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方法文章

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）模型

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DOI：

10.3791/2879

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2011年5月8日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。

摘要

脑卒中是全球第三大死因，也是致残的首要原因，仅2009年在美国的估计费用就接近700亿美元1,2。1986年，Koizumi4建立了大脑中动脉栓塞（MCAO）的血管内模型，以在大鼠中模拟这种具有重大影响的人类疾病。随后，Longa3对该MCAO方法进行了改良。这两种技术已被广泛用于研究缺血性脑卒中导致的脑损伤分子机制以及潜在的治疗手段5。这种在大鼠中相对非侵入性的方法后来被扩展应用于小鼠，以便利用转基因和基因敲除品系6,7。为了模拟局灶性脑缺血，通过颈内动脉插入血管内缝线，以阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部。在设定的时间后撤回缝线可模拟自发再灌注，但缝线也可永久保留。本视频将逐步演示在小鼠中实施血管内MCAO手术的两种主要方法，并提供有关潜在缺陷和注意事项的见解。随后将采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）对缺血脑组织进行染色，以评估脑梗死的范围8。

方案

本方案已获得佛罗里达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物照护原则》（NIH 出版物第 86-23 号，1985 年修订版）。

1. 材料

  1. 动物：雄性 C57BL/6 小鼠（Harlan Laboratories，Indianapolis，IN，USA），手术时体重为 20–26 克。
  2. 麻醉：
    1. 麻醉机：VetEquip 吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，USA）。
    2. 吸入麻醉剂：异氟烷（Isoflurane，Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL）。
  3. 手术器械：SuperCut 虹膜剪刀，直型（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；Vannas 显微剪刀，直型（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；Dumont 镊子（细尖，45° 弯头，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；双极电凝装置（高频电凝器 900，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；微血管夹（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）。
  4. 手术耗材：无菌棉签；擦拭巾；纱布块；缝线（7-0 丝线，Ethicon, Inc.，Somerville，NJ，USA）；组织粘合剂（Vetbond，3M 公司，St Paul，MN，USA）；外科消毒剂：贝塔碘、70% 乙醇和无菌 0.9% 生理盐水；眼药膏（Puralube Vet Ointment，Pharmaderm，Melville，NY，USA）。
  5. 大脑中动脉阻塞（MCAO）用阻塞缝线制备：
    1. 用于大脑中动脉阻塞的缝线：7-0 外科尼龙单丝缝线（Ethicon, Inc.，Somerville，NJ，USA）。
    2. 缝线尖端钝化用热源（热灼仪，Thermal Cautery Unit，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL）。
    3. 液态硅橡胶（Silicone RTV 粘合剂，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）。
  6. 手术/解剖显微镜（Leica Stereo Microscope MZ6）。
    1. 光纤照明器（Fiber Optic illuminator FO1–150，TechniQuip Corp.，Livermore，CA，USA）。
  7. 激光多普勒血流仪（PeriFlux System 5000，Perimed，Stockholm，Sweden）。
    1. 柔性微探头（MT B500-0 直型微探头，Perimed，Stockholm，Sweden）。
  8. 温度参数：
    1. 直肠温度监测仪（BAT-12，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL）。
    2. 加热毯（T/PUMP，TP600，Gaymar，NY，USA）。
  9. 梗死体积染色与定量测量：
    1. 2% 氯化三苯基四氮唑溶液（2% TTC，Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO，USA）。
    2. 小鼠脑组织切片模具（Zivic-Miller Lab., Inc.，Allison Park，PA，USA）。
    3. 数码相机（V1253，Kodak Co.，Rochester，NY，USA）。
    4. 图像分析软件（ImageJ 1.42q 软件，美国国立卫生研究院，Bethesda，MA，USA）。

2. 术前准备步骤

  1. 手术前，将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，自由饮水并摄取啮齿类动物饲料。
  2. 制备MCAO用缝合线时，先用加热法将缝合线尖端1-2 mm处钝化，再用液态硅橡胶涂覆其尖端以下3-4 mm的杆部，并使其干燥（7-0规格；尖端直径0.20-0.25 mm；涂层长度3-4 mm；缝合线总长11-13 mm）。上述所有步骤均应保持无菌。
  3. 称量小鼠体重后，在诱导舱中以4%异氟烷诱导麻醉，并通过面罩给予1.5-2%异氟烷与30% O2 和70% N2O混合气体以维持术中麻醉。
  4. 将小鼠俯卧位置于铺有纱布的温控手术台（加热毯）上，剃除头部毛发。
  5. 双眼涂抹眼用润滑软膏，并闭合眼睑，以防止手术过程中角膜干燥。
  6. 在颅骨表面从枕外隆凸至鼻根上方的皮肤做一条中线切口（长约1 cm），将皮肤向两侧牵拉，固定一个柔性微探头（MT B500-0 Straight Microtip；直径0.5 mm）。将微探头垂直置于右侧顶骨表面（位于前囟后方1 mm、外侧5 mm处），用于通过激光多普勒血流仪监测大脑中动脉供血区域的血流变化。
  7. 在将动物转为仰卧位前，需确保柔性微探头已牢固固定于颅骨上。将动物颈部置于软垫上，鼻部插入麻醉装置的鼻罩中，以便为柔性微探头留出足够空间。
  8. 插入直肠温度探头，以维持动物核心体温恒定在37±0.5°C。
  9. 用胶带将双前肢和双后肢固定于手术平台表面，尾巴固定于直肠探头导管上。

