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条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

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DOI：

10.3791/2864

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2011年8月11日

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1Banting and Best Department of Medical Research and Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Donnelly Sequencing Centre, University of Toronto, 4Genetics and Molecular Biology Branch, National Human Genome Research Institute, NIH, 5Stanford Genome Technology Center, Stanford School of Medicine, Stanford University , 6Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。

摘要

得益于新一代测序技术的进步，我们几乎每天都能获得新的基因组序列。这一进展的速度正在加快，预示着更深入、更广泛的应用前景。面对如此迅猛的发展，快速、并行地定义基因功能的方法变得愈发重要。酵母和大肠杆菌（E. coli）的全基因组缺失突变体文库已被广泛用作基因功能表征的重要工具，但该方法难以扩展：目前的基因删除策略要求对基因组中成千上万个基因逐一进行敲除并验证，只有完成这一繁重工作后，才能开展高通量的表型分析。在过去十年中，本实验室优化了一系列可并行操作的、小型化、高通量的全基因组筛选方法。这种并行化得以实现的关键在于将DNA“标签”或“条形码”引入每个突变体中，条形码可作为突变的替代标记，通过检测条形码的丰度即可评估突变体的适应性。在本研究中，我们旨在填补DNA序列信息与条形码标记的突变体文库之间的空白。为此，我们提出了一种转座子破坏与条形码标记相结合的新方法，使新测序但尚未充分表征的微生物也能适用于并行条形码筛选。为展示该方法的应用，我们构建了一个新的白色念珠菌（Candida albicans）条形码标记的破坏突变文库，并描述了如何利用基于微阵列和基于新一代测序的平台，在单次实验中检测10,000至1,000,000个基因-基因及药物-基因相互作用。

方案

1. 背景信息

有多种方法可以构建携带条形码标签的突变体。目前的金标准是由多个实验室组成的联合团队创建的酵母基因敲除（YKO）文库，该文库于2002年完成。 1自最初的酵母基因敲除文库问世以来，研究人员已构建了其他酵母文库；这些文库基于不同的菌株背景，采用过表达载体，并扩展至其他微生物中，例如 E. coli 2与此同时，构建条形码shRNA文库的工作正在快速推进，事实上，这些哺乳动物文库的许多设计原则借鉴自酵母。为了展示条形码转座子如何成为一种快速且广泛适用的系统性突变体文库构建策略，我们重点介绍近期在人类真菌病原体中构建的一个文库， 白色念珠菌. 我们对念珠菌的研究是基于条形码筛选技术的成功应用 S. cerevisiae，此处用作示例生物。该样本方案经少量修改后，可用于筛选任何能够在悬浮培养中生长的生物。由于极少生物具备高效转化和有效有丝分裂重组所必需的高突变率，以产生完全缺失突变体，因此我们开发了一种利用转座子诱变的方案 体外 对基因组DNA文库进行诱变，然后将这些带有条形码的基因组片段转化入 白色念珠菌 3, 4. 受原始YKO文库在基因网络本质基础研究中取得成功及其重要作用的启发 5-8，全基因组范围的单倍剂量不足 9药物靶点与作用机制 10,11以及基因组中所有基因的必需性 12 我们预计，将这一方法拓展至其他微生物将取得极为丰硕的成果。

以下方案假设所需突变体文库已经构建完成（例如YKO或Candida albicans基因敲除文库），并以单独保存的菌株形式提供。有关菌株构建的详细描述，请参见1,13,14。

