溶瘤病毒在癌症治疗中具有广阔前景。该治疗方法的独特优势在于，能够在治疗前确定从患者体内获取的活体组织标本是否可被病毒感染。本实验方案详细描述了如何对组织进行处理，以实现溶瘤病毒的离体（ex vivo）感染，并进行后续的病毒定量分析。
本文内容
摘要
摘要
溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）是一类新型治疗剂，可选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞1目前正在开展多项临床试验，评估包括单纯疱疹病毒（HSV）、呼肠孤病毒和痘苗病毒在内的多种溶瘤病毒平台作为癌症治疗手段的有效性。2-5溶瘤病毒的一个关键特性是可对其进行遗传改造，使其表达报告基因，从而可通过显微镜或生物发光成像技术直观观察病毒对组织的感染情况。6,7这提供了一个独特的优势，因为可以感染来自患者的组织 离体 在治疗前评估溶瘤病毒治疗成功的可能性8为此，必须对组织进行适当取样，以弥补组织异质性，并评估组织活性，尤其是在感染前阶段。9同时，若溶瘤病毒载体表达报告基因，应使用报告基因进行病毒复制追踪；此外，还需在组织匀浆后通过直接滴定法测定病毒滴度，以区分流产性感染与 productive 感染。本实验方案旨在解决上述问题，具体包括：1. 肿瘤组织的取样与细胞培养前处理；2. 利用代谢染料刃天青（alamar blue）评估组织活性；3. 离体 用表达GFP或萤火虫荧光素酶的痘苗病毒感染培养的组织。通过荧光显微镜或使用荧光素酶检测试剂检测外源基因的表达。 体内 成像系统（IVIS）5. 通过空斑测定法对病毒进行定量。该综合方法具有多项优势，包括组织处理简便、可校正组织异质性、控制组织活性，以及能够区分流产性感染与 确凿的 病毒复制
方案
1. 组织处理
- 为获得最佳结果，应在手术后立即使用新鲜分离的组织进行本方案操作，并将组织置于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素溶液和0.1%两性霉素B溶液的DMEM培养基中。若无法立即处理，可在4°C条件下将组织在此培养基中保存过夜。
- 在处理样本前，将金属镊子和一次性刀片浸入70%乙醇溶液中至少5分钟以进行灭菌。同时准备一个24孔板，每孔加入2 ml含有10% FBS、1%青霉素/链霉素溶液和0.1%两性霉素B的DMEM培养基。
- 在超净细胞培养操作台中，使用灭菌镊子取出组织样本，并将其放入一个空的15 cm培养皿中，将皿盖放置在一旁，确保无菌面朝上。
- 在细胞培养操作台中，使用2 mm活检打孔器从组织的不同区域获取多个组织芯，如图1所示。借助镊子将组织芯放置于15 cm培养皿的皿盖上，各组织芯之间应留出足够空间，以便后续沿水平轴方向进行切割。
- 使用灭菌剃须刀片将每个组织芯均等地分割为四等份，如图1所示。
- 使用移液器吸头，将来自同一组织芯的四个部分分别放入A1至A4的不同孔中（如图1所示），每孔预先加入1.5 ml含有10% FBS、1%青霉素/链霉素溶液和0.1%两性霉素B的DMEM培养基。对每个组织芯重复此操作。该方法可实现对肿瘤组织的代表性取样，同时尽量减少特定孔/条件下的偏差。为获得更佳代表性，可增加组织芯的数量。
2. 组织活力的评估
- 组织处理后，向 A1 和 A2 孔中各加入 25 μl Alamar blue（如图 1 所示），并在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 摄氏度孵育 1 小时。
- Alamar blue 孵育完成后，从每个 A1 和 A2 孔中分别移取 3 次、每次 100 μl 溶液，转移至 96 孔板中的 6 个不同孔中。使用荧光酶标仪（激发波长 530，发射波长 590）读取信号，并将数据保存以备记录。
- Alamar blue 信号读取后，使用移液枪头将 A1 孔中的所有组织块转移至含有 DMEM、10% FBS + PS + AmphoB 的 C1 孔中。注意避免从 A1 孔转移过多培养基。
- 分别向 A3 和 A4 孔中加入用 25 μl 培养基稀释的 106 PFU 表达 GFP 和表达荧光素酶的痘苗病毒。A2 孔可感染表达任意给定转基因（包括无任何转基因）的病毒。
- 72 小时后，向 C1 和 D1 孔中各加入 25 μl Alamar blue，并重复步骤 2.2。
3. 通过荧光显微镜观察GFP转基因表达
- 移除覆盖组织块的所有细胞培养基，以获得清晰的荧光图像。
- 使用具备荧光功能的解剖显微镜，首先在适当分辨率下拍摄相差图像。
- 切换至荧光模式，并使用合适的滤光片拍摄图像，以观察目标转基因信号（本例中为GFP）。
