用于活体成像微循环的小鼠提睾肌制备方法

摘要

本文描述了一种用于观察和实验操控活体微循环的组织制备方法。在麻醉的雄性小鼠中，将薄而高度血管化的提睾肌制备成适用于活体显微镜观察的标本，以研究包括微动脉、毛细血管和微静脉在内的微血管网络。该制备方法也可轻松适用于大鼠和仓鼠。

摘要

在整个机体中，维持稳态需要持续供应氧气和营养物质，同时清除代谢产物。这种平衡通过微循环中的血液流动来实现，微循环包括分布于所有组织和器官中的血管系统的最小分支。小动脉由动脉分出，形成调控含氧血液流向大量毛细血管的网络，这些毛细血管与实质细胞紧密接触。毛细血管为组织细胞与血液之间的扩散交换提供了巨大的表面积。小静脉收集毛细血管的流出液，并在将缺氧血液输送回心脏的过程中逐渐汇合。要实时观察这些过程，需要采用一种能够可视化并操控活体微循环的实验方法。

大鼠提睾肌最初被用作研究炎症的模型，通过死后组织学和电子显微镜技术进行观察^1,2第一 体内 暴露完整大鼠提睾肌微血管对血管活性药物反应的反射光研究报告³然而，由于肌肉的曲率以及光照不够集中，这种制备方法的实用性受到限制。主要的突破在于将肌肉打开，从睾丸上分离，并径向铺展成一片扁平的组织，以便在复式显微镜下进行透射照明观察。⁴尽管已证明是研究大鼠微循环生理学的一种有价值的方法⁵ 和仓鼠⁶小鼠的提睾肌⁷ 在解析调控微血管功能的细胞通路方面已证明尤为有用^8-11 细胞间信号传导的实时成像¹².

提睾肌源于腹内斜肌和腹横肌，当睾丸通过腹股沟管下降时形成¹³它起到支撑（希腊语：cremaster = 悬吊者）和维持睾丸温度的作用。如文中所述，提睾肌被制备成一片薄而平整的组织，以获得优异的光学分辨率。在保持小鼠体温稳定和麻醉深度恒定的条件下，手术操作包括将提睾肌从周围组织及睾丸上分离，将其展开并铺在透明的硅橡胶基座上，用昆虫针固定边缘，并持续用生理盐溶液灌流。本实验方案采用在微动脉内皮细胞中表达GCaMP2的转基因小鼠。GCaMP2是一种基因编码的荧光钙离子指示分子¹²宽场成像与增强型电荷耦合器件相机可实现 在体 小动脉内皮中钙信号传导的研究

方案

1. 小鼠固定板、肌肉支架、体位楔形垫和灌流溶液

1. 小鼠固定板：使用一块透明的矩形聚甲基丙烯酸甲酯板（6英寸宽 × 8英寸长 × 3/16英寸厚）制作，可放置在显微镜载物台上。该“小鼠固定板”用于在制备阴囊肌手术过程中固定麻醉后的小鼠。
2. 肌肉基座：根据制造商说明，将Sylgard 184混合后制备成透明硅橡胶基座。°按照说明操作。一个方便的模具是厚度为15 mm、直径为50 mm的一次性培养皿。使用剃刀刀片将Sylgard块切割成所需形状（见图1C）。使用一层透明防水硅胶粘合剂将Sylgard块固定在小鼠固定板上。实用技巧：将Sylgard倒入培养皿后，在真空箱中脱气一小时可去除气泡并提高透明度。脱气完成后，通过将培养皿置于实验室烘箱中，可缩短Sylgard的固化时间。 50 °C 数小时。
3. 体位楔形垫和加热平台：一个楔形垫（2" X 4" X 15°位于小鼠下方并与基座接触的装置使小鼠身体前倾，有助于将提睾肌从其起点处伸展至基座上方。在表面加装铝制平台可实现导热，该平台由连接至直流电源的电阻器加热（图1A）。将平台温度校准至˜40 °C 保持食管温度在 ˜37 °C否则，使用灯的辐射热。
4. 大头针。用于将提睾肌固定在基座上，大头针由0.15 mm的昆虫针弯成“L”形制成。
5. 生理盐溶液（PSS）。组织制备物持续用碳酸氢盐缓冲的PSS进行灌流（冲洗），PSS使用超纯水（18.2 MΩ）配制₂O. 储备液配制为终工作浓度的20倍，并通过0.22 μm滤膜过滤除菌 0.2 μm 过滤。储存于 4°C分别配制碳酸氢盐以外的盐溶液，并在实验当天稀释混合，可防止碳酸钙沉淀。储备盐溶液成分为（单位：mmol/L）：2638 NaCl，94 KCl，40 MgSO₄₄，23.4 CaCl₂. 碳酸氢盐储备液为360 NaHCO₃实验当天，将相应的溶液在容量瓶中定容至最终体积（通常为2 L），并置于约37°C. 用 5% CO 平衡 PSS₂ / 95% N₂ 使用气体分散器搅拌约15分钟，调节pH至约7.4以防止沉淀。PSS持续通入5% CO₂₂ / 95% N₂ 在整个实验过程中。最终工作溶液的成分（单位：mmol/L）为：132 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO₄₄，2 CaCl₂，18 NaHCO₃₃.

