβ 和 IFNγ 表达情况。

图5. 分离的小鼠主动脉外膜及主动脉管壁的代表性图像。 代表性流式细胞术等高线图显示，在老年Apoe^-/-小鼠的外膜和主动脉壁中存在CD45⁺ T细胞。SSC—侧向散射。为消除碎片和坏死组织的自发荧光，设门时选择FSC>750。为避免双联体产生的额外自发荧光，设门范围同时设定为FSC<3500，SSC<3500。图中百分比表示门内CD45⁺细胞的比例。

讨论

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究小鼠主动脉中的免疫细胞组成。该方法的主要优势在于能够在单细胞水平上分析主动脉免疫细胞，并表征主动脉白细胞的活化状态。此方法不仅限于小鼠主动脉，我们（未发表数据）及其他研究者¹⁰已采用该方法分析人类样本，如内乳动脉、主动脉瓣和冠状动脉。该方法的一个局限性是从小鼠单根主动脉中回收的白细胞数量相对较少。尽管从单根动脉粥样硬化主动脉中获得的白细胞数量足以进行流式细胞术实验，但在单个主动脉细胞悬液中，丰度较低的细胞可能难以检测。如有必要，可通过合并2-4根主动脉的样本进行流式细胞术染色，以克服这一问题。此外，由于酶处理可能影响表面抗原的表达，因此应对所有目标抗原的耐酶处理能力进行测定。我们此前已验证了多个不受酶消化影响的抗原标记物⁷。然而，在用于流式细胞术实验前，未验证的抗体克隆应由研究者自行验证其适用性⁷。

竞争性过继转移归巢实验是一种用于分析白细胞向炎症部位募集的动力学和机制的强有力方法。我们成功应用了对受体小鼠主动脉进行流式细胞术分析的方法，以研究白细胞向主动脉迁移的机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 XI	Sigma-Aldrich	C7657
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506
DNase I，II 型	Sigma-Aldrich	D4527
胶原酶 I	Sigma-Aldrich	C0130
胶原酶 II	Worthington Biochemical	LS004174
弹性蛋白酶	Worthington Biochemical	LS002292