使用扩散性抑制建模发作性与慢性偏头痛的神经免疫信号传导 体外

摘要

偏头痛及其向慢性偏头痛的转化是重大的医疗负担，亟需更有效的治疗方案。我们致力于阐明神经免疫信号如何调节偏头痛的易感性，通过体外建模 体外 利用海马脑片培养中的扩布性抑制，以期发现新的治疗靶点。

摘要

偏头痛及其向慢性偏头痛的转化是亟需改进治疗方案的医疗负担。我们旨在阐明神经免疫信号如何调节偏头痛的易感性，通过体外（in vitro）建模的扩散性抑制（SD）来探索这一机制，以期为发作性及慢性偏头痛开发新的治疗靶点。SD 很可能是偏头痛先兆和偏头痛疼痛的病因。它是一种由初始神经元活动增强所触发的神经元功能阵发性丧失，可在易感脑区缓慢传播。正常脑功能对同时发生的低水平免疫信号极为敏感，并依赖于此类信号。因此，神经免疫信号很可能影响 SD 的电活动，从而影响偏头痛。在整体动物中开展 SD 的痛觉感知研究存在诸多困难，但整体动物非常适合研究偏头痛的系统生物学特征，因为 SD 可激活三叉神经伤害性通路。然而，仅依靠整体动物研究无法解析 SD 的细胞和神经环路机制。相反，必须采用可控制环境条件的体外（in vitro）制备方法。在此背景下，需认识到急性脑片的局限性以及海马脑片培养体系的独特优势。急性脑片无法揭示免疫信号中的细微变化，因为制备过程本身就会引发：持续数天的促炎性改变、因维持脑片活性所需高氧张力导致的癫痫样活动，以及缺氧脑片中心区域发生的不可逆细胞损伤。

相比之下，我们研究成熟的海马脑片培养物中的免疫信号，因为这些培养物在功能上与体内环境高度相似，具有成熟的三突触回路功能；同时星形胶质细胞、小胶质细胞和细胞因子水平均处于静息状态；并且可在未麻醉的条件下轻松诱导扩散性去极化。 体内 具有成熟三突触功能的对应结构；星形胶质细胞、小胶质细胞及细胞因子水平处于静息状态；并且在未麻醉的制备中可轻松诱导扩散性抑制（SD）。此外，这些脑片存活时间长，可在连续数天内反复诱导SD而无损伤，使该制备成为迄今为止唯一能够模拟慢性SD所致神经免疫后果的方法，因而也可能用于模拟慢性偏头痛。我们采用电生理技术和非侵入性成像手段来 测量 与SD同时发生的神经元细胞及神经环路功能。神经免疫基因表达变量通过qPCR筛选、qPCR阵列，以及重要的是，采用cDNA预扩增技术，结合全组织、区域或特定细胞（通过激光显微切割）采样，以检测干扰素-γ等超低丰度靶标。细胞因子级联信号进一步通过多重磷酸化蛋白相关靶标进行评估，并通过细胞特异性免疫染色验证基因表达和磷酸化蛋白的变化。采用药理学及siRNA策略模拟并调控SD相关的免疫信号。 模拟 以及 调节 SD免疫信号传导

方案

在脑切片中成功研究免疫相关性扩布性去极化（SD）信号传导时，有几个要点值得强调。首先，启动刺激必须同步去极化足够体积的脑灰质，以诱发SD。这意味着需要采用界面式培养配置（即切片培养插件下方仅接触液体，上方进行气体交换）。^1,2 其次，急性脑片虽能维持扩布性抑制（SD），但其制备过程造成的创伤以及使用95%氧气充气的任氏液分别会引发促炎性变化和癫痫样活动，从而可能改变神经环路功能和免疫稳态。³ 第三，尽管海马脑片培养克服了急性脑片的这些局限性，但需要注意的是，脑片培养在使用前应维持足够长的时间（即超过10天） 体外以使小胶质细胞和星形胶质细胞处于静息状态。^3-5 最后，应使用无菌和无菌操作技术诱导 SD。以下所述的技术旨在满足这一要求。