- 使用与目标转基因信号波长尽可能不同的另一荧光滤光片（如RFP），拍摄背景荧光图像。
4. 利用 luciferase 表达的可视化检测 体内 成像系统（IVIS）
- 开始前请确保IVIS已初始化。
- 在A4和B4孔中各加入5 μl浓度为10 mg/ml的荧光素底物，充分混匀，并在室温下孵育5分钟。
- 将IVIS曝光时间设为5秒，拍摄孔板图像。若图像过饱和，则使用更短的曝光时间重复拍摄；若无信号，则延长曝光时间。
- 使用IVIS成像软件，可通过B4孔的信号扣除背景，并选择感兴趣区域以定量分析发光信号。
5. 通过空斑实验评估病毒滴度
- 在定量病毒滴度之前，必须先将组织匀浆以释放病毒颗粒。如果感染的组织样本储存在 -80 °C，此步骤可在数月后进行。
- 使用分析天平称量需要匀浆的样本。本例中，我们将使用从 A2 孔收集的样本。
- 将组织放入一个 5 ml 聚苯乙烯圆底 Falcon 管中，并加入 1 ml PBS。使用组织匀浆器对组织进行匀浆。如有需要，可将匀浆液在 -80 °C 保存，以便日后检测病毒滴度。
- 为测定痘苗病毒滴度，首先在 6 孔板中接种 100 万个 U2OS 细胞，并在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中过夜培养，使其在次日达到约 95% 的汇合度。
- 使用无血清培养基对病毒进行系列稀释，确保每次稀释步骤之间更换枪头。通常我们进行 10 倍梯度稀释，用 100 μl 病毒液加入 900 μl 培养基中。稀释的步数取决于预期的病毒产量。
- 完成稀释后，吸去覆盖在接种好的 U2OS 细胞上的培养基，然后向每孔加入 500 μl 对应稀释度的病毒液以感染 U2OS 细胞。将细胞在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 1 小时。
- 在此期间，将含 20% FBS 的 2 倍浓缩 DMEM 和 3% 羧甲基纤维素（CMC）溶液置于 37 °C 水浴中预热。
- 1 小时孵育结束后，吸去覆盖在感染 U2OS 细胞上的培养基。将 3% CMC 与 2X DMEM（含 20% FBS）按 1:1 体积比混合，每孔加入 2 ml 该混合液覆盖感染的 U2OS 细胞。
- 将细胞放回 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中继续培养 48 小时。
- 48 小时后，向每孔的 CMC 覆盖层上加入 2 ml 甲醇-乙酸固定液，在细胞培养生物安全柜中室温孵育 10 分钟。
- 弃去固定液覆盖层，并用自来水冲洗各孔残留物。
- 每孔加入 2 ml 考马斯亮蓝染色液对固定的 U2OS 细胞进行染色，在平板摇床上室温低速孵育 30 分钟。
- 从各孔中移除考马斯亮蓝染色液，并用自来水清洗平板。开盖晾干约 1 小时。
- 最终形成的病毒蚀斑可在图 2C 中清晰观察到。此阶段的平板可长期保存。
- 在可观察到 10 至 100 个蚀斑的稀释梯度下计数蚀斑数量。
- 将计数的蚀斑数乘以对应的稀释倍数，再乘以 2，得到以 PFU/ml 为单位的病毒滴度。例如，若在使用百万倍稀释的孔中计数到 25 个蚀斑，则原始未稀释样本的滴度为 25 × 1,000,000 × 2 = 50,000,000 PFU/ml。进一步将该数值除以样本初始称重质量，即可报告为 PFU/g。
6. 典型结果：
为了准确判断手术获取的正常/肿瘤组织样本是否可被病毒感染，首先必须确保该组织样本至少具有活性。图1A显示，可通过代谢染料（Alamar blue）评估组织活性，且正常组织和肿瘤组织在至少72小时内均可保持代谢活性。这表明体外培养的组织能够支持病毒复制。溶瘤病毒的一个显著优势在于其可被改造以表达治疗性或成像用的报告基因。图2D-E显示，在体外感染的组织中可检测到GFP或荧光素酶的表达，进一步证明这些组织不仅具有活性，而且可被感染。尽管报告基因表达水平的升高通常与病毒复制相关，但这并不一定等同于能够实现自我扩增和扩散的完整病毒生命周期，而后者被认为对治疗效果至关重要。因此，有必要确定组织中产生的病毒量是否多于初始接种的病毒量。图2B显示，通过噬斑实验进行病毒定量后发现，感染72小时后获得的病毒量高于感染后立即采集组织时的病毒量。总体而言，这些数据表明，手术切除的肿瘤组织在细胞培养条件下至少可维持72小时的活性，在此期间能够支持病毒复制。
图1. 组织取样/切片方案概览。 组织样本通过获取多个2 mm的组织芯进行处理，随后将每个组织芯均分为四等份，并随机分配至A1-A4孔中。颜色编码表示各孔所用的试剂。孔内灰色阴影方块代表图示6个独立组织芯的每一份四分之一组织。在初始Alamar Blue读数后，A1孔中的组织被转移至含培养基的新孔（C1）中。在病毒感染后72小时孵育结束时进行第二次读数。感染后72小时孵育结束时，向A4和B4孔中补充荧光素（Luciferin）
