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小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

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DOI：

10.3791/2851

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2011年7月23日

 , 
1Department of Biology, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。

摘要

染色体分离错误会导致非整倍体细胞的产生。在体细胞中，非整倍性与癌症相关；而在配子中，非整倍性则导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。单倍体配子通过物种特异性的发育程序形成，这些程序与减数分裂相偶联。第一次减数分裂（MI）是减数分裂所特有的，因为在此过程中姐妹染色单体保持连接，而同源染色体被分离。由于尚未完全阐明的原因，这种减数分裂更容易出错，相较于减数分裂II（MII）的错误或雄性减数分裂的错误，MI是导致非整倍性更为常见的原因1,2。

在哺乳动物中，卵母细胞在第一次减数分裂前期停滞，此时生发泡（GV；细胞核）大而完整，只有在接收到排卵信号后才恢复减数分裂。减数分裂一旦恢复，卵母细胞即完成第一次减数分裂，并经历一次不对称的细胞分裂，随后再次停滞于第二次减数分裂中期（MII）。卵母细胞只有在被精子受精后才会完成第二次减数分裂。卵母细胞也可通过既定方法进行减数成熟 体外 培养条件 3由于制备转基因和基因靶向小鼠突变体成本较高且耗时较长，对雌性配子进行操作 体外 是一种更经济且节省时间的策略。

本文介绍了从小鼠中分离处于前期停滞的卵母细胞以及进行显微注射的方法。可将任意选定的物质导入卵母细胞，但由于具有减数分裂能力的卵母细胞在转录上处于静默状态 4,5 cRNA 而非 DNA 必须被注射以进行异位表达研究。为评估倍性，我们描述了实验条件 体外 卵母细胞成熟至MII期卵子。历史上，染色体铺展技术被用于染色体数目计数 6该方法在技术上具有挑战性，且仅能用于识别超二倍体。本文中，我们描述了一种利用完整卵细胞检测低二倍体和超二倍体的方法。 7-8该方法使用驱动蛋白-5抑制剂莫纳斯特拉尔（monastrol），可使双极纺锤体塌陷为单极纺锤体 9 从而分离染色体，使得利用抗 CREST 自身免疫血清可轻松检测并计数单个动粒。由于该方法在完整卵细胞中进行，因此不会因操作者误差导致染色体丢失。

方案

1. 小鼠卵母细胞的收集

  1. 为了从每只小鼠中最大化获取窦状卵泡的数量，需对性成熟雌性小鼠（我们使用来自 Harlan 的 6 周龄 CF-1 小鼠）腹腔注射 5 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG）。
  2. 通过将米力农加入 MEM/PVP 培养基至终浓度 2.5 μM，配制收集培养基（MEM/PVP）（每只小鼠 3 ml），并在 37°C 预热。米力农是一种磷酸二酯酶抑制剂，可在卵母细胞从卵泡中取出后维持其减数分裂阻滞状态。也可选用 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（0.2 mM）或二丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）（100 μg/ml）。通过向 1 ml CZB 培养基中添加谷氨酰胺（1 mM）和米力农（2.5 μM）配制培养液，并在培养箱中平衡至少 1 小时。将上述两种培养基分别制成微滴，置于培养皿中，并覆盖矿物油。将含 CZB 的培养皿放入培养箱，而含 MEM/PVP 的培养皿则置于体视显微镜旁的载物台加热器上。其他 commercially available 的收集和培养基（如 Specialty media 或 Sigma 公司的 M2 和 M16）也可常规使用。
  3. 在 PMSG 刺激约 48 小时后，采用 CO2 麻醉结合颈椎脱位法处死小鼠，取出卵巢并置于含有预热 MEM/PVP + 米力农（MEM/PVP+M）的表面皿中。
  4. 使用 1 ml 胰岛素注射器将卵巢固定于培养皿中，并用数根固定在一起的 27 号针头（或缝纫针）多次穿刺卵巢，以释放窦状卵泡。
  5. 在解剖显微镜下，使用口控玻璃移液管收集卵丘-卵母细胞复合体。使用具有高对比度的显微镜有助于操作。也可将含有组织和细胞的培养液转移至塑料培养皿盖上进行收集。仅收集较大的窦状卵泡，避免收集较小的前窦状卵泡或裸卵母细胞。收集后，立即转移复合体至置于载物台加热器上、覆盖矿物油的 MEM/PVP+M 微滴中。
  6. 使用一个略大于卵母细胞直径的小移液管，反复吹打复合体以去除卵丘细胞。随后用较大移液管将去卵丘的卵母细胞转移至 CZB + 米力农（CZB+M）微滴中，并放入培养箱。
  7. 在进行后续操作前，让卵母细胞在培养箱中恢复至少 1 小时。