2. 将单个突变体合并为一个混合池

  1. 留出一周时间制备混合细胞分装样本（可在 -80°C).
  2. 完全解冻目标菌株的冻存甘油菌液，但不要让细胞长时间处于解冻状态 >2小时
  3. 对96孔针工具进行灭菌，将针工具浸入水中以去除残留细胞，随后在70%乙醇浴（例如移液器吸头盒盖）中浸入2次，灼烧针工具并在空气中冷却1分钟。灼烧时应注意远离乙醇浴。乙醇液面应高于水浴液面，以确保所有残留细胞均被灼烧去除。每4-6次点样后更换一次水。
  4. 将无菌的96孔针工具插入已解冻的96孔板中，轻轻混匀后转移细胞至含有YPD琼脂及相应抗生素的Nunc Omni Tray中。培养菌落直至其生长至最大尺寸 30°C (2-3天)。为了节约培养板，我们发现将四个96孔板合并到一个含有约384个菌株的Omni-tray上最为有效。
  5. 菌落生长后，记录任何缺失或生长缓慢的菌株，并以约为其他菌株细胞量2倍的接种量重新点种这些菌株。
  6. 在微生物学环境中操作（使用火焰和无菌实验器具），用5-10 ml培养基浸没平板，静置5分钟，用细胞涂布器重悬菌落。将液体与细胞转移至50 ml锥形离心管中，加入甘油至终浓度15%或二甲基亚砜（DMSO）至终浓度7%（体积/体积）。
  7. 测量 OD600 池中样品的浓度，并通过稀释或离心调整至最终浓度为50 OD600/ml，加入含15%甘油或7% DMSO的培养基。
  8. 分装于 40 μl PCR条状管中的体积，并在-80°C.

3. 实验池生长

该步骤如图1所示。

  1. 将PCR管中的冻存样本分装在冰上解冻。若不使用自动化设备，跳至第5步。
  2. 立即（轻柔地！）将菌液稀释至含有所选药物或处理条件的培养基中，并按指定OD值接种600 0.0625，总体积为 700 μl 在48孔板中进行实验。每个板上至少设置一个合适的溶剂对照。对于超过5代生长（即超过1个孔）的实验，在相邻孔中加入所选培养基或处理条件，但不接种细胞。
  3. 用塑料板密封膜封口；若条件需要有氧生长（例如使用非发酵性碳源），则使用21号针头在每孔膜密封膜的侧边刺孔。
  4. 在分光光度计中振荡培养 30°C 采用实验确定的振荡程序（例如，在最高转速下振荡14分钟（或使用温度控制振荡器），读取各孔数据，继续振荡）。可在用户自定义的世代时间点（通常为生长5、10、15和20代时），由机器人采集部分细胞悬液，并保存在机器人平台的低温板上。（http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html，详情请联系 C. Nislow 或 G. Giaever）。
  5. 用于手动细胞培养时，以起始OD接种50 ml培养液600 0.002，置于250 ml培养瓶中。振荡培养 30°C 250 rpm 下振荡培养，直至细胞达到最终 OD600 2.0（对于 酿酒酵母 或 假丝酵母）进行约10代的培养。通过在新鲜培养瓶中将细胞在OD600为2.0时稀释至0.02，可获得更多的培养代数。
  6. 至少收获 ˜2 OD600 每个样本/时间点的细胞单位放入安全锁微型离心管中。

注意：在新构建的菌株混合池中，始终需收集起始细胞样本（即“T0 时间点”），以评估初始菌株的代表性。具体操作为：从冻存的分装样品中直接取 1-2 OD600 的菌液加入 1.5 ml 离心管中，并按以下所述方法进行处理。