1. 脑片培养物中的扩散性抑制

1. 培养物的制备与维持
   1. 脑片培养物在含马血清的培养基或无血清培养基（SFM）中制备并维持^6,7 如前所述⁸ 对培养基进行轻微修改。培养条件参数为 36°C，5% CO₂，95% 湿度平衡空气。
      1. 我们发现，培养物在培养18天后可转换至无血清培养基 体外 并维持至少35天 体外 通过使用我们先前定义的含有额外钙和镁的SFM。
      2. 此外，添加抗生素和抗真菌剂以防止与多次记录过程相关的感染性污染。
      3. 这种长期（或记录）培养基配方每100 mL包含：NeurobasaL培养基97 mL；Gem-21 2.0 mL；Glutamax（200 mM）0.5 mL；庆大霉素（10 mg/mL） 10 μL；D-葡萄糖（45%） 680 μL抗坏血酸（0.5 M） 100 μL；Fungizone，（250 mg/mL） 400 μL；NaCl（5.0 M）， 820 μL，Mg₂Cl₂ (1.0 M) 80 μL；CaCl₂ (1.0 M), 160-240 μL.
      4. 培养物用于诱发扩散性去极化（SD）的时间为21至35天 体外.
   2. 活力验证。^3,6,7
      1. 使用前对培养物进行检测，以确认是否存在锥体神经元死亡。
         1. 18天时 体外，将插入物置于含培养基（在正常培养条件下）中孵育20分钟 5 μM Sytox Green 是一种在结合 DNA 时产生荧光的标记物（即通过穿透死细胞进入细胞内）。
         2. 随后将插片转回至原有培养基中，并通过荧光显微镜（激发波长504，发射波长523）检测CA3或CA1区锥体神经元层是否出现损伤。
            1. 超过20个细胞或荧光强度标准化水平高于250 IU的切片被排除在进一步使用之外。
2. 材料制备
   1. 接地电极 使用玻璃管（外径 2.0 mm / 内径 1.16 mm）截成 4.5 mm 长度，并在两端短暂火焰抛光制成。
      1. 我们一次制备约 20 根电极，可使用一年以上。
      2. 将100 mL 1 M KCl加热至沸腾，边搅拌边加入3.5 g琼脂和0.5 g EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物），形成澄清的黄色溶液。
      3. 使用一段短的软管分别套在每根玻璃管上，将温热的KCl/琼脂溶液吸入玻璃管内，同时进入软管内部一小段距离。
         1. 松开吸力，使 KCl/琼脂缓慢从玻璃管的开口端滴出；然后将玻璃管的开口端紧贴一块冰。
         2. 后者操作将促使琼脂在电极尖端凝胶化，而不会在回撤至玻璃管内部后发生凝胶化。
      4. 琼脂在冷流水凝固后，可取出柔性管，而不会改变位于玻璃管中琼脂的位置。
      5. 将 0.5 mL 的 1 M KCl 加入 1.5 mL 离心管架的每个孔中。然后将每根填充 KCl/琼脂的玻璃管的一端分别放入各孔中。
      6. 接下来，用止血钳夹住一段80 cm长的15号银丝，将银丝在固定于台面上的砂纸板上逐面刮擦，清洁四个侧面。
      7. 将导线剪成 4 cm 的小段，放入装有次氯酸钠溶液的闪烁瓶中浸泡 20–30 分钟，以便在清洁后的银表面形成牢固的 Ag-AgCl 涂层。
      8. 将每根导线对折，将自由端插入装有 KCl/琼脂的一端玻璃管中，露出约 4-6 mm。
      9. 最后，使用防水且柔韧的Goop胶将含有银丝的玻璃管柄以及部分银丝进行涂覆，以防止KCl/琼脂干燥。对所有电极重复此步骤。让胶水过夜干燥。
      10. 将电极储存于 4°C 置于含有约 5 mL 1 M KCl 和 25 mg EDTA 的闪烁小瓶中（每瓶 5–6 根电极），EDTA 可显著延缓细菌生长。
   2. 记录电极 由带有细丝的硼硅酸盐玻璃管（直径1.5 mm，内径0.86 mm，长度10 cm）制成（视频图1）。
      1. 用短玻璃管拉制尖端细小的微电极。
         1. 我们通常拉制长约 7.5 cm、锥形部分约 1 cm 的电极。这有助于实现适当的定位并清晰观察电极尖端。
         2. 使用Narishige PE-2拉制仪制备电极。
         3. 微电极尖端回撤至 2-4 μm 在配备校准光学微米尺的复式显微镜下观察，使用固定在液压一维微操纵器上的标准玻璃组织学载玻片（25 × 75 × 1 mm）边缘，由另一三维操纵器固定，轻柔折断微电极尖端。
            1. 首先，将电极用黏土固定在显微镜载玻片上。
            2. 然后将载玻片置于显微镜载物台支架上，该支架用于移动连接至液压操纵器的玻璃载片边缘附近的微电极尖端。
            3. 最后，通过将微电极尖端轻轻抵压由液压驱动的显微镜载玻片边缘，使其尖端轻微破裂。
   3. 刺激电极 是扭曲的双极导线电极，因为：
      1. 它们能够记录诱发电位，否则这些电位会被单极刺激产生的刺激伪迹所掩盖。
      2. 双极刺激电极可轻柔地施加于齿状回表面而不造成损伤，而尖头双极电极则不然。
      3. 最后，施加的电流被局限在用于电极的聚四氟乙烯绝缘导线的横断面（裸露）圆形表面上。
         1. 刺激电极的制备首先从截取约 20 cm 长的铂铱合金（125 μm 裸直径 200 μm 涂覆直径）和特氟龙包被导线。然后将导线对折，将两端打成一个松散的方结，结到导线末端保留约 2 cm 的长度。
         2. 将结固定在置于桌面上的电动手钻的夹头中。
         3. 用止血钳夹住导线的另一端，短暂开启和关闭钻机，直至导线紧密绞合（即当导线在横向切割时，各切割面之间的距离相等且不会松散）。
         4. 接下来，需要将铂-铱合金绞线的裸露端连接到导线上，以便将刺激电极与刺激隔离器相连。
            1. 通过将铂铱合金丝的自由端焊接至约50厘米长的30号导线上来完成。
            2. 首先，将铂铱合金绞线用胶带固定在实验台面上，并在一端裸露的绞线上滴加一滴浓盐酸。
               1. 接下来，使用电线钳从每根导线两端剥去约1厘米的绝缘层。
               2. 将剥去绝缘层的一端放置在靠近绞合线端的导线上，使用尖头烙铁加热，然后进行焊接，直至两根导线牢固连接。
            3. 将一小段热缩管套在裸露的导线连接处，用热源加热使其收缩贴合。
            4. 对第二根导线重复上述步骤。
            5. 将一根15 cm的巴斯德移液管尖端进行火焰抛光，并将拧成的铂-铱丝沿移液管导入，直至约6 cm的拧绞部分从移液管中伸出。
            6. 使用疏水性环氧树脂（例如 J-B Weld）密封电极的两端。
            7. 最后，将香蕉插头连接至导线末端，以便与刺激隔离器相连。
            8. 在体视显微镜观察下，将电极尖端置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，观察是否仅有电极尖端切割端产生电解气泡。若扭曲导线的侧面有气泡产生，需使用新的单刃剃须刀片对电极进行横向切割，以重新恢复导线长轴方向的完整绝缘。
            9. 当排查异常刺激效应时，可尝试使用新切割的电极尖端。
   4. 记录培养皿 由置于35 mm培养皿中的切片培养插件组成，该插件架在两根相距约1.0 cm的1.0 × 12 mm玻璃棒上。通过加热玻璃管，再用镊子将其压入培养皿底部，以固定玻璃棒。
      1. 在静态记录条件下，向培养皿中加入 1.5 mL 培养基。
      2. 接着，将一块长约3-4 cm、宽约10 mm的无菌棉浸入1.0 mL培养基中。用无菌镊子沿长轴对折棉片，并将其放置在插入物的内侧小室边缘。湿润的棉片有助于维持培养皿内的湿度。
      3. 在插入物周围等距分布着三段可压缩的4 mm长管。
      4. 用聚氯乙烯膜 tightly 封住培养皿，以允许气体交换。
      5. 用单刃剃须刀沿其垂直中壁周围切割，以去除多余的聚氯乙烯薄膜。
3. 电生理实验装置
   1. 将切片培养插件组件放入PDMI记录室中，用于电生理记录。
      1. PDMI 腔室中的插件/培养皿组件由随 PDMI 腔室提供的 2 mm 厚塑料圆盘覆盖，塑料圆盘上根据需要设置有用于记录电极、培养基流入/流出管等的小孔。
      2. 我们使用微型组合pH电极定期监测培养基的pH值，并通过安装在密封半微电极内的微型T型热电偶探头监测温度，以确保pH值维持在7.3 36.0°C 条件。
      3. 插入/培养室以5%二氧化碳-平衡空气通气，培养基保持静止或采用流动（1.2 mL/分钟）模式，插入物中心温度维持在35-36°C.
      4. 对于灌流条件，培养基通过管路加热器预热，再次确保记录室中心位置的温度维持在 36°C.
         1. 采用带有压力释放装置的蠕动泵系统将培养基输入脑片培养物中，可避免泵送过程中的脉动。使用PDMI培养室配备的吸液器通过轻柔抽吸从插入物中移除培养基。
      5. 为确保稳定性，将培养 chamber 置于特制的 Burleigh-Gibraltar 倒置显微镜载物台上，该载物台可固定倒置显微镜并放置于防震实验台上。
      6. 使用小型电池供电的烧灼工具在聚氯乙烯插入物包裹上打开小孔。
      7. 接下来，如果需要使用灌流配置，则先开始灌流进液和出液，然后放置接地电极；否则，直接放置接地电极即可。
      8. 电极由显微操作器固定，置于倒置显微镜下以5倍放大倍数观察到的脑片上方。图 1).
         1. 首先放置记录电极，然后放置刺激电极。
         2. 我们使用音频监测器来记录微电极与脑片接触的时刻。将电极尖端定位在CA3锥体细胞层的中点位置。
         3. 开始记录后，将刺激电极轻轻接触齿状回中点表面。
         4. 在这两种情况下，电极的初步移动均通过粗调控制完成，而最终定位则仅通过液压微调控制完成，同时使用相差照明，以便清晰区分细胞体层。
         5. 将电极向前推进约~25 μm 在直接显微镜观察下进行分步操作。
         6. 一旦电极接触组织，再将电极推进20-30 μm.
         7. 在放置刺激电极之前开始记录，以确保该操作不会诱发扩散性去极化（即避免机械刺激引发）。
         8. 在开始实验前，需等待约10分钟。
4. 跨突触诱导的扩布性去极化
   1. 优化诱发的CA3区场电位，步骤如下（图 2).
      1. CA3区场电位通过刺激诱发 100 μs 脉冲（0.2 Hz），起始电流足以引发反应（例如，~ 1-5 μA).
      2. 沿锥体神经元长轴以逐步移动记录电极，直至场电位达到最大。
      3. 然后，增加记录电极在此位置的电流，并记录最大电流反应（例如，~ 10-20 μA).
      4. 最后，实验中使用半最大刺激强度（例如，假手术对照的周期性刺激）。
   2. 确定突触诱发的扩散性去极化（SD）的阈值（图 2).
      1. 按照上述诱发场电位的电极配置，将刺激模式切换为单次手动诱发的10脉冲串（10 Hz @ 100 μs/pulse），此范式先前已在整体动物研究中应用。
      2. 逐步增加每次刺激脉冲的电流强度，直至触发扩布性抑制（SD）。两次刺激之间至少等待 60–120 秒。
      3. 以库仑（即电流 × 时间）报告 SD 阈值。
   3. 在其他需要测量对多次 SD 诱导反应的实验中，使用可能诱发 SD 的刺激强度（例如，~100–500 nC）。
      1. 每9分钟诱导一次SD，持续一小时。
      2. 务必在整个实验过程中使用无菌技术。
      3. 最后一次SD后，将培养插件放回正常的培养条件中。
         1. 标记培养皿，注明经历SD的培养物。
         2. 我们习惯在切片培养插件的左侧放置一个标记，右侧放置两个标记，从左至右将三个培养物分别记为#1、#2和#3。
         3. 每3-4天更换一次培养基，直至收获培养物。
   4. 对于反复性扩布性抑制，遵循上述步骤进行操作。
   5. 我们通常在首次多次皮质扩布性抑制（SD）持续一小时后的第1、3、7和14天检测SD阈值的变化。
   6. 通过独立的数字信号处理系统记录CA3区的快电位和慢电位变化。