2. 麻醉与手术准备

1. 在获得机构动物护理与使用委员会批准后，使用至少12周龄的雄性小鼠。通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在初次注射期间，使用固定管有助于稳定小鼠。在整个手术过程和实验操作中，根据需要（每30-60分钟一次，以脚趾或尾巴受夹时无回缩反应为指标）追加初始剂量的10%-20%进行腹腔补充给药以维持麻醉状态。提示：在注射前将戊巴比妥稀释至10 mg/ml的无菌生理盐水溶液，可降低过量给药的风险。
2. 麻醉会损害体温调节功能，因此在首次注射后必须立即为小鼠保温。将小鼠置于金属载体（通风的铝制篮子）上，并放置于加热板（校准至约37 °C）上效果良好。 alternatively，也可使用加热灯，但需注意将其置于距离小鼠适当的位置。应每5-10分钟监测一次小鼠状态，直至达到合适的麻醉深度（脚趾或尾巴受夹时无回缩反应）。15-20分钟后可能需要追加一次剂量。应保持耐心并谨慎操作，避免过量麻醉，尤其对于肥胖或老龄动物更应如此。
3. 通过仔细剃除下腹部、下背部、阴囊及腿部的毛发以完成脱毛。操作时应特别注意避免对阴囊和睾丸造成创伤，否则可能损伤提睾肌。使用新的酒精棉签清除松动的毛发。
4. 若膀胱充盈，可通过腹壁触诊感知其大小如一颗小葡萄。在实验过程中为防止小鼠排尿污染提睾肌制备区域，应通过轻柔按压排空膀胱。Kimwipe纸巾是一种有效的吸液材料，可用于收集尿液。
5. 将小鼠仰卧位固定于楔形支架上，双腿跨置于基座两侧。用丝线（4-0或5-0）分别系于每只脚上，作为将小鼠下体紧贴基座的固定牵引线。在胸部上方松放一段胶带并固定于楔形支架上，以维持整体体位。手术操作过程中使用体视显微镜，配合显微剪刀和角度镊进行显微解剖。