2. 卵母细胞显微注射

  1. 使用机械拉制仪将硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成注射针。我们采用 Flaming-Brown 微电极拉制仪（型号 P-97），设置参数如下：P=500，Heat=300，Pull=150，Vel=100，Time=150。
  2. 在已去除培养基腔室的单孔腔载玻片上，将 5 μl 的 MEM/PVP+M 液滴尽可能靠近 0.5 μl 所需注射材料（例如 siRNA、cRNA、吗啉代寡核苷酸等）放置，构成显微注射平台。用矿物油覆盖后置于显微镜载物台上（图 1）。
  3. 将注射针和持卵针插入相应持针器中，并置于 MEM/PVP+M 液滴内。打开连接至皮升注射仪和防震台的氮气罐。在用培养基填充注射针的同时，轻敲其尖端与持卵针接触以打开针尖。若开口过大，培养基会快速进出，导致细胞死亡；若开口过小，则注射针容易堵塞。
  4. 从培养箱中取出 5–10 个卵母细胞，转移至注射平台的 MEM/PVP+M 液滴中。注射前，设置皮升注射仪参数。我们使用的皮升注射仪（Harvard Apparatus 公司，型号 PLI-100）参数如下：PBal=2.5–3.5 psi，PInj=7.8 psi，PClear=10–12 psi，时间=3 s。此设置可实现每次注射 5–10 pL 的体积。
  5. 在按住 CLEAR 键的同时，将注射针移至材料液滴中进行填充，随后将其移回培养基液滴中。
  6. 使用持卵针捕获一个卵母细胞，并将注射针、卵母细胞与持卵针沿 x 轴方向对齐。
  7. 在较高倍镜下，推进注射针穿过卵母细胞，注意避免刺入细胞核。当针尖穿透质膜后，按下 INJECT 键进行注射。注射完成后，撤回注射针，释放卵母细胞并重复操作。全部卵母细胞注射完毕后，将其放回培养箱中，在 CZB+M 培养基中孵育所需时间；孵育时长取决于实验目的（例如 siRNA 和吗啉代寡核苷酸敲低：最长 24 小时；过表达：3–12 小时）。请注意，孵育时间超过 24 小时将影响减数分裂成熟进程。

3. 卵母细胞成熟

  1. 孵育后，将卵母细胞通过数滴CZB（成熟培养基）洗涤，然后转移至油下的一滴成熟培养基中，并放入培养箱。
  2. 孵育16小时，使其完全成熟至减数分裂II期的中期。