2. 海马脑片培养物中的典型活体成像

1. 常驻免疫细胞（如小胶质细胞）的动态功能行为也可在无细胞损伤或免疫活化的脑片培养中进行监测图 3).⁹
   1. 例如，为了标记小胶质细胞以评估其与 SD 突触活动变化相关的移动，我们使用了荧光标记的异凝集素-IB₄.
   2. “Lectin PBS” 是指在 PBS 中添加额外的阳离子（每种 0.1 mM CaCl₂ 和 MgCl₂）。₂，MgCl₂, MnCl₂因为需要二价阳离子（0.1–1.0 mM）来介导凝集素与小胶质细胞膜上的 α-D-半乳糖基部分结合。
   3. 配制“Lectin PBS”溶液：
      1. 配制 1 L 磷酸盐缓冲液（PBS）时，采用无菌技术并经无菌过滤后加入：
      2. 100 μL 1 M MgCl₂₂
      3. 100 μL 1 M MnCl₂₂
      4. 100 μL 1 M CaCl₂₂
   4. 充分混合以确保均匀，置于冰箱中冷藏保存 4°C.
      1. 仅 500 μL 每瓶凝集素需要一定量的“凝集素PBS”，但由于其可在冰箱中保存数月，因此制备较大体积可能更为方便。
   5. 将AlexaFluor 594标记的isolectin-IB4（isolectin）冻干粉用“lectin PBS”溶解，重悬至1 mg/mL。
      1. 为尽量减少光漂白，请尽快完成此步骤，并尽量减少光照暴露。
      2. 异凝集素可分装保存 20 μL 一旦在1 mg/ml浓度下重悬并保存于-20°C 长达一年。
      3. 将凝集素稀释至 20 μg/mL 在生长培养基中培养，并在成像前于正常培养条件下孵育切片培养物4-10小时。
   6. 成像装置设置。
      1. 成像系统设置包括：显微镜、快门、相机、光源、2.0 中性密度滤光片， 36°C，气体：5% CO2，空气（或20%氧气，其余为氮气）。
      2. 至少在成像前一小时打开显微镜、相机、紫外光、温度控制和气体供应。
   7. 设置 MetaMorph 成像方案。
      1. 从“期刊”下拉菜单中选择“运行期刊...”
      2. 这将提示打开 JOURNALS 文件夹，从中选择“Motion w-var afs（此前已建立的期刊，遵循以下步骤）”，然后点击“打开”。
      3. 接下来将弹出“自动对焦频率”窗口，将“数量”保持为1，点击“确定”。
      4. 接下来，“顺序文件 Na...”设置窗口将弹出，请保持所有设置不变：
         1. 基础名称：图像；
         2. 图像编号：1
         3. 数字宽度：3
         4. 保存类型：MetaMorph TIFF
         5. 如果图像已存在 -> 自动覆盖；
         6. 单击“选择目录...”，此时将弹出“浏览文件夹”窗口。在此窗口中，选择用于保存视频帧的文件夹（或创建一个新文件夹）。
         7. 然后，当“设置顺序文件名...”窗口底部显示正确的文件夹（例如 C:DataNew Folder）时，单击“OK”。
         8. 在“采集”窗口中：
            1. 在左下角选择设置为 DiIMGBIN2；
            2. 曝光时间：20 ms； binning：1
         9. 然后，在“特殊”选项卡中：
            1. “传感器模式”：FT
            2. “Digitizer”：10 MHz（EM增益）；
            3. “增益”：增益3（3倍）；
            4. 选择“EM增益：45”；相机快门：曝光时打开；清空模式：曝光前清空；清空次数：2，触发模式 & 实时触发模式：正常（定时）。
         10. “平均帧数”：3。
         11. 点击“关闭”。
   8. 设置好 MetaMorph 成像系统后，将插件置于底部放置两根 1 mm 玻璃棒的 35 mm 培养皿中。
      1. 在插入物与培养皿壁之间放置三段2 mm长的橡胶管，以进一步稳定插入物。
      2. 在插入物内放置一块约10 mm宽、用额外1 mL培养基浸湿的棉片，以维持湿润环境。确保棉片与壁面齐平，并远离海马脑片。
      3. 用聚氯乙烯薄膜 tightly 封住培养皿顶部，以防止液体流失。
   9. 确保成像聚焦于CA3锥体细胞层。通过在5倍、10倍和20倍下拍摄相差图像来记录切片的方位。
   10. 在屏幕上出现的“查找焦点”窗口中，将范围（当前值±）设置为“8”，精度（单位：微米）设置为“1”（底部两个复选框均应勾选）。
   11. 单击“查找焦点”以确保图像聚焦清晰。
   12. 在“采集时间序列”窗口中，选择时间间隔为“1分钟”，持续时间为“6小时”（这些是我们的首选采集参数）。
       1. 为准确捕捉小胶质细胞的运动，成像频率应不低于每分钟一次。
   13. 在图像存储中，选择堆栈。
   14. 应勾选“更新图像窗口”框，但不要勾选其下方的另外两个框。
   15. 选择“照明”为“Lambda”。
   16. 点击“OK”。
   17. 视频现在将开始播放。这意味着在视频结束之前，或在您通过点击 Esc 键提前停止视频之前，无法在 MetaMorph 程序中执行其他任何操作；点击 Esc 后，视频将在下一个定时采集步骤时停止。
   18. 在电影结束时，按照上述方法（A）通过Sytox筛选检测细胞损伤。

