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1. 小鼠卵母细胞的收集
- 为了从每只小鼠中获得最大数量的窦状卵泡，需对性成熟雌性小鼠（我们使用来自Harlan的6周龄CF-1小鼠）腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）。
- 通过将米力农加入MEM/PVP培养基至终浓度2.5 μM，配制采集培养液（MEM/PVP）（每只小鼠3 ml），并在37°C预热。米力农是一种磷酸二酯酶抑制剂，可在卵母细胞从卵泡中取出后维持其减数分裂阻滞状态。也可使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（0.2 mM）或二丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）（100 μg/ml）替代。通过向1 ml CZB培养基中添加谷氨酰胺（1 mM）和米力农（2.5 μM）配制培养液，并将其置于培养箱中平衡至少1小时。将上述两种培养液分别制成微滴，置于培养皿中，并覆盖石蜡油。将含CZB的培养皿放入培养箱，而含MEM/PVP的培养皿则置于载物台加热器上保持温度。其他 commercially available 的采集和培养液（如Specialty media或Sigma提供的M2和M16）也可常规使用。
- 在PMSG注射约48小时后，采用CO2麻醉结合颈椎脱位法处死小鼠，取出卵巢并置于含有预热MEM/PVP+米力农（MEM/PVP+M）的表面皿中。
- 使用1 ml胰岛素注射器将卵巢固定于培养皿底部，并用数根固定在一起的27号针头（或缝纫针）多次穿刺卵巢，以释放窦状卵泡。
- 在解剖显微镜下，使用口控玻璃移液管收集卵丘-卵母细胞复合体。使用具有高对比度的显微镜有助于操作。也可将含有组织和细胞的培养液转移至塑料培养皿盖上进行收集。仅收集较大的窦状卵泡，避免收集较小的前窦状卵泡或裸露的卵母细胞。收集后，立即转移复合体至置于载物台加热器上、覆盖石蜡油的MEM/PVP+M微滴中。
- 使用口径略大于卵母细胞直径的小移液管，反复吹打复合体以去除卵丘细胞。随后用较大口径的移液管将去卵丘的卵母细胞转移至CZB+米力农（CZB+M）微滴中，并放入培养箱。
- 在进行后续操作前，让卵母细胞在培养箱中恢复至少1小时。
2. 卵母细胞显微注射
- 使用机械拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成注射针。我们采用 Flaming-Brown 微电极拉制仪（型号 P-97），设置参数如下：P=500，Heat=300，Pull=150，Vel=100，Time=150。
- 在已去除培养基腔室的单孔腔载玻片上，将 5 μl 的 MEM/PVP+M 液滴尽可能靠近 0.5 μl 所需注射材料（例如 siRNA、cRNA、吗啉代寡核苷酸等）放置，构成显微注射平台。用矿物油覆盖后置于显微镜载物台上（图 1）。
- 将注射针和固定针插入相应的持针器中，并置于 MEM/PVP+M 液滴内。打开连接至皮升注射仪和防震台的氮气罐。在用培养基填充注射针的同时，轻敲其尖端与固定针接触以打开针尖。若开口过大，培养基会快速进出，导致细胞死亡；若开口过小，则注射针容易堵塞。
- 从培养箱中取出 5–10 个卵母细胞，转移至注射平台的 MEM/PVP+M 液滴中。注射前，设置皮升注射仪参数。我们使用的皮升注射仪（Harvard Apparatus 公司，型号 PLI-100）参数如下：PBal=2.5–3.5 psi，PInj=7.8 psi，PClear=10–12 psi，时间=3 s。此设置可实现每次注射 5–10 pL 的体积。
- 在按住 CLEAR 键的同时，将注射针移至材料液滴中进行填充，随后将其移回培养基液滴中。
- 使用固定针捕获一个卵母细胞，并将注射针、卵母细胞与固定针沿 x 轴方向对齐。
- 在较高放大倍数下，推进注射针穿过卵母细胞，注意避开细胞核。当针尖刺穿质膜后，按下 INJECT 键进行注射。注射完成后，撤回注射针，释放卵母细胞并重复操作。全部卵母细胞注射完毕后，将其放回培养箱中，在 CZB+M 培养基中孵育所需时间；孵育时长取决于实验目的（例如 siRNA 和吗啉代寡核苷酸敲低：最长 24 小时；过表达：3–12 小时）。请注意，超过 24 小时的孵育将影响减数分裂成熟进程。
3. 卵母细胞成熟
- 孵育后，将卵母细胞通过数滴CZB（成熟培养基）洗涤，并转移至油下的一滴成熟培养基中，然后放入培养箱。
- 孵育16小时，使其完全成熟至减数分裂II期的中期。
4. 倍性分析
- 准备 CZB + monastrol（100 μM）并加入 750 μ将样品加入含有水的外环的器官培养皿孔中。
- 将卵子经含monastrol的CZB液滴洗涤数次后，转移至器官培养皿中。置于培养箱中孵育1小时。
- 将卵转移到含有2%多聚甲醛PBS溶液的表玻璃皿中，在室温下固定20分钟。随后转移至另一含有封闭液的表玻璃皿中。该样品可在4℃保存° C，直至处理。
- 转移至透化溶液（PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3在室温下将样品置于表面皿中孵育15分钟。用大量封闭液（PBS + 0.3% BSA + 0.01 Tween-20 + 0.02% NaN₃）冲洗数次。3).