4. 基因组DNA提取、PCR及微阵列杂交或测序

  1. 使用 Zymo Research YeaStar 试剂盒，根据制造商说明书从约 ˜2 OD600 的细胞中纯化基因组 DNA（若使用酵母 DNA，则采用方案 I），或采用针对目标生物的其他合适方法（标准的酚/氯仿抽提法结合乙醇沉淀适用于多种微生物）。若使用 YeaStar 试剂盒，应使用 300 μL 的 0.1X TE 缓冲液洗脱 DNA，而非说明书指定的 60 μL 1X TE。基因组 DNA 可在 -80°C 长期保存。
  2. 为每个样本设置两个 PCR 反应，分别用于扩增 uptag 和 downtag，反应体系如下：33 μl ddH2O、6 μl 不含 MgCl2 的 10X PCR 缓冲液、3 μl 50 mM MgCl2、1.2 μl 10 mM dNTPs、1.2 μl 50 μM Up 或 Down 引物混合物、0.6 μl 5 U/μl Taq 聚合酶、15 μl 中含约 0.1 μg 基因组 DNA，总体积为 60 μl。热循环条件如下：94°C 3 分钟，30 个循环（94°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 30 秒），然后 72°C 延伸 3 分钟，最后在 4°C 保温。通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物；用于杂交的扩增子预期大小为 60 bp，用于条形码测序的扩增子为 130 bp。PCR 产物可在 -80°C 长期保存。
  3. 将杂交炉预热至 42°C，并准备一个沸水浴及装有冰水混合物的冰桶。
  4. 通过缓慢加入 120 μl 1X 杂交缓冲液对芯片进行预润湿。
  5. 在 42°C、20 rpm 条件下，将芯片在杂交缓冲液中孵育 10 分钟。
  6. 为每个样本（另加一份额外量作为缓冲）在锁盖 0.5 ml 管中配制 90 μl 杂交混合液，组分如下：75 μl 2X 杂交缓冲液、0.5 μl B213 控制寡核苷酸（0.2 fm/μl）、12 μl 混合寡核苷酸（12.5 pm/μl）、3 μl 50X Denhardt's 溶液。
  7. 将 30 μl uptag PCR 产物和 30 μl downtag PCR 产物加入 120 μl 杂交混合液中，总体积为 150 μL。煮沸 2 分钟后置于冰水混合物中至少 2 分钟。使用前短暂离心管子。
  8. 从芯片中移除预杂交缓冲液，加入 90 μl 杂交/PCR 混合液。为防止蒸发，用 Tough-Spot 覆盖芯片垫圈。在 42°C、20 rpm 条件下杂交 16 小时。
  9. 新鲜配制每份样本（另加一份额外量）600 μl 生物素标记混合液，组分如下：180 μl 20X SSPE、12 μl 50X Denhardt's、6 μl 1% Tween 20（v/v）、1 μl 1 mg/ml 链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-phycoerythrin）、401 μl ddH2O。所有含链霉亲和素-PE 的样品需避光保存。将 600 μl 分装至 2 ml 管中。从芯片上移除 Tough-Spots。
  10. 用移液器缓慢吸除芯片中的杂交混合液，并向微阵列中加入 120 μl Wash A。启动 Affymetrix 流体工作站。
  11. 根据制造商说明书使用 Affymetrix 流体工作站进行芯片洗涤，采用 "Gene-Flex_Sv3_450" 程序并作如下修改：染色前增加一步 Wash A（1 个循环，2 次混合）；Wash B 温度设为 42°C（而非 40°C）；染色温度设为 42°C（而非 25°C）。也可手动完成杂交后洗涤、生物素染色及染色后洗涤（参见参考文献 15 第 396 页）。完成流体操作后，运行流体工作站的 "SHUTDOWN_450" 程序。
  12. 洗涤完成后，确保无气泡残留。如有必要，加入 90 μl Wash A 并缓慢吹打直至气泡消失。若芯片表面有污迹或指纹，使用异丙醇和无尘纸清洁玻璃窗口。在垫圈/隔膜上方覆盖新的 Tough-Spots，并将芯片放入扫描仪。
  13. 使用 Affymetrix GeneArray 扫描仪在 560 nm 发射波长下进行扫描。