3. 低水平细胞因子信号通路的RNA提取^11-15

1. 我们此前已详细介绍过使用 qPCR 和 PCR 芯片技术在脑片培养中检测低水平细胞因子信号的方法。^6,7
2. 我们已显著提高了在脑片培养中检测细胞因子 mRNA 的方法灵敏度，并在此介绍这些改进。
3. 这些改进包括我们对组织收获与 RNA 提取的方法优化、对肿瘤坏死因子 α（TNF-α）变化的预筛选，以及 cDNA 预扩增技术；这些方法的灵敏度约为此前技术的 6 倍，例如首次实现了脑片培养中干扰素-γ（IFN-λ）的检测。¹⁵
4. PCR 准备。
   1. 脑片培养收获。
      1. 实验结束后，将脑片培养插件浸入 2–3 mL RNAlater 中，并于 4°C 保存最多 3 天，直至进一步处理。
      2. 收获时，使用钻石刀去除多余组织（即海马本体以外的邻近组织），并用细尖毛笔将脑片转移至不含 RNase/DNase 的 1.5 mL 离心管中，每管含 0.5 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
      3. 以标准方式离心样品（10,000 rpm × 1 分钟），使所有脑片贴附于管壁同一侧。
      4. 去除 PBS 上清液，并将样品重悬于 500 μL TRIzol 中。
      5. 将样品储存于 -80°C 或置于冰上，直至进行 RNA 提取。
   2. 使用 TRIzol 结合 RNeasy Micro 试剂盒提取 RNA，所得 RNA 产量高于单独使用该试剂盒（图 4）。
      1. 将 TRIzol 样品解冻，并于室温孵育 5 分钟。
      2. 通过 1 mL 吸头移液器反复抽吸和/或涡旋，使组织充分解离，直至肉眼不可见固体组织。
      3. 加入 100 μL 无 RNase 的（RF）氯仿，倒置管子 2–3 次以充分混合。
      4. 室温孵育 3 分钟，每分钟涡旋一次。
      5. 于 4°C 以 13,000 rpm 离心 15 分钟。
      6. 将上清液转移至洁净的 1.5 mL 微量离心管中，注意勿扰动界面。
      7. 加入等体积的室温 RF 70% 分子生物学级乙醇（约 300 μL）。
      8. 轻轻吹打数次以混匀。
      9. 按照 RNeasy Micro 试剂盒说明书继续以下步骤：
         1. 将样品加入置于 2 mL 收集管中的 RNeasy 微柱。
         2. 以 10,000 rpm 离心 15 秒，弃去穿流液。
         3. 用 350 μL RW1 缓冲液洗涤 RNeasy 柱。
         4. 以 10,000 rpm 离心 15 秒，弃去穿流液。
         5. 将 10 μL DNase 1 储存液加入 70 μL RDD 缓冲液中，轻轻混匀。
         6. 将 80 μL DNase 溶液直接加至膜上，室温孵育 20 分钟。
         7. 用 350 μL RW1 缓冲液洗涤 RNeasy 柱。
         8. 以 10,000 rpm 离心 15 秒，弃去穿流液和收集管。
         9. 向 RNeasy 柱中加入 500 μL RPE 缓冲液。
         10. 以 10,000 rpm 离心 15 秒，弃去穿流液。
         11. 向 RNeasy 柱中加入 500 μL RF 80% 分子生物学级乙醇。
         12. 以 10,000 rpm 离心 2 分钟，弃去穿流液和收集管。
         13. 将 RNeasy 柱置于新管中，打开管盖。
         14. 以最大速度（即 14,000 rpm）离心 5 分钟。
         15. 将 RNeasy 柱转移至 RF 微量离心管中。
         16. 将 14 μL RF 水直接加至膜上。
             1. 以 10,000 rpm 离心 1 分钟以洗脱。
             2. 将样品储存于 -80°C 或继续下一步操作。
   3. RNA 定量。
      1. 将 RiboGreen 以 1:200 比例稀释于 RF 1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中。
      2. 准备用作 RNA 标准品的酵母 tRNA。
         1. 工作储备液储存于 -20°C，浓度为 100 μg/mL
         2. 稀释至 1 μg/mL（10 μL 加入 990 μL TE）。
         3. 按如下方式制备标准品：100 ng/μL 加入 100 μL，80 ng/μL 加入 80 μL tRNA 和 20 μL TE，60 ng/μL 加入 60 μL tRNA 和 40 μL TE，40 ng/μL 加入 40 μL tRNA 和 60 μL TE，20 ng/μL 加入 20 μL tRNA 和 80 μL TE，0 ng/μL 加入 100 μL TE。
      3. 样品准备：
         1. 将 99 μL TE 与 1 μL 样品混合。
         2. 每个样品设两个重复。
      4. 使用多通道移液器，每孔加入 100 μL 稀释后的 RiboGreen。
      5. 吹打混匀。
      6. 使用酶标仪测定荧光强度。
         1. 采用荧光素程序（485 nm/535 nm，0.1 秒）。
         2. 将结果导出至 Excel 表格。
   4. 确定 RNA 浓度。
      1. 在 Excel 中绘制吸光度与 RNA 浓度的关系图，并拟合最佳线性回归线。
      2. 根据最佳拟合线对应的回归方程确定样品 RNA 浓度。
   5. 确定 RNA 质量。
      1. 通过琼脂糖凝胶电泳检测核糖体 RNA 条带完整性（图 4）。
         1. 尽管对每个 RNA 样品取部分进行检测不切实际（因需 1 μg RNA，而产量较小），但建议定期对代表性样品进行变性琼脂糖凝胶电泳，以证明该方法在正确操作下可获得高质量 RNA（即无降解）。
         2. 制备 1% 琼脂糖凝胶（100 mL 体积）。
            1. 用 RNase AWAY 彻底清洗电泳槽、制胶托盘和梳子。
            2. 称取 1 g 超纯琼脂糖放入烧瓶中。
            3. 加入 83 mL 无 RNase 水和 10 mL 10x MOPS [3-(N-吗啉代)丙磺酸] 缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解且溶液澄清（约 3 分钟）。
               1. 制备 10x MOPS 缓冲液
                  1. 混合 83.7 g MOPS、13.6 g 醋酸钠和 3.7 g EDTA。
                  2. 加入 800 mL 无 RNase 水，搅拌溶解。
                  3. 调 pH 至 7.0，定容至 1 L。
                  4. 过滤除菌或高压灭菌。
                  5. 室温避光保存。
            4. 待凝胶冷却至 55°C 后，加入 7 mL 37% 甲醛（此步骤应在化学通风橱中进行）。
            5. 将凝胶倒入制胶托盘，在通风橱中静置凝固。
         3. 准备 RNA 样品。
            1. RNA 样品缓冲液（500 μL，现配现用）。
               1. 混合 50 μL 10x MOPS、250 μL 甲酰胺、90 μL 37% 甲醛、108 μL RF H₂O 和 2 μL 溴化乙锭（储存液 10 mg/mL）。
            2. 向 1–10 μg RNA 中加入两倍体积的样品缓冲液，实现三倍稀释。
            3. 95°C 变性 5 分钟，冰上冷却 5 分钟。
            4. 短暂离心，将全部样品连同 RNA ladder（如需可加 loading dye）上样至凝胶孔中。
         4. 电泳
            1. 电泳槽中加入 1x MOPS 缓冲液。
            2. 以 50–75 伏电压电泳，直至指示剂迁移至凝胶长度约 2/3 处。
         5. 在紫外透射仪上观察凝胶。
            1. 确认存在清晰的 18S 和 28S 核糖体 RNA（rRNA）条带，且 28S 条带强度约为 18S 的两倍（图 4）。
            2. 降解的 RNA 会出现弥散条带、模糊条带，或不呈现 2:1 的强度比。
   6. 通常我们使用光密度法评估总 RNA 质量。
      1. 尽管灵敏度较低，但通过 Nanodrop 进行紫外分光光度法检测是一种快速且经济的 RNA 质量检查方法。
      2. 观察 260/280 的光密度（OD）比值是否在 1.5–2.0 范围内。
      3. 需注意，RNA 所处溶液（TE 缓冲液或水）会影响 OD 比值。
5. PCR 操作。
   1. PCR 前准备
      1. 设计特异性引物
         1. 使用 NCBI 的 Primerblast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/：
            1. 输入目标基因的 Refseq 登录号。
            2. 设定 PCR 产物大小为 70 至 200 bp。
            3. 设定退火温度（Tm）为 55–72°C，正反向引物间温差小于 5°C。
            4. 选择“引物必须跨越外显子-外显子连接处”，以减少基因组背景干扰。
            5. 启用大鼠 Refseq RNA 数据库的特异性检查，确保引物不识别其他非目标序列。
            6. 从结果中选择符合以下标准的引物对：
               1. 长度为 18–30 个碱基。
               2. 在模板上相距小于 2000 个碱基。
               3. 鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为 40–60%，以确保引物与模板结合稳定。
      2. 选择内参基因。
         1. 并非所有内参基因都适用于您的实验体系。每次使用新实验模型时，均需验证内参的稳定性。为保持一致性，我们选择 RT² Profiler PCR 芯片提供的四种内参基因之一。
         2. 理想的内参基因应满足以下条件：
            1. 其表达水平不受实验处理影响。
            2. 其表达水平与目标基因相近。
         3. 选择合适内参的方法：
            1. 查阅文献，确定体系中可能稳定的候选内参基因。例如，我们测试了 Rpl13a，因其在缺血研究中显示稳定。^11,12
            2. 按上述方法设计引物（或在 RTPrimerDB 等数据库中查找已验证的常用内参基因引物 http://www.rtprimerdb.org/）。
            3. 与目标基因引物同步优化（见下文）。
            4. 使用如 Normfinder（http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm）等软件分析，该软件基于组内方差计算各基因稳定性值，并选择在所有样本中表达变异最小的基因。例如，Rpl13a 是适用于 SD 的理想内参基因（图 4）。
      3. 引物优化。
         1. 为获得一致且可靠的结果，qPCR 引物必须满足可重复性、灵敏度和特异性的要求。