- 其余步骤在避光、室温、加湿的环境中，于96孔板盖上进行。液滴（˜25 μl) 放入圆形凹槽内。将卵转移至封闭溶液中孵育15分钟。
- 为标记着丝粒，将卵母细胞转移至含有1:40稀释的CREST抗血清的封闭液滴中，孵育至少1小时。随后在3滴封闭液中依次洗涤，每滴孵育15分钟。
- 将卵子转移至含有Cy5或Alexa Fluor 594标记的抗人IgG抗体（1:200）的封闭液滴中，孵育1小时。重复上述洗涤步骤，但在最后一步中，于封闭液中加入Sytox Green（1:5,000）以检测染色体。用5 μl Vectashield。为防止压碎卵，将4小滴凡士林置于盖玻片四角位置。将盖玻片覆盖于样本上，并用指甲油封片。置于4℃的载玻片盒中保存。° 直至通过共聚焦显微镜处理前均保持在 C 条件下。
- 使用100倍物镜成像时，采集0.4 μ在Z平面进行步进扫描，对中期纺锤体的整个区域成像。使用图像分析软件（如Image J，NIH）对着丝粒进行计数。
5. 代表性结果：
图2为整倍体卵母细胞的Z轴投影。在MII期中期，整倍体小鼠卵母细胞包含20对染色体，因此具有40个着丝粒。尽管经过monastrol处理，偶尔仍会出现染色体未能充分分散的情况。这种情况使得着丝粒计数难以准确，因此我们不将此类卵母细胞纳入分析。有时，可能难以判断CREST免疫反应性“斑点”是1个还是2个着丝粒。使用Image J等软件进行分析较为有利，因为可以逐层观察每个Z轴切片，同时仔细记录染色体的方向、某一“斑点”在多少个切片中被检测到，以及“斑点”的像素强度。根据减数分裂纺锤体相对于极体的位置不同，DNA区域可能发生重叠，此类样本不应纳入分析。
未处理的 体内 来自生殖年龄较轻小鼠的排卵卵母细胞非整倍体发生率较低˜1-2%）。然而，由于尚未明确的原因，显微注射和 体外 成熟处理可使该比率提高10%以上。因此，在任何显微注射研究中，必须包含对照组注射的卵母细胞。
图1. 显微注射培养皿的设置。在载玻片腔室内，位于0.5 μl注射溶液液滴上方略高处，放置5 μl的MEM/PVP + M液滴，表面覆盖矿物油。本示例中包含三种不同的注射溶液，共三个液滴，载玻片置于显微镜载物台上。左侧为显微注射针，右侧为持卵移液管。注意可见针夹的反光影像。
图2. 倍性检测结果。正常二倍体中期II卵母细胞的Z轴投影图像。DNA呈绿色，动粒呈红色。箭头所指为两条独立的染色单体臂，表明动粒（#17和#18）存在重叠。正常二倍体小鼠卵母细胞含有20对动粒（共40个“信号点”）。非整倍体卵母细胞的动粒数目则为此数目的任意变异。若该实验在中期I卵母细胞上进行，则应观察到40对动粒（共80个“信号点”）。
表1. 收集与显微注射培养基（MEM/PVP + M）配方。所有试剂均为胚胎培养级，购自Sigma-Aldrich。使用0.22μm PVDF滤器（我们使用Millipore Stericups）过滤除菌，4°C保存。
表 2. CZB 培养基配方。所有试剂均为胚胎培养级，购自 Sigma-Aldrich。使用 0.22 μm PVDF 滤器（我们使用 Millipore Stericups）过滤除菌，4°C 保存。