3. 开腹肌膜的手术准备

1. 将一根针穿过阴囊囊的顶端（左侧或右侧均可），并固定在基座上，以对皮肤施加张力。在整个解剖过程中，持续用PSS（34–35 °C）灌流手术区域，以保持暴露组织的温暖和湿润。用Kimwipe制成的吸水芯，一端置于阴囊囊旁，另一端靠近真空管路，用于吸除流出的PSS。在Plexiglas板上涂布一圈硅胶密封剂，完全环绕楔形块和基座，形成一个“护城河”，以收集未被抽吸的PSS，有效防止PSS泄漏至显微镜上。
2. 沿阴囊囊腹侧表面做一切口。若提睾肌已将睾丸拉入腹腔，可轻压下腹部，使睾丸进入阴囊。此时应辨认覆盖在睾丸表面的提睾肌。小心去除阴囊皮肤与提睾肌之间的结缔组织，使提睾肌与周围组织分离。
3. 将阴囊皮肤轻轻向后拉至基座近端边缘，并在两侧用针固定。随后清除提睾肌外表面的结缔组织。解剖过程中持续灌流可使结缔组织保持水合状态，有利于观察和清除。
4. 用一根针穿过提睾肌顶端，使其处于纵向张力状态。沿肌腹侧表面做一纵向切口，操作需极为小心，以尽量减少对血管供应的破坏。这种组织损伤会改变制备区域周边的血流动力学¹⁴。因此，为尽量减少对数据采集的影响，成像和生理学研究应选择制备区域中心附近的血管。
5. 提睾肌通过一条细韧带与睾丸下方的附睾相连。将睾丸轻柔地推向一侧，即可暴露该韧带，并小心将其与附睾分离。在提睾肌顶端附近存在一条小动脉和小静脉，连接提睾肌与附睾。用镊子夹闭这些血管后将其拉断，可最大限度减少出血。在近端结扎（4-0或5-0丝线）睾丸、附睾、睾丸动脉和静脉，随后切断并弃去（睾丸切除术），连同相关的腹股沟脂肪垫一并移除。或者，也可将睾丸轻柔推回腹腔，并用一小块棉球或Kimwipe固定保留。睾丸切除术可避免将睾丸推回腹腔时对组织造成潜在损伤。我们未发现采用上述任一方法制备的提睾肌微循环质量存在明显差异（见第3.8节）^7,15。
6. 清除提睾肌外表面残留的结缔组织后，将其在基座表面呈放射状铺展。用针在5–6个位置固定边缘（见第1.4节），形成一张具有完整微循环的扁平横纹肌片。
7. 完成的组织制备物被转移至活体显微镜载物台上，持续灌流（3–5 ml/min，34 °C），并平衡30分钟。
8. 根据多个标准评估提睾肌制备物的完整性。若手术创伤极小，可观察到微动脉内血流迅速，微静脉内无白细胞黏附，提示存在自发性血管张力。判断制备物反应性的最敏感指标是：将灌流液氧含量提高5–10分钟后，微动脉出现收缩反应。此操作通过将灌流液与21% O₂平衡实现（对比5% O₂；见第1.5节；所有气体均含5% CO₂，余量为N₂）。若微动脉内出现白细胞、毛细血管内无红细胞流动，和/或微静脉及周围组织中有白细胞积聚，则提示组织损伤和炎症反应。

4. 睾提肌微循环的活体成像

1. 活体成像在基于 Olympus MVX10 立体变倍平台定制的显微镜上进行。MVX10 显微镜主体安装于配备透射照明（卤素灯）的 MVX10 混合支架上，用于明场（科勒）成像，同时配备落射照明（汞灯）用于荧光成像。使用落射照明时，GCaMP2 的激发波长为 472/30 nm，发射光收集波长为 520/35 nm。图像通过 MV PLAPO 2XC 物镜（数值孔径 = 0.50；Olympus）和连接至个人计算机的 XR/Mega-10 增强型数字相机（Stanford Photonics, Inc.；SPI），利用 Piper 控制软件（SPI）采集。在此系统下，可观测视野（FOV）可在 553 μm × 442 μm 至 22 mm × 18 mm 范围内调节。
2. 活体成像实验完成后，通过过量戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，随后进行颈椎脱位。

5. 典型结果

图1. 用于小鼠提睾肌活体成像的小鼠固定板。A) 从底部观察带有铝制平台（以黄色塑料隔热）的体部楔形块。加热电阻器固定在平台底面，通过热传导提供热量。B) 加热平台放置在一个塑料楔形块上。C) 手术时将体部楔形块置于聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）板上，之后可将此装置整体转移至活体显微镜的载物台上。红色箭头指示Sylgard基座的位置。整个标本周围涂有一圈防水硅胶，以容纳活体实验过程中可能泄漏的液体，防止其滴落到显微镜上。