5. 芯片分析（使用Candida albicans基因破坏文库获得的结果示例见图2）

  1. 异常值掩蔽：由于 Affymetrix TAG4 芯片在随机分布的位置上包含每个条形码互补序列的 5 个重复探针，因此任何与重复探针信号偏离的条形码探针均可被掩蔽并剔除。具体操作如下：对于每个基于其信号强度相对于该特征其余 4 个重复探针而疑似为异常值的芯片特征，我们的软件首先检查围绕该可疑异常值的 5 个特征，生成一个包含 25 个特征的矩阵，其中可疑特征位于中心。如果 >该区域中若有超过10%的探针（13/25）与其各自的修剪后重复均值（排除最高值和最低值后中间三个重复的均值）差异超过10%，则该探针将被剔除，不再参与后续分析。由于此类离群值大多源于杂交后洗涤步骤的不一致，因此我们对包含可疑探针的区域进行扩展或“填充”。填充方法为：将该探针周围5个探针半径范围内的所有探针均纳入，定义为((x1-x2)2 + (y1-y2)2)½ < 6 其中 x1，x2, y1和 y2 x 和 y 坐标分别对应两个特征。最后，剔除特征像素的标准差（Affymetrix 芯片的 .cel 文件中包含）与特征像素平均值之比过高的特征。去除异常值后，对所有剩余重复样本的信号强度值取平均。
  2. 移除不可用标签：信号强度较低的标签会产生低质量的结果，必须予以剔除。这些低强度探针的排除阈值可按如下方法计算：
    1. 对于任意处理组-对照组芯片对，计算 log2((ic- bg)/(it- bg）针对每个标签，其中 ic 是对照强度，it 是处理强度，而 bg 未分配标签探针的平均强度。
    2. 按菌株配对上游标签和下游标签的比值，对于每对标签，取两个样本中两个标签的最小强度值。根据该最小强度值对比值对进行排序。
    3. 在排序后的比值对上使用大小为50的滑动窗口，计算窗口内上游标签（uptag）和下游标签（downtag）比值对的相关性。同时计算前一步骤中得出的最小强度值的平均值。
    4. 将窗口滑动25对，并重复上一步骤，直至所有配对均被遍历。
    5. 绘制所有窗口的平均最小强度与上游标签-下游标签相关性之间的关系图。
    6. 最后，选择一个强度阈值；通常我们采用相关性首次达到其最大值80%时的强度值。标记并剔除低于该阈值的所有标签，不再纳入后续分析。
  3. 饱和度校正：由于条形码微阵列上的每个特征点都可能达到饱和，TAG4阵列上的信号与标签浓度之间并非线性关系。为校正这种饱和效应，请遵循参考文献中描述的方案 16.
  4. 芯片标准化：对每张芯片，分别对上标签（uptags）和下标签（downtags）进行标准化。进行分位数标准化时，将每张芯片获得的上标签和下标签的值按信号强度升序排列并进行排序。对每组上标签和下标签进行均值标准化时，将其值除以该组的均值。对所有芯片进行均值标准化是继将原始数据转换为各芯片均值之后的第二步。
  5. 计算对照-处理比较的敏感性评分：使用对数2 以比值作为敏感性的度量指标：针对每种菌株，计算 log2((μc- bg)/(μt- bg），其中 μc 对照样品的平均强度， μt 是处理样本的平均强度，而 bg 为未分配探针的平均强度。具有正对数的菌株2 比值对处理敏感，而具有抗性的则呈现负对数2 比率。