            1. 建议对每对新引物测试这些参数。
            2. 通过技术重复测试可重复性。
            3. 通过连续 4 倍稀释的标准曲线评估灵敏度。
            4. 通过熔解曲线分析和凝胶电泳确认单一扩增产物，以确定特异性（图 5）。
         2. 运行 qPCR 板以测试引物质量和引物使用浓度。
            1. 使用全脑 RNA 合成的 cDNA，建立标准曲线（连续 4 倍稀释系列）：1、1:4、1:16、1:64、1:256，以及无模板对照（NTC）。
            2. 对每个稀释度，每个引物浓度（即 100 nM、200 nM、300 nM）取 1 μL cDNA 进行双重复。
         3. 确认技术重复的 Ct 值一致。
         4. 分析稀释曲线的 Ct 值。
            1. 将各稀释度的 Ct 值对浓度作图，所得曲线应呈线性，且相关系数良好（即 >0.95）。
         5. 分析熔解曲线，确认仅存在单一扩增产物（即单峰）。
            1. 若出现多个峰或峰形不一致，可能提示污染、错配或引物二聚体等（图 5）。
            2. NTC 中出现的峰通常对应引物二聚体，因无模板 cDNA 时更易形成，通常无需担忧。
         6. 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳验证熔解曲线结果。
            1. 制备 1% 琼脂糖凝胶（100 mL 体积）
               1. 称取 1 g 琼脂糖放入烧瓶中。
               2. 加入 100 mL 1x Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，微波加热至琼脂糖溶解且溶液澄清。
                  1. 1 L 50x TAE 缓冲液含 2 M Tris 碱、57 mL 冰醋酸和 0.05 M EDTA（pH 8.0）。
                  2. 用蒸馏水将 TAE 缓冲液稀释至 1x（终浓度：40 mM Tris-乙酸和 1.0 mM EDTA）。
               3. 待凝胶冷却至 55°C 后，加入溴化乙锭至终浓度 0.5 μg/mL。
               4. 将凝胶倒入制胶托盘，室温静置凝固。
            2. 电泳时，将凝胶置于含 1x TAE 的电泳槽中，取 qPCR 板中 10 μL 样品与 2 μL 6x 上样染料混合，充分混匀后与分子量标记一同上样。
            3. 以 50–150 伏电压电泳，直至指示剂迁移至合适距离，具体取决于预期 cDNA 产物大小。
            4. 使用紫外透射仪观察。
            5. 确认扩增的 PCR 产物大小符合目标预期。
            6. 引物二聚体大小约为 50 bp。
   2. 预筛 TNF-α 升高。
      1. 由于 TNF-α 在外周启动炎症反应，我们推测其在脑内亦如此，因此在进行全芯片分析前，以 TNF-α mRNA 的初步筛查作为脑片培养免疫状态（即正常、假手术和实验组）的标志。
      2. 若正常组和假手术对照组的 TNF-α mRNA 水平不在本实验室的批间可接受范围内，则丢弃所有实验（即正常、假手术和实验组），不进行全芯片分析。
      3. iScript cDNA 合成。
         1. 对每个 RNA 样品，在 PCR 管中加入以下组分：4 μL 5x 反应混合液、1 μL 逆转录酶、25 ng RNA，以及无 RNase 的 H₂O，定容至 20 μL。
         2. 轻轻吹打混匀，短暂离心。
         3. 孵育程序：25°C 5 分钟；42°C 30 分钟；85°C 5 分钟。
         4. 1:4 稀释（加入 60 μL 无 RNase 水）。
         5. 储存于 -20°C 或置于冰上，数小时内使用。
      4. qPCR 检测 TNF-α。
         1. 为每对引物制备主混合液。
            1. 每样品混合 12.5 μL iQ SYBR green、1 μL 引物混合液和 10.5 μL 水。
            2. 对于 Rpl13a 和 TNF-α 引物，200 nM 为最佳浓度。
            3. 根据需要在 1.5 mL RF 微量离心管中调整引物量和水量，并在设置 PCR 板时置于冰上。
         2. 设置 qPCR 板，包含对照/假手术/实验组。每基因每样品取 1 μL cDNA，设双重复。
         3. 每孔加入 24 μL 主混合液，吹打混匀。
         4. 务必避免产生气泡，因其会干扰荧光读数。
         5. 运行 40 个 PCR 扩增循环：
            1. 95°C，8.5 分钟；
            2. 40 个循环：95°C 10 秒；60°C 30 秒；72°C 20 秒/循环。
            3. 熔解曲线：55°C 1 分钟；从 55°C 开始，80 个循环，每循环升温 0.5°C，持续 10 秒。
      5. 数据分析（ΔΔCt 法；图 4）。¹³
6. 用于 PCR 芯片的 cDNA 合成。
   1. 计算每份样品含 250 ng RNA 所需体积（μL）。
      1. 选择一个您能从样品中稳定提取的 RNA 量（100 ng 至 1 μg）。
   2. RT² 第一链合成试剂盒——按制造商说明书操作。简要步骤如下：
      1. 解冻并短暂离心所有试剂。
      2. 对每个 RNA 样品，在 PCR 管中加入以下组分：
         1. 250 ng RNA、2 μL 5x 基因组 DNA（gDNA）消除缓冲液，以及无 RNase 水，定容至 10 μL。
      3. 轻轻吹打混匀，短暂离心。
      4. 42°C 孵育 5 分钟。
      5. 冰上冷却 1 分钟。
      6. 同时，准备逆转录（RT）预混液（每样品）：
         1. 混合 4 μL 5x RT 缓冲液 3、1 μL 引物和外源对照混合液、1 μL RT 酶混合液 3，以及 3 μL 水。
      7. 向每份样品中加入 10 μL RT 预混液，轻轻混匀。
      8. 42°C 孵育 15 分钟。
      9. 95°C 孵育 5 分钟以终止反应。
      10. 向每 20 μL cDNA 合成反应中加入 91 μL 无 RNase 的 H₂O（稀释至终体积 111 μL）。
      11. 吹打混匀。
      12. 储存于 -20°C 或置于冰上，数小时内使用。
7. RT² Profiler PCR 芯片。
   1. 以下说明遵循制造商指南，此处为方便起见重述。
   2. 试剂准备
      1. 解冻并短暂离心所有试剂。
      2. 制备实验预混液：
         1. 混合 1350 μL 2x SABiosciences RT² qPCR SYBR Green Master Mix、102 μL 稀释的 cDNA 和 1248 μL 无 RNase 的 H₂O，定容至 2700 μL。
      3. 小心从密封袋中取出 PCR 芯片。
      4. 将预混液加入加样储液槽中。
      5. 使用多通道移液器向每孔加入 25 μL。
      6. 小心密封 PCR 芯片板。
      7. 于室温以 10,000 rpm 离心 1 分钟。
      8. 置于冰上，直至 PCR 程序准备就绪。
   3. 运行适用于您仪器的循环程序。
      1. iCycler：
         1. 95°C，10 分钟
         2. 40 个循环：95°C 15 秒；60°C 1 分钟。
         3. 熔解曲线：55°C 1 分钟；从 55°C 开始，80 个循环，每循环升温 0.5°C，持续 10 秒
   4. 数据分析。
      1. 基线循环选择“自动计算”。
      2. 阈值位置选择“用户定义”，手动设置阈值。
         1. 在“对数视图”中，将阈值设于扩增曲线线性相的下三分之一处。
         2. 确保各次运行间阈值保持一致。
      3. 导出数据。
      4. 输入 Excel 文件。
      5. 上传至 SABiosciences PCR 芯片数据分析平台。
         1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
         2. 选择内参基因——我们使用 Rpl13a。
      6. 我们的常规做法是：
         1. 通过至少一次重复 PCR 芯片验证结果。
         2. 3 倍以上的表达变化无需通过后续特异性靶标 PCR 扩增验证。^6,7
         3. 小于 3 倍的变化应通过后续特异性靶标 PCR 扩增或使用 2–3 次 PCR 芯片验证（以确认 2 倍变化）。
   5. DNA 预扩增用于分析预期表达极低的靶标（图 6）。
      1. SABiosciences 的 RT² Nano PreAMP cDNA 合成试剂盒及引物混合液专为 RNA 预扩增设计，可使用少量（1–100 ng）RNA 样品完成全 PCR 芯片分析。
      2. 每种引物混合液可对 89 个基因特异性 cDNA 靶标进行扩增，且偏差最小。我们已使用该系统将 IFN-λ 等低水平信号扩增至可检测水平。
      3. RT² Nano PreAMP cDNA 合成试剂盒——按制造商说明书操作。简要步骤如下：
         1. 解冻并短暂离心所有试剂。
         2. 对每个 RNA 样品，在 PCR 管中加入以下组分。
            1. 1–100 ng RNA、2 μL 5x gDNA 消除缓冲液，以及无 RNase 水，定容至 10 μL。
         3. 轻轻吹打混匀，短暂离心。
         4. 42°C 孵育 5 分钟。
         5. 冰上冷却 1 分钟。
         6. 同时，准备 RT 预混液（每样品）。
            1. 混合 4 μL 5x RT 缓冲液 3、1 μL 引物和外源对照混合液、1 μL cDNA 酶合成混合液、1 μL RNase 抑制剂，以及 3 μL 水。
         7. 向每份样品中加入 10 μL RT 预混液，轻轻混匀。
         8. 42°C 孵育 15 分钟。
         9. 95°C 孵育 5 分钟以终止反应。
         10. 储存于 -20°C 或置于冰上，数小时内使用。
      4. 使用特异性引物进行 cDNA 扩增。
         1. 在 PCR 管中混合以下组分：
            1. 12.5 μL PCR 主混合液、7.5 μL 特异性引物和 5 μL 未稀释的 cDNA。
         2. 运行 12 个 PCR 扩增循环。
            1. 95°C，10 分钟。
            2. 12 个循环：95°C 15 秒；60°C 2 分钟。
            3. 4°C 保存。
         3. 向每份样品中加入 2 μL 侧反应抑制剂。
         4. 37°C 孵育 15 分钟。
         5. 95°C 孵育 5 分钟以终止反应。
         6. 向每 27 μL cDNA 扩增反应中加入 84 μL 无 RNase 水。
      5. 储存于 -20°C 或置于冰上，数小时内使用。
      6. 使用 SAB 引物和 SYBR green 主混合液，按上述方法扩增单个基因靶标。