图 2. 用于宽场成像的定制 MacroZoom 显微镜。A) 在三目端口上安装了 XR/Mega-10 ICCD 相机（Stanford Photonics）的 MVX10 显微镜主体（Olympus）。B) 显微镜主体的特写视图。(a) 变焦控制（0.63 至 6.3X）；(b) 滤光轮；(c) 图像倍增器（数值孔径 NA = 0.50，光学放大倍数为 25X）。C) 用于明场（科勒）照明的聚光镜（聚光镜 NA = 0.55，工作距离 = 27 mm）。

图 3. 小鼠提睾肌制备完成图。麻醉后的小鼠仰卧于温控的塑料包被铝制平台（黄色）上，用胶带固定体位。提睾肌在透明硅橡胶基座上呈放射状展开，并在边缘处用针固定。灌流液通过塑料滴管从近端引入（白色箭头）。真空管线（白色箭头指示）通过Kimwipe吸液条将液体吸出。图中显示两根微移液管，其尖端位于组织内。参考电极（银丝）固定在提睾肌下缘。

图4. 显示在血管内皮表达GCaMP2的微动脉网络可视化时所使用的放大倍数范围。A) 在3.2倍光学放大下拍摄的荧光图像，视频监视器上的总放大倍数为42倍。[视野（FOV）= 4,375 × 3,470 μm]。比例尺 = 500 μm。在此放大倍数下操作有助于将微移液管准确定位于目标位置。C) 在6.4倍光学放大下拍摄的荧光图像，总放大倍数为83倍（FOV = 2,200 × 1,759 μm）。比例尺 = 200 μm。E) 在12.6倍光学放大下拍摄的荧光图像，总放大倍数为165倍（FOV = 1,100 × 885 μm）。比例尺 = 100 μm。G) 使用图像倍增器后，光学放大倍数达到25.2倍。比例尺 = 50 μm。

讨论

本文描述了用于观察小鼠微循环的开放式提睾肌制备方法 在体内该操作方法参照大鼠中首次描述的“开放式”提睾肌制备法⁴经过练习，整个手术过程可在1小时之内完成。该制备方法具有良好的通用性，可进行多种实验操作，且易于应用于仓鼠和大鼠，从而能够以相似的方式研究多种实验模型。该制备仅限于雄性动物，且测量时应位于组织中心区域，避免靠近肌肉边缘的受损区域。¹⁴还应认识到，当切断提睾肌血管的连接部分时，压力和血流分布会发生改变¹⁶，微血管仍保持反应性，适合进行可重复的数据采集。在提睾肌中观察微循环的主要限制在于，随着动物成熟和体型增大，结缔组织逐渐增生，这一现象在大鼠中尤为明显，仓鼠亦有发生。此外，当动物体脂增加时，由于戊巴比妥具有亲脂性，可被脂肪组织吸收，麻醉状态的控制将变得更加困难。最佳的应对方法是在操作过程中保持耐心，并确保动物°s 体温维持在约 37 °C，同时用PSS持续灌注暴露的组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher Scientific	S642-212
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M2643
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233
戊巴比妥钠溶液	Lundbeck Inc	NDC 67386-501-55	也称为戊巴比妥钠
温度控制器	Warner Instruments	TC-344B	替代方案：可调12V直流电源
Series 20 平台加热器套件 RH-2	Warner Instruments	64-0274	需要定制铝制板
Mega-10 相机	Stanford Photonics Inc	XR/Mega-10
MVX10	Olympus Corporation
MV PLAPO 2XC 镜头	Olympus Corporation
MVX10 混合支架	Leeds	LBX-Hybrid
Piper 控制软件	Stanford Photonics Inc		Mega-10 相机专用程序
体视显微镜	Nikon Instruments	SMZ645
防水透明硅酮密封胶	GE Healthcare	47970-72643-LW5000	其他透明硅酮密封胶也可使用
60 × 15 mm 培养皿	Fisher Scientific	08-757-13A
Sylgard	Dow Corning	184
显微解剖剪刀	Fine Science Tools	15003-08
Dumont 镊子	Fine Science Tools	#5/45
GP Millipore Express PLUS 膜	EMD Millipore	SCGPT05RE
微型昆虫针	Austerlitz	M 规格 0.15 mm
紧凑型宠物修剪器	Wahl Clipper Corp.	Model 9966	每次使用后需清洁