图 2. 患者组织样本的存活力与感染性。A) 通过刃天青（alamar blue）信号在采集后 2 小时和 72 小时时测定的组织存活力。Y 轴表示经空白校正后的刃天青信号。 B) 感染后 2 小时和 72 小时时每克组织样本收集到的痘苗病毒滴度。 C) 经考马斯亮蓝染色后，在 U2OS 细胞上形成的痘苗病毒空斑示例。 D) 使用 IVIS 成像系统对感染 VV-luciferase 的患者组织进行成像所获得的生物发光信号。 E) 感染 VV-GFP 的患者组织样本的荧光显微镜图像。
讨论
本方案中的一个关键步骤是获取新鲜的组织样本。如果样本在手术室长时间滞留后才放入细胞培养，且保存于不合适的培养基（例如 PBS）中，可能会损害组织的活性，从而影响其感染能力。值得注意的是，正常组织本身比肿瘤组织更容易受到这些因素的影响。另一个关键点是用于取样的组织芯数量及其尺寸的一致性。尺寸不一致将导致不同患者样本之间的差异，因为组织缺氧程度和可感染表面积等因素会随组织芯及其四分之一小块的大小而波动。尽管使用组织切片器可在一定程度上解决这一问题，但本文所介绍方法的一个优势在于操作相对简便、污染风险较低，并且广泛适用于多种类型的组织，包括那些难以进行切片的柔软或黏稠组织。值得注意的是，可通过增加组织芯的数量以获得更具代表性的组织样本。此外，还可将组织芯切割成更多小段（例如 5–8 段），以便同时开展其他潜在检测，如 DNA、RNA 或蛋白质提取。然而，组织芯可被切割成可重复尺寸小块的数量取决于组织芯的实际大小，而后者可通过使用不同规格的打孔器进行调整。作为可选步骤，可在进一步分割前使用直尺统一组织芯的长度，有助于获得尺寸一致的组织片段。本方案可自然地进行调整以适应其他病毒，我们发现组织在培养中可保持活性并支持病毒复制长达 6 天。该方案还可进一步拓展用于检测其他病毒表达的报告基因，包括细胞因子。感染后的组织还可包埋于石蜡中，进行后续切片及免疫组织化学染色，从而进一步分析组织病理学特征及其与病毒感染的关系10-12。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Hesham Abdelbary 博士为图 2 中所示数据提供了人类手术标本。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高糖DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| 胎牛血清 | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| 两性霉素B溶液 | Sigma-Aldrich | A2942 | 使用浓度为0.1% |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | 使用浓度为1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-荧光素钾盐 | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | 用PBS重悬至10 mg/mL，并通过0.22 μm滤膜过滤 |
| MEM粉末 | GIBCO, by Life Technologies | #41500018 | 按建议体积的一半配制以得到2X MEM，使用前经0.22 μm滤膜过滤 |
| 羧甲基纤维素钠（CMC） | Sigma-Aldrich | C9481 | 用去离子水配制成3%溶液并进行高压灭菌。注意粉末可能需要较长时间才能完全溶解 |
| 考马斯亮蓝R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| 2 mm活检打孔器 | Miltex Inc. | MX-33-31 | |
| 双刃切片刀片 | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| 荧光解剖显微镜 | Leica Microsystems | 型号 M205 FA | |
| 体内成像系统（IVIS） | Caliper Life Sciences | IVIS® 200系列 | |
| Tissue Tearor组织匀浆器 | Biospec Products | 型号 985370-395 |
参考文献
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