4. 细胞因子信号传导的多重磷酸化蛋白检测

1. 使用多重磷酸化蛋白检测法来定义细胞因子配体-受体下游信号通路（图7）。
2. 测定脑片培养物中的总蛋白含量。
   1. 轻轻将脑片从插入物上取下，收集至1 mL冰冷（4°C）的PBS中。
   2. 离心管30秒，吸除PBS。收集完成后立即置于干冰上。
   3. 于-80°C保存。
3. 对脑片培养物进行匀浆以进行总蛋白检测。
   1. 根据制造商说明书配制细胞裂解缓冲液。
      1. 加入蛋白酶抑制剂至所需总体积的缓冲液中，确保每份脑片培养物至少加入200 μL裂解缓冲液。
         1. 例如：向4.95 mL细胞裂解缓冲液中加入20 μL因子1、10 μL因子2以及20 μL溶于DMSO的500 mM PMSF。
   2. 在冰上用200 μL裂解缓冲液解冻脑片培养物。
   3. 超声处理脑片培养物，每次1秒，共5次，处理后立即放回冰上。
   4. 涡旋样品10秒。
   5. 在4°C、13,000 rpm条件下离心15分钟。
   6. 将上清液转移至洁净离心管中，并保持在冰上。
4. 进行总蛋白检测。
   1. 配制蛋白标准品。
      1. 根据制造商说明书复溶牛血清白蛋白（BSA）储备液。
      2. 用高纯度水稀释，配制浓度范围为0–1000 μg/mL的标准品溶液，用于BCA蛋白检测。
   2. 根据样品数量和重复次数计算所需工作试剂的体积。
      1. 例如：(8个标准品 + 18个未知样品) × (每个样品2个重复) × (每孔需0.2 mL工作试剂) = 微孔板上所有样品共需10.4 mL总体积。
         1. 向上取整至12 mL总体积，以确保试剂充足。
      2. 将试剂A与试剂B混合配制工作试剂时，可能出现轻微浑浊，但应很快消失。
   3. 每孔加入10 μL样品和标准品。
   4. 每孔加入0.2 mL工作试剂。
   5. 用封板膜覆盖微孔板，振荡30秒以混匀。
   6. 在37°C孵育30分钟。
      1. 孵育结束后，将微孔板冷却至室温（约10分钟），然后在酶标仪上于595 nm波长处读取吸光度。
   7. 使用Microsoft Excel绘制标准曲线，以测得的吸光度为纵坐标，预期浓度为横坐标。
      1. 良好的相关系数应等于或大于0.98。
   8. 根据标准曲线的线性方程计算各样品的蛋白浓度。
   9. 用裂解缓冲液将样品稀释至相同蛋白浓度，并于-80°C保存，直至进行后续实验。
   10. 根据制造商说明书，蛋白浓度应在200–900 μg/mL范围内。
5. 进行多重检测。
   1. 注意：多重磷酸化蛋白检测总共需要2天完成，第一天需1小时进行初始设置和加样，随后进行过夜孵育；第二天进行额外的孵育和洗涤步骤。
   2. 根据试剂盒说明书中的工作表，规划各孔所对应的裂解液位置。
   3. 将匀浆组织样品和试剂盒中的裂解液在室温下解冻，然后置于冰上。将试剂盒中提供的所有缓冲液和试剂恢复至室温（链霉亲和素和微珠除外）。
   4. 为多重检测准备微珠。
      1. 用铝箔包裹含有偶联微珠的离心管以避光。涡旋5秒后置于冰上。
      2. 用洗涤缓冲液将偶联微珠按1:50稀释。
         1. 每孔应含有1 μL偶联微珠和49 μL洗涤缓冲液，总体积为50 μL。
   5. 校准真空装置。
      1. 每孔加入100 μL洗涤缓冲液清洗微孔板。
      2. 开启真空泵，在2–5秒内吸除多余液体。
         1. 若完全去除缓冲液所需时间超过或少于2–5秒，应相应调节压力阀。
         2. 加样前务必彻底干燥微孔板底部。
   6. 涡旋稀释后的偶联微珠5秒，每孔加入50 μL。
      1. 立即进行真空过滤，并用纸巾擦干微孔板底部。
   7. 每孔加入100 μL洗涤缓冲液，洗涤两次。每次洗涤后均需彻底干燥微孔板底部。
   8. 涡旋解冻后的样品3秒，每孔加入50 μL。盖上封板膜，于室温避光、300 rpm振荡孵育15–18小时。
   9. 真空过滤去除多余液体，每孔用100 μL洗涤缓冲液洗涤三次。每次洗涤后均需彻底干燥微孔板底部。
   10. 用洗涤缓冲液将检测抗体按1:25稀释。
       1. 每孔需在25 μL洗涤缓冲液中加入1 μL检测抗体。
   11. 盖上封板膜，并用铝箔包裹以避光。振荡30秒，逐渐加速至1100 rpm，随后在室温下继续以300 rpm振荡30分钟。
   12. 真空过滤微孔板，并用100 μL洗涤缓冲液每孔洗涤三次。每次洗涤后均需彻底干燥微孔板底部。
   13. 在避光条件下，配制链霉亲和素-PE溶液，按1:100稀释，总体积应足以每孔加入50 μL。溶液需避光保存。
   14. 充分涡旋后，每孔加入50 μL稀释的链霉亲和素-PE。先以1100 rpm振荡30秒，随后在300 rpm下继续振荡10分钟。
       1. 真空过滤去除多余缓冲液。
       2. 每孔用100 μL重悬缓冲液洗涤三次。
       3. 每次洗涤后均需彻底干燥微孔板底部。
   15. 每孔加入125 μL重悬缓冲液，以1100 rpm振荡30秒。
   16. 立即读取数据，或在4°C避光保存最多24小时。