6. 通过测序评估条形码酵母菌株的适合度

  1. 按照微阵列实验所述方法，从缺失型文库中提取 DNA。
  2. 使用复合引物扩增每个 20-mer 的上游标签条形码，该复合引物由通用条形码引物序列和用于与 Illumina 流通池杂交所需的序列组成（参见 Illumina 引物列表及图 3 中扩增子结构示意图）。这些引物可直接使用脱盐级产品，无需进一步纯化。PCR 反应在 100μL 体系中进行，使用 Invitrogen Platinum PCR Supermix（货号：11306-016），反应条件如下：95°C 预变性 3 分钟；94°C 变性 30 秒、55°C 退火 30 秒、68°C 延伸 30 秒，共 25 个循环；最后 68°C 延伸 10 分钟。
  3. 使用 Qiagen MinElute 96 UF PCR 纯化试剂盒（货号：28051）纯化 PCR 产物（约 130 bp）。
  4. PCR 纯化后，使用 Invitrogen Quant-iT dsDNA BR 定量试剂盒（货号：Q32853）对 DNA 进行定量。切勿依赖 260/280 吸光度比值！
  5. 将 DNA 浓度归一化至 10 μg/mL，并等体积混合归一化后的 DNA 样品。
  6. 根据所用电压，将混合 DNA 在 12% TBE 聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离 3–4 小时。
  7. 用溴化乙锭染色凝胶（Sybr Green 也可使用），染色 30 分钟。
  8. 在长波紫外灯下（佩戴适当面部防护）观察目标条带，切下条带，并采用“压碎浸泡法”17 提取 DNA，随后进行乙醇沉淀。
  9. 使用 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 检测试剂盒（货号：5067-4626）确认已分离出正确大小的 DNA（130 bp），并验证引物已去除。
  10. 测序样品制备：
    1. Illumina GAIIx 平台：
      1. 使用 cBOT 及单端测序簇生成试剂盒（货号：GD-300-1001）在单端流通池上生成簇。将上游标签和下游标签修饰的测序引物等量混合，配制成 100 μM 储存液，取 0.6 μL 每种引物加入 120 μL HT1 缓冲液的排管中。使用配方 SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 进行 Read 1 簇的生成。
      2. 在 Genome Analyzer IIx 上进行测序。完成前 18 个测序循环后，使用配对末端模块剥离已合成的第一链，并利用 Illumina R1 试剂重新杂交流通池。重新生成簇后进行 5 个循环测序，以捕获索引标签。
  11. 利用索引标签序列将测序结果分入不同的实验分组。
  12. 在每个实验分组内，统计酵母条形码序列的数量，获得每个条形码的总读数。
  13. 对读数进行分位数归一化，使各实验具有相同的读数分布。参照条形码微阵列适配度实验的方法，计算每个菌株的适配度缺陷比值，并以 log2（对照/处理）比值表示。正值的适配度缺陷评分表明该菌株在药物处理过程中丰度下降，提示该菌株中被敲除基因的野生型形式对抵抗该药物或抑制剂具有必要性。

注：考虑使用Bar-seq作为芯片杂交的替代方法。随着高通量测序成本的降低，利用高通量测序直接检测标签丰度正变得可行，并且在许多情况下更具成本效益18。通过该方法，扩增的PCR产物被直接以“读数”形式定量，而非通过杂交至芯片后检测信号强度。这消除了因标签交叉污染、信号饱和或极高或极低信号强度所导致的假阳性与假阴性结果。此外，通过添加一段4–8个碱基的DNA索引序列，可在测序前将多个实验样本合并处理19。由于酵母条形码长度为20 bp，仅需一次26–28个碱基的双步测序读长，即可同时获取多重索引和唯一性条形码，从而实现超过100重的极高通量多重检测。在撰写本文时，Bar-seq相比条形码微阵列具有成本优势，且Bar-seq本身具备高度灵活性：随着每轮运行的读长数量增加，多重检测水平也可相应提高，从而进一步降低成本。来自所有主要测序平台厂商的若干“中通量”测序仪将进一步推动Bar-seq的普及，测序有望成为首选的检测手段。

该方案也已在Illumina HiSeq2000上验证。

最近，Gresham 等20 的一项研究出色地展示了如何利用Bar-seq来解决酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生长调控中的一个基本生物学问题，并概述了若干重要的实验设计与解释原则。