4. 倍性分析

  1. 配制含莫奈司他（monastrol，100 μM）的 CZB 溶液，并将 750 μl 加入组织培养皿的孔中，培养皿外圈需加入水。
  2. 用数滴含莫奈司他的 CZB 溶液清洗卵子，然后将其转移至组织培养皿中，放入培养箱孵育 1 小时。
  3. 将卵子转移至含有 2% 多聚甲醛的 PBS 溶液的表玻璃皿中，在室温下固定 20 分钟。随后转移至另一含有封闭液的表玻璃皿中。该样品可在 4°C 保存，直至后续处理。
  4. 将卵子转移至渗透液（PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3）的表玻璃皿中，在室温下孵育 15 分钟。然后用大量封闭液（PBS + 0.3% BSA + 0.01 Tween-20 + 0.02% NaN3）冲洗数次。
  5. 后续步骤在 96 孔板盖子上进行，置于室温、避光且湿润的环境中。将液滴（约 25 μl）置于盖子的圆形凹槽内。将卵子转移至封闭液液滴中，孵育 15 分钟。
  6. 为标记着丝粒，将卵子转移至含有 CREST 抗血清（1:40 稀释）的封闭液液滴中，孵育至少 1 小时。然后通过 3 滴封闭液清洗，每滴孵育 15 分钟。
  7. 将卵子转移至含有 Cy5 或 Alexa Fluor 594 标记的抗人 IgG 抗体（1:200 稀释）的封闭液液滴中，孵育 1 小时。重复上述清洗步骤，但在最后一次清洗时，在封闭液中加入 Sytox Green（1:5,000 稀释）以标记染色体。将样品置于 5 μl Vectashield 封片剂中。为防止卵子被压碎，于盖玻片将要覆盖的四个角处各加一小滴凡士林。盖上盖玻片后，用指甲油封边。将载玻片放入载片盒中，于 4°C 保存，直至进行共聚焦显微镜观察。
  8. 使用 100X 物镜成像时，在 Z 轴方向以 0.4 μm 步长采集图像，覆盖整个中期纺锤体区域。使用 Image J（NIH）等图像分析软件对着丝粒进行计数。

5. 代表性结果：

图2为一个整倍体卵母细胞的Z轴投影。在MII期中期，整倍体小鼠卵母细胞包含20对染色体，因此具有40个着丝粒。尽管使用了monastrol处理，偶尔仍会出现染色体未能充分分散的情况。这种情况使得着丝粒计数难以准确，因此我们不将此类卵母细胞纳入分析。偶尔可能难以判断CREST免疫反应性“斑点”是1个还是2个着丝粒。使用Image J等软件进行分析非常有帮助，因为可以逐层观察每个Z轴切片，同时仔细记录染色体的方向、某一“斑点”出现的切片层数以及“斑点”的像素强度。根据减数分裂纺锤体相对于极体的位置不同，DNA区域可能发生重叠，此类样本不应纳入分析。

未处理的 体内 来自生殖年龄较轻小鼠的排卵卵母细胞非整倍体率较低（˜1-2%）。然而，由于尚不明确的原因，显微注射及 体外 成熟化处理可使该比率提高10%以上。因此，在任何显微注射研究中，必须包含对照组注射的卵母细胞。

用于胚胎研究的微注射装置，显示注射针、持卵毛细管和注射材料。
图1. 微注射培养皿装置。在载玻片上，将5 μl MEM/PVP + M液滴置于0.5 μl注射溶液液滴的正上方。用矿物油覆盖。本示例中设有3个不同注射溶液的液滴，载玻片放置在显微镜载物台上。左侧为微注射针，右侧为持卵毛细管。注意可见针夹的反光。

染色体图谱、荧光显微镜图像、遗传标记、用于分析的标记染色体
图2. 倍性检测结果。一个整倍体中期II卵母细胞的Z轴投影图像。DNA呈绿色，动粒呈红色。箭头指向两条不同的染色单体臂，表明动粒（#17和#18）存在重叠。正常整倍体小鼠卵母细胞含有20对动粒（共40个“信号点”）。非整倍体卵母细胞的信号点数目则为此数目的任意变异。若该实验在中期I卵母细胞上进行，则应观察到40对动粒（共80个“信号点”）。

细胞培养用化学试剂浓度表；包含Eagle盐类、丙酮酸、庆大霉素、HEPES。
表 1. 收集与显微注射培养基（MEM/PVP + M）配方。所有试剂均为胚胎培养级，购自Sigma-Aldrich。使用0.22μm PVDF滤器（我们使用Millipore Stericups）过滤除菌，并于4°C保存。

细胞培养基配制用化学试剂浓度表；包含 NaCl、KCl 和 BSA 的数值。
表 2. CZB 培养基配方。所有试剂均为胚胎培养级，购自 Sigma-Aldrich。使用 0.22 μm PVDF 滤器（我们使用 Millipore Stericups）过滤除菌，并于 4°C 保存。