3. 大脑中动脉闭塞手术：

  1. 在手术显微镜下，用剪刀在胸骨柄与下颌之间轻轻提起疏松皮肤，做一正中颈部切口。
  2. 钝性分离下方成对的下颌下腺，左侧下颌下腺保持原位；将右侧下颌下腺向头侧牵拉，并连同胸锁乳突肌一起固定。
  3. 用镊子仔细分离覆盖颈动脉鞘的肩胛舌骨肌肌腹部分。
  4. 仔细分离并游离右侧颈总动脉（CCA），使其与迷走神经及其鞘膜（位于 CCA 外侧）分开。
  5. 此后，常用于实施大脑中动脉阻塞的两种手术方法开始分异：

小泉法4

  1. 在右侧颈总动脉（CCA）上预先放置三根松散的套管缝线（7-0 丝线）。
  2. 辨认、游离颈外动脉（ECA），并在距分叉处远端 2–3 mm 处进行电凝烧灼（所有电凝操作均应将功率旋钮调至 1 档，以避免烧灼部位意外损伤周围组织）。随后可用显微剪刀将其切断。
  3. 对最靠近近端的 CCA 套管缝线施加足够张力，以完全阻断血流（永久性结扎）。通过观察皮层灌注基线值下降约 50% 来确认血流阻断效果。
  4. 在 CCA 分叉前紧邻处放置血管夹，以防止动脉切开时出现逆向血流。
  5. 使用显微剪刀在 CCA 上靠近结扎缝线近端与血管夹之间的区域行动脉切开（更靠近结扎处）。
  6. 通过动脉切口插入经加热钝化处理的硅胶包被 7-0 尼龙缝线，并向前推进直至触及血管夹。随后，轻柔收紧剩余的两根松散套管缝线，缝线位置位于动脉切口与血管夹之间的 CCA 上，以防止血液经 CCA 逆流渗漏，操作中需注意避免损伤动脉管壁；然后撤除血管夹。

Longa的方法3

  1. 识别出颈外动脉（ECA），尽可能进行分离（接近其分叉为舌动脉和上颌动脉处），使用功率设为1的电凝设备烧灼，并用显微剪刀切断。
  2. 在颈总动脉（CCA）分叉上方的近端颈内动脉（ICA）周围预先放置两根松绕结扎线（7-0 丝线）。
  3. 使用血管夹暂时闭合颈总动脉（CCA）。通过观察皮层灌注值较基线水平下降约50%来确认血流阻断效果。
  4. 在两根松绕结扎线近端上方，用血管夹暂时夹闭颈内动脉（ICA），以防止动脉切开时发生逆行血流。
  5. 在颈外动脉残端附近，使用显微剪刀于返折的ECA处行动脉切开术。
  6. 通过ECA上的动脉切口插入经加热钝化并涂有硅胶的7-0尼龙缝线，将其向前推进直至接触ICA内的血管夹。轻轻收紧位于近端ICA的两根松绕结扎线，以防止血液经ICA反流，操作时需注意避免损伤动脉壁；随后撤去血管夹。

其余步骤基本相同：

  1. 将阻塞缝线缓慢经由颈内动脉（ICA）向颅底方向推进，直至遇到轻微阻力。同时通过激光多普勒血流仪确认脑血流量下降至基础值的80%。随后收紧两条套圈缝线，固定插入的缝线。
  2. 对于短暂性脑缺血实验，在45分钟后轻柔撤出阻塞缝线。此时间点可根据不同实验目的进行调整。
  3. 撤出缝线后，需闭合动脉切口以防止术后出血。在Koizumi法中，通过牢固收紧围绕颈总动脉（CCA）的套圈缝线实现闭合；在Longa法中，则对颈外动脉（ECA）根部的动脉切口进行电凝闭合，随后松开并移除位于颈内动脉近端的套圈缝线，以恢复颈动脉血流。
  4. 为关闭切口，将下颌下腺和胸锁乳突肌（SCM）覆盖于手术区域之上，然后使用组织粘合剂对颈部和头皮部位的伤口边缘进行对合。也可选用可吸收缝线或金属钉合器关闭伤口，尤其是在需要动物长期存活的情况下。
  5. 切口闭合后，皮下注射1 ml温热生理盐水以补充血容量。恢复期间应给予适当镇痛药物（如布托啡诺，剂量为0.05–0.1 mg/kg），以最大程度减轻动物疼痛与不适。手术结束后将动物移出手术室，置于温暖的恢复区或笼具中，防止低体温，并确保其可自由、方便地获取软质食物和饮水。