7. 池化筛选数据的验证

任何功能基因组学筛选的结果都应通过在独立培养中使用单个菌株进行验证。由于每个实验在敏感菌株数量上可能不同，因此选择需要验证的候选菌株数量具有一定的任意性。作为参考，可根据 log2 比值或 z 分数对最敏感的菌株进行排序，并对排名前 25–50% 的候选菌株进行验证（通常相当于池中所有菌株均值的 2–3 个标准差），这在成本与效益之间达到了良好的平衡。验证实验可在任意容器中进行，但我们通常在 96 孔板中进行，使用 100 μl 培养基，初始接种量为 0.06 OD600，在摇床分光光度计中培养 5 代，每 15 分钟测量一次（见图 4）。

8. 代表性结果

基因组范围筛选完成后，需对芯片数据进行标准化处理，并将每种菌株在处理组与对照组之间的表型进行比较（例如通过比较微阵列信号强度或测序读数/菌株）。随后，可将数据导入 Excel 文件进行操作，其中基因按对照组/实验组的 log2 比值进行排序。在此类排序中，log2 比值越负，表明该菌株对测试条件越敏感。这些 Excel 文件可使用多种绘图软件进行可视化。我们发现最简便的方式是以 log2 比值作为 Y 轴，以基因或开放阅读框（ORF）名称作为 X 轴进行作图。如图 2a 所示，展示了经克霉唑（一种已知的抗真菌药物）处理后的结果图。所有在 log2 比值为 -2 时显著敏感的菌株以红色标出；通常我们会通过个体生长实验进一步验证这些菌株，检测各突变体在相同药物浓度下的生长情况。在此示例中，共标出 4 个菌株：NCP1、ERG2 以及两个独立的 ERG11 等位基因，后者是克霉唑已知的作用靶蛋白。这 4 个基因均直接参与麦角固醇生物合成途径，该途径在酵母中相当于胆固醇合成。例如，NCP1 编码一种 NADP-细胞色素 P450 还原酶，参与麦角固醇的生物合成，并与 Erg11 相互关联且协同调控。此实例说明，通过这种无偏筛选方法不仅能够识别出已知的药物靶点（Erg11），还能发现靶通路中的其他关键组分。最后，图中以红色标出的若干基因可能参与麦角固醇的生物合成，或涉及其他不同的生物学过程。如前所述，任何在混合筛选中被检测为敏感的菌株，都应通过个体生长实验进一步验证其敏感性。在图 2b 所示的示例中，基于其相较于野生型亲本菌株 BWP17 的生长抑制情况，确认了四个菌株对克霉唑敏感。这些个体生长曲线揭示了此类混合基因-药物筛选的一个重要特征：即某一菌株的绝对排序并不一定准确反映其真实的敏感程度。此外，图 2b 还体现了为每个基因设置多个等位基因的价值；在此例中，两个 erg11 敲除突变体表现出略有差异的敏感性。将这些突变的性质与敏感程度相关联，可为进一步理解药物的作用机制提供额外线索。

酵母发酵示意图；DNA纯化、PCR扩增、条形码测序流程。
图1. 混合培养实验与条形码检测的工作流程。将解冻的混合细胞等分试样接种至培养物中（步骤1），随后在机器人操作（选项A）或手动操作（选项B）条件下培养至所需增殖代数（步骤2）。通过离心收集细胞（步骤3），从收集的细胞中提取基因组DNA（步骤4），分别扩增上游标签（uptags）和下游标签（downtags）（步骤5），然后杂交至芯片（步骤6a）或直接进行测序（步骤6b）。

基因表达分析；使用克霉唑处理后的Log2比值散点图及生长曲线。
图 2. 在实验方案的某些时间点采集的示例数据。（A）筛选结果的示例数据（改编自13）。在含有克霉唑或DMSO（对照）的条件下，将带标签的突变体文库培养20代。计算Log2比值（对照强度/处理强度）并以基因为横坐标作图。高度敏感的菌株（红色）包括克霉唑的已知靶点ERG11p。需要注意的是，该检测通常除了化合物的实际靶点外，还会发现其他敏感突变体。这些突变体通常为与靶点存在合成致死效应的突变体、参与普遍应激/处理反应通路的突变体，或为验证失败的假阳性结果。（B）验证实验的示例数据（改编自13）。可通过单独培养菌株并将其生长情况与野生型（黑色）进行比较，以验证混合培养实验的结果。