5. 模拟与调控细胞因子信号传导

1. 使用重组细胞因子蛋白（含载体）模拟 SD 的变化。
   1. 冻干蛋白（例如 TNF-α）可在 -20°C 下保存长达 1 年。
   2. 用含 0.1% 牛血清白蛋白的溶液稀释至储存液后，分装保存于 -20°C，3 个月内使用。
   3. 对脑片培养物进行的任何操作至少每三天更新一次。
2. 通过以下方式抑制细胞因子信号传导：
   1. 使用传统的细胞因子信号通路药理学抑制剂；
   2. 使用可溶性配体拮抗剂［例如可溶性 TNF 受体 1（如上文重组配体所述）］；或
   3. 基因沉默［即小干扰 RNA（siRNA）］。
3. 将 siRNA 递送至神经元细胞通常存在困难。
   1. 常用的脂质转染试剂通常导致转染效率低且细胞活力下降。
   2. 因此，我们采用 Thermo Scientific 的 Dharmacon Accell siRNA，可在无需转染试剂的情况下实现高效基因沉默。
   3. 此处展示对亲环素 B（cyclophilin B）的基因敲低效果，该蛋白为在所有细胞类型中表达的非必需蛋白，用以验证该方法在脑片培养物中的适用性。
   4. 递送方案根据制造商提供的贴壁细胞使用说明，针对脑片培养物进行了优化调整。
      1. 用无 RNase 的水将 5x siRNA 缓冲液稀释至 1x。
      2. 在 1x 缓冲液中配制 100 μM 的 siRNA 溶液
         1. 亲环素 B siRNA 提供量为 5 nmol。将其溶于 50 μL 的 1x 缓冲液中，制成 100 μM 储存液。
      3. 将 siRNA 与 Accell 递送培养基混合，使 siRNA 的终浓度为 1 μM。
         1. 在 6 孔板中，将 11 μL 的 100 μM siRNA 储存液加入 1100 μL 的 Accell 递送培养基中。
         2. 放入培养箱，使温度至少平衡 20 分钟，达到正常培养条件。
      4. 在 BSL-2 生物安全柜内采用无菌操作技术，将培养插件转移至含有递送混合液的孔中。
      5. 1. 用递送混合液孵育 96 小时以实现蛋白敲低。
            1. 通过 Western blot 或增强型免疫染色评估蛋白敲低效果。
            2. 尽管 Western blot 可作为评估敲低效率的首选方法，但其灵敏度可能不足以检测与无损伤性 SD 现象相关的低水平免疫信号。
            3. 因此，我们在 Western blot 检测结果为阴性后，采用银增强二氨基联苯胺（DAB）免疫染色结合计算机辅助密度测定法进行后续验证（见下文）。

6. 蛋白质组学验证

1. 使用免疫染色确定磷酸化蛋白变化的细胞特异性。^6,7
   1. 用 PLP 固定液固定脑片培养物 24 小时，固定液成分为：
      1. 10 mL 16% 多聚甲醛，1.096 g 赖氨酸，0.42 g 磷酸钠，0.17 g 高碘酸钠，用超纯水定容至总体积 80 mL（固定液 pH 为 6.2）。
      2. 24小时后，用细刷轻轻将切片培养物从插入物中取出，转移至含叠氮化钠（100 mg/L）的PBS中，待后续切片。
      3. 然后，将脑片在 PBS-20% 蔗糖中孵育至少 24 小时，切割整个脑片培养物 20 μm 切片并置于经凝胶包被的载玻片上。
      4. 荧光免疫染色（例如针对 NFκB）按如下步骤进行，所有步骤均在约 50 rpm 振荡条件下进行。
         1. 用 3 mL PBS 清洗切片培养物，每次 10 分钟，共洗三次。
            1. 将载有标本的载玻片放置 20 μm 在 Coplin 瓶中使用约 40 mL PBS 进行所有洗涤步骤的切片培养。
         2. 用 PBS 清洗脑片培养物三次，每次 10 分钟。
         3. 在切片培养物上滴加数滴 SFX 信号增强剂，并于湿润环境中孵育 30 分钟。
         4. 将脑片培养物孵育 2 小时 37°C 使用 PBS 中含 0.75% Triton X-100 的溶液将兔抗 NFκβ 抗体按 1:100 稀释后进行孵育。
            1. 将抗体溶液直接滴加到切片上。
         5. 从抗体溶液中取出切片，在 PBS 中清洗三次，每次 10 分钟。
         6. 将切片置于含0.75% Triton X-100的PBS中，按1:50比例加入山羊抗兔AlexaFluor 594抗体，在室温下孵育1小时。
            1. 将AlexaFluor 594抗体在10,000 rpm转速下离心15分钟，以去除溶液中可能形成的任何沉淀。
         7. 用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
         8. 将玻片浸入蒸馏水中，以冲洗掉 PBS 中的任何盐分。
         9. 用 ProLong 抗荧光淬灭介质封片，避光覆盖，干燥至少 2 小时。
         10. 使用传统或共聚焦显微镜观察图 7荧光显微镜。
2. 通过增强传统的DAB免疫染色法，可灵敏地检测siRNA敲低引起的蛋白质表达变化⁷ 通过银增强法¹⁶ 以及随后的密度测定定量（例如，此处所示的亲环素B）（视频图2）。
   1. 免疫染色检测亲环素B遵循我们近期详述的明场成像标准操作流程，⁷ 使用：
      1. 抗小鼠亲环素B（1:100），4°C孵育24小时 4°C;
      2. 随后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:100）孵育；
      3. 以及DAB显色。
   2. 如果DAB反应过浅，无法进行数字密度测定定量17，可根据Quinn和Graybiel的方法，采用差异银染法增强信号。¹⁶
      1. 重新水化载玻片，然后用高纯度水彻底洗涤 3 次，每次 10 分钟。
      2. 将载玻片放入盛有高纯度水的考普林瓶中并加热至 56°C.
      3. 配制氨性硝酸银溶液（0.5%）：
         1. 氯化铵储备液（25–30%）用高纯度水新鲜稀释（1:1）。
         2. 加入氢氧化铵（~500-600 μL 每100 mL）逐滴加入0.5%硝酸银溶液中，同时搅拌，溶液会短暂变浑浊，随后变澄清。
         3. 将溶液加热至 56°C.
         4. 孵育切片10-12分钟。
      4. 用高纯度水冲洗载玻片15秒（此步骤及后续所有步骤均在室温下使用柯铂林瓶进行）。
      5. 将玻片在1%硫代硫酸钠（五水合物）中浸渍15秒。
      6. 在高纯水中浸渍15秒。
      7. 用0.2%氯化金溶液对切片进行染色2分钟。
      8. 将载玻片浸入高纯度水中 15 秒。
      9. 将切片置于0.5%草酸中处理2分钟。
      10. 将切片在高纯度水中浸泡15秒。
      11. 用5%硫代硫酸钠处理载玻片5分钟。
      12. 用高纯度水彻底清洗载玻片，脱水后封片。
      13. 载玻片现已可进行密度测定定量分析。¹⁷
          1. 所有设备，包括明场照明，均需在成像前至少开启20分钟。
          2. 使用倒置显微镜以5-10倍物镜对整个脑片培养样本进行成像。
          3. 光照强度设定为统一水平（例如，~2.6 V），并在所有图像采集过程中保持不变。
             1. 根据需要使用中性密度滤光片，将整幅图像的透射光强度降至12位尺度（0-4095）上的约1500，其中“0”为完全黑色，4095为完全白色。
          4. 然后对所有样本（即假手术对照组和实验组样本）进行数字图像的采集，并以电子方式存储，包括从载玻片上无脑片培养区域获得的背景图像。
          5. 从所有图像（假处理和实验组）中减去背景图像，并在每份脑片培养周围绘制感兴趣区域（AOI），记录透射光强度。
          6. 图像强度范围在所有实验中均设置为恒定范围。
          7. 为便于理解，结果以相对于对照组水平的相对密度表示（图 8).