讨论

卵母细胞显微注射是一种研究调控减数分裂成熟机制的有力方法10,11,12,13。该方法可在投入大量资源构建转基因或基因靶向小鼠模型之前，以较低成本验证科学假设。相较于常规的细胞生物学实验操作，卵母细胞的收集与显微注射技术需要更长时间才能熟练掌握。在收集过程中常遇到的具体困难包括：控制口吸管的操作、拉制合适尺寸的玻璃毛细管用于收集、去除体细胞以及提高收集速度，以尽量缩短卵母细胞在培养箱外暴露的时间。我们建议在正式开展实验前进行多次练习。在微滴之间转移卵母细胞并保持细胞数量不变，是熟悉和掌握该技术的有效训练方式。

在学习显微注射的过程中，细胞死亡是常见现象。这可能由多种原因造成，例如注入的液体体积过大（即注射针开口过大）、注射针刺中细胞核、刺穿卵母细胞的对侧，或所注射的物质对卵母细胞具有毒性。建议先通过向卵母细胞注射缓冲液进行练习，直至存活率达到至少50%，这是掌握该技术的关键。如果卵母细胞无法正常成熟，很可能是因为米尔里酮（milrinone）稀释不足。我们建议在成熟培养前，将卵母细胞在多个大滴不含米尔里酮的CZB培养液中充分清洗。

显微注射后的倍性分析是评估减数分裂成熟的多种检测方法之一。我们在实验室中使用的其他常规分析方法还包括监测卵母细胞减数分裂进程的动力学、免疫荧光分析纺锤体形成和染色体排列，以及卵子激活或 体外 受精以评估卵母细胞操作对发育的影响 14,15, 16, 17.

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作在 Richard M. Schultz 的实验室中完成。作者还要感谢 Michael Lampson 提出着丝粒计数实验的设计思路并提供共聚焦显微镜的使用权限。Teresa Chiang 和 Francesca Duncan 在优化着丝粒计数实验方面提供了帮助。Paula Stein 的研究由 HD022681（资助对象：RMS）支持，Karen Schindler 的研究由 HD055822 支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
特定试剂列表：
MilrinoneSigma-AldrichM4659用DMSO重悬至2.5 mM
矿物油Sigma-AldrichM5310仅使用经胚胎测试、无菌过滤的矿物油
CREST自体血清ImmunovisionHCT-0100
Sytox GreenInvitrogen57020
Anti-human Alexa 594InvitrogenA-11014
VectashieldVector LaboratoriesH-100
多聚甲醛Polysciences, Inc.577773
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA3294
PMSGCalbiochem367222
MonastrolSigma-AldrichM8515用DMSO重悬至100 mM
Tween-20Sigma-Aldrich274348
TritonX-100Sigma-AldrichX-100
特定仪器列表：
吹管BiodisenoMP-001-Y
表面皿Electron Microscopy Sciences70543-30
注射器BD Biosciences3096231 ml，27G1/2
60 mm 培养皿Falcon BD351007
玻璃巴斯德移液管Fisher Scientific13-678-200
侧向加热器Fisher Scientific任意标准型号
解剖显微镜任意标准型号
腔室载玻片Nalge Nunc international177372
毛细玻璃管Drummond Scientific1-000-0500microcaps
移液管拉制仪Flaming-Brown micropipette puller型号 P-97
倒置显微镜Nikon Instruments任意标准型号
显微操作仪Eppendorf任意标准型号
皮升注射仪Harvard ApparatusModel PLI-100任意标准型号
CO2气瓶用于培养箱
N2气瓶用于操作台和注射仪
防震台Technical Manufacturing Corp.任意标准型号
培养箱任意标准型号
固定移液管Eppendorf930001015Vacutip
共聚焦显微镜Leica Microsystems任意标准型号
解剖工具Fine Science Tools任意标准型号
湿化室我们使用密封盒（Tupperware）
96孔板盖Nalge Nunc international263339
显微镜载玻片Fisher Scientific12-544-3
盖玻片Thomas Scientific6663-F10厚度因显微镜型号而异
中心井器官培养皿Fisher Scientific35303760 × 15 mm

参考文献

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