基因编辑示意图，Illumina接头，通用引物，DNA区域分析，测序方法。
图3. 从条形码混合检测中扩增出的扩增子结构，用于微阵列杂交或条形码测序。文库中每个突变体所产生的扩增子包含用于基因组整合的同源序列（蓝色区域，标记为ATG和TAA）、独特的条形码（标记为AG，以黑色短横线表示）。对于微阵列杂交，使用蓝色的通用引物扩增出一段60 bp的探针用于微阵列杂交。对于条形码测序，在PCR反应中使用延伸引物，上游引物由编码Illumina接头的序列（红色条带）、6个碱基的索引（交叉条纹）和蓝色通用引物组成，下游引物则使用相同的复合引物（不含6碱基索引）。

光密度随时间变化曲线；微生物生长曲线；统计分析；多孔板数据。
图4. 个体生长实验，用于：1）对野生型酵母进行化合物初筛，以确定全基因组筛选的合适剂量；2）验证全基因组筛选的结果。（A）在96孔平底板中加入100 μl、OD值为0.062的细胞悬液。每个孔可包含相同菌株（用于剂量确定）或不同菌株与药物组合（用于验证实验）。加入2 μl化合物（通常溶于DMSO），在30°C下持续振荡培养16–20小时。DMSO的终浓度不应超过2%。在此示例中，每孔的生长曲线以黑色表示，对照生长曲线以红色表示。（B）多个初筛结果的高分辨率图像，使用一种示例药物进行测试，并相互叠加。在此滴定系列中，紫色剂量可获得IC10-15，适用于缺失型谱型分析（HIP和HOP）。由于在较高光密度下存在非线性效应，Tecan（或任何类似酶标仪）测得的OD值必须使用“传统”1 mm光程比色皿获得的OD值进行校准。

讨论

本文概述了一种实验方案，经过适度修改后，该方案可轻松适用于多种不同微生物的条形码突变体文库，从而构建带标签的突变体文库。需要强调的是，尽管我们报道的是针对致病性酵母菌C. albicans的标签化转座子诱变方案，但非常相似的方案亦可适用于多种单细胞真菌。经修改后，该方案在细菌中同样有效13，目前多个其他真菌和细菌基因组的文库正在构建中。目前，该检测方法是唯一可用于全基因组范围、无偏倚筛选基因与小分子相互作用的综合性方法。该方法尤为突出的一个特点是无需事先了解目标基因或小分子的任何信息。尽管此类检测方法具有广泛的适用性和强大的功能，但其在其他实验室的推广应用在一定程度上受到初始资金投入以及结果分析所需生物信息学工具的限制。随着下一代测序读出技术的采用以及强大分析工具的配套使用，我们预期该方法的应用将日益广泛。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢多伦多大学 HIP HOP 实验室的 Ron Davis、Adam Deutschbauer 及全体成员提供的讨论与建议。C.N. 的研究得到了美国国家人类基因组研究中心（资助号 HG000205）、RO1 HG003317、加拿大卫生研究院（CIHR MOP-84305）以及加拿大癌症学会（#020380）的资助支持。J.O. 得到了美国国家人类基因组研究中心资助的斯坦福基因组培训项目（资助号 T32 HG00044）以及美国国立卫生研究院（资助号 P01 GH000205）的支持。GG 的研究由 NHGRI RO1 HG003317 和加拿大癌症学会（资助号 #020380）提供支持。TD 和 Donnelly 测序中心部分得到了加拿大创新基金会向 Brenda Andrews 博士和 Jack Greenblatt 博士提供的资助支持。A.M.S. 得到了多伦多大学开放奖学金的支持。

参考文献

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