7. 代表性结果：

图1. 脑片培养物的电生理记录范式。 首先将记录微电极置于CA3区锥体神经元层，然后将双极刺激电极置于齿状回（DG）。

图 2. CA3 诱发场电位及突触诱导的扩散性抑制。（A） 实验首先确定产生最大标准 CA3 区域场电位反应所需的电流，随后采用半最大强度来诱发 CA3 区域的场电位。此步骤用于记录不同切片之间诱发突触反应的正常性。若某切片的兴奋性突触后电位幅度不足 3 mV，则该切片被弃用。（B） 接着，在通过场电位（左侧，快速反应）确认切片能够耐受 10 Hz 刺激（例如，快速电位记录中垂直偏移的幅度相近）的同时，测定跨突触诱发扩散性抑制的阈值（右侧，慢反应）。

图 3. 小胶质细胞运动与突触活动减少相关。 证据表明，小胶质细胞的分支会随着突触活动增强而延伸和回缩，但在未受损大脑中，这些细胞对突触活动产生长距离移动的现象尚未见报道。我们利用荧光标记的凝集素 IB4 对小胶质细胞进行标记的结果显示，在正常条件下，部分小胶质细胞可进行长距离迁移。此外，当通过河豚毒素处理培养物以完全阻断突触活动时，迁移的小胶质细胞数量显著增加，如随附图像所示。红线标记了小胶质细胞在6小时内的移动路径，蓝箭头标记了若干代表性小胶质细胞的起始位置。标尺，50 μm。

图4. PCR筛选活动。（A） 我们使用TRIzol结合Qiagen试剂盒进行RNA提取，因为据我们经验，该方法获得的RNA产量显著更高（P < 0.05），且重复性优于单独使用任一种方法。 < 0.001；t检验）海马脑片培养物的RNA得率高于单独使用Qiagen试剂盒。 （B） 此外，我们定期确认，通过凝胶电泳显示清晰的RNA条带，证明我们的RNA提取程序能够获得高质量的完整RNA。 （C） 我们使用 NormFinder 软件选择稳定性最佳的参考基因。例如，对暴露于脂多糖（100 ng/mL，持续 2 小时）的脑片培养物检测了三个参考基因（Rpl13a、β-actin、18s）的 Ct 值，并用于计算稳定性值。我们的数据（以及采用扩散性抑制的其他实验数据，未显示）表明，Rpl13a 是最适合作为参考基因的选项。（D）我们采用“ΔΔCt”法作为灵敏且可重复的方法，用于检测实验组与假处理对照组之间 RNA 表达倍数变化的差异。

图5. PCR反应检测。（A） 我们通过测定引物的稀释曲线扩增情况来验证PCR反应的质量。例如，理想的扩增应显示循环阈值（Ct）呈均匀（1-5）增加。（B） 相比之下，使用较差引物时扩增不均匀（1-5）。（C） 此外，我们在PCR检测结束后进行熔解曲线分析，以确认检测到的是目标扩增产物（即出现单一峰形曲线），这表明不存在任何双链DNA，包括引物二聚体、污染DNA或错配的PCR产物（这些会表现为多个峰形曲线）。

图6. Nano预扩增技术可实现海马脑片培养物中IFN-λ的检测。 由于每片脑片培养物中仅存在约50个T细胞（总细胞数约为55,000–90,000），我们采用RT² nano PreAMP cDNA合成试剂盒来检测IFN-λ可能存在的极低水平表达。该cDNA预扩增方法使RNA检测灵敏度提高了12倍。上述结果展示了预扩增在提升检测灵敏度方面的效能。参照基因Rpl13a在初始扩增中的Ct阈值为20.5，使用预扩增试剂盒后降至14.1，相当于cDNA经过12个PCR扩增循环，灵敏度提高12倍。与此同时，未使用预扩增时IFN-λ无法被检测（0.0），而经预扩增后其Ct值为29.0，处于良好可检测范围内。

图 7. 天然细胞因子通路磷酸化蛋白的磷酸化变化。 (A) TNF-α 预处理（即神经保护作用）对海马脑片培养物在兴奋性毒性损伤后 24 小时天然细胞因子通路磷酸化蛋白磷酸化的影响示例。结果显示，在暴露于 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）之前，经 100 ng/mL TNF-α 预处理 3 天的脑片与仅暴露于 NMDA 的脑片（即实验组 vs. 假处理组）在 CA1 区域的变化，以百分比表示。注意，TNF-α 引发了 JNK 和 ATF-2 的持续性磷酸化增强，以及 NFκB 的短暂性升高。 (B) 通过免疫染色（红色）揭示 NFκB 激活（即磷酸化 NFκB 在细胞核中的存在）的空间分布。YoYo 将脑片切片中的细胞核染成绿色［例如星形胶质细胞（箭头）］。锥体神经元原本也应呈绿色，但由于同时标记了磷酸化 NFκB（红色），因此呈现黄色。标尺，25 μm。

图8. siRNA 效率的蛋白质组学验证。 经过银增强的过氧化物酶-二氨基联苯胺免疫染色显示，亲环素B在施加200、500或1,000 nM siRNA 3天后，可显著降低海马脑片中亲环素B的全组织表达水平（P < 0.001；采用ANOVA-Holm-Sidak法）。

讨论

SD 是一种阵发性脑功能紊乱，其特征在迄今为止研究的所有物种和脑区中均高度保守。SD 通常在新皮层中进行研究。然而，与海马相比，新皮层的神经环路更为复杂，且难以维持新皮层组织在体外的长期存活 体外 具有长时间静息状态的免疫功能，使其作为 体外 用于定义SD易感性长期后果的制备。相比之下，海马不仅是对SD最敏感的脑结构，还是一种古皮层结构，具有更简化的神经环路结构与功能，非常适合用于阐明神经活动通过神经免疫机制调节SD易感性的方式。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基础伊格尔培养基	Invitrogen	21010
厄尔平衡盐溶液	Sigma	E2888
马血清	Invitrogen	26050-088
Glutamax	Invitrogen	35050
庆大霉素	Invitrogen	15710-064
Fungizone	Invitrogen	15295
D-葡萄糖	Sigma	G8769
表1. 培养物制备与维持：马血清培养基
[标题]
Neurobasal	Invitrogen	21103
Gem-21 Neuroplex	Gemini Bioproducts	400-160-010
Glutamax	Invitrogen	35050
庆大霉素	Invitrogen	15710-064
D-葡萄糖	Sigma	G8769
抗坏血酸	Sigma	A4544
Fungizone	Invitrogen	15295
氯化钠	Sigma	S6546
氯化镁	Sigma	M1028
氯化钙	Sigma	21115
表2. 培养物制备与维持：无血清培养基
[标题]
Millicell-CM 组织培养小室（30 mm）	赛默飞世尔科技	PICM0-3050
6孔Falcon培养皿	Thermo Fisher	08-772-1B
Sytox Green	Invitrogen	S7020
表3. 材料制备：接地电极
[标题]
玻璃毛细管	A-M Systems, Inc.		2 mm × 1.16 mm，4 英寸
KCl	Sigma	P5405
琼脂	Fisher Scientific	A360
EDTA	Sigma	5134
导管	Masterflex	95809-34
1.5 mL 离心管架	Fisher Scientific
银丝	医学快讯	AG15X
止血钳	精细科学工具	13018-14
抛光板	沃尔格林
闪烁小瓶	Fisher Scientific
可变性粘附密封剂	奇妙的黏性物质
漂白	Clorox
表 4. 材料制备：接地电极
[标题]
硼硅酸盐细丝