4. 术后神经功能评估

动物完全恢复意识后，可通过一个简单的五分制评分标准来评估神经功能缺损情况3：

  1. 无可见功能缺损
  2. 对侧前肢伸展不能（轻度局灶性神经功能缺损）
  3. 向梗死灶对侧方向转圈（中度局灶性神经功能缺损）
  4. 向梗死灶对侧方向倾倒（重度局灶性神经功能缺损）
  5. 意识水平下降，无自发运动

5. 脑梗死体积的染色与定量测量

  1. 在大脑中动脉（MCA）再灌注 24 小时后，对存活的小鼠进行称重，使用 4% 异氟烷深度麻醉，并根据批准的方案实施安乐死。
  2. 小心取出小鼠脑组织，置于小鼠脑切片模具中，将整个大脑以冠状面方向每 2 mm 进行切片。
  3. 将脑片浸入含 2% TTC 的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 37 °C 下孵育 20 分钟。TTC 染色后，梗死区域呈现为白色（未染色）组织，邻近呈砖红色（存活）组织（图 1）。
  4. 使用数码相机拍摄连续切片图像，并利用 ImageJ 软件测量梗死面积。
  5. 测量每张切片的梗死区（白色，未染色）、同侧半球（白色与砖红色，已染色）以及对侧半球（砖红色，已染色）的面积。通过将所有切片中代表性区域的面积相加，再乘以切片厚度，计算总体积。校正水肿后，梗死体积按以下公式计算9：
    校正梗死体积（CIV），% = [对侧半球体积 - (同侧半球体积 - 梗死体积)] / 对侧半球体积 × 100

6. 代表性结果

通过左侧颈总动脉阻断和再灌注大脑中动脉以建立短暂性脑缺血后，处死动物并将其脑组织进行冠状切片，用TTC染色以评估梗死体积（图1）。

种子横截面示意图，突出显示农业研究中的生理差异。
图1. 经MCA闭塞处理的小鼠脑部连续冠状切片（2 mm）的TTC染色结果。

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讨论

大脑中动脉阻塞（MCAO）模型是一种已建立的、用于在小鼠中复制脑缺血的模型。该模型最初在大鼠中使用，随后被改进并应用于小鼠。该技术的一个优势是避免开颅手术，从而消除手术操作对血脑屏障通透性和颅内压的影响。然而，许多变量，如品系差异10、缝线尖端大小11、阻塞持续时间6、体温12、麻醉方式13以及其他因素，可能导致该模型中梗死体积的不一致。
以下是一些需要特别指出的技术细节：

  1. 对缝线末端进行包被处理，可获得更光滑且易于操作的缝线，用于闭塞大脑中动脉（MCA），从而降低穿孔风险。
  2. 精细分离并固定迷走神经，使其远离邻近动脉，避免在套扎缝合时意外受压。务必使用两道套扎缝线，以防止在推送闭塞缝线过程中经切口发生逆行出血；结扎时应轻柔操作，避免损伤动脉管壁。
  3. 翼腭动脉在颈总动脉（CCA）分叉后从颈内动脉（ICA）分出。为避免上升中的缝线尖端误入翼腭动脉而非进入ICA，应调整手术平台，使小鼠头部与颈部保持直线方向。此类偏差在Koizumi法和Longa法中均较常见，因此...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
雄性 C57BL/6 小鼠动物Harlan Laboratories20–26 克
解剖显微镜显微镜Leica Microsystems6.3:1 变焦
光纤照明器照明器TechniQuip Corp., Livermore, CA, USAFO1–-150
异氟烷麻醉剂Baxter Internationl Inc.1001936060
SuperCut 直头虹膜剪手术工具World Precision Instruments, Inc.14218
Vannas 微型直头剪手术工具World Precision Instruments, Inc.14003
Dumont 精细尖镊子手术工具World Precision Instruments, Inc.503290
血管夹手术工具World Precision Instruments, Inc.14120
高频电凝器 900手术工具World Precision Instruments, Inc.500397
7-0 外科尼龙单丝缝线缝线Ethicon Inc.1647G用于闭塞的缝线
7-0 外科丝线缝线缝线Ethicon Inc.7733G用于结扎的缝线
硅酮 RTV 粘合剂硅橡胶World Precision Instruments, Inc.1571
Vetbond组织粘合剂3M70200746587
Puralube Vet 软膏眼膏Pharmaderm Animal Health
盐酸丁丙诺啡镇痛药Hospira Inc.NDC 0409-2012-32
热凝装置World Precision Instruments, Inc.501292
PeriFlux System 5000经颅多普勒血流测量仪Perimed
BAT-12直肠温度计World Precision Instruments, Inc.BAT-12R
T/PUMP, TP600加热毯Gaymar Industries
2,3,5-三苯基四氮唑氯化物试剂Sigma-AldrichT8877
小鼠脑组织切片模具脑切片器Zivic InstrumentsBSMAS001-1

参考文献

  1. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
  3. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
  6. Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
  7. Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
  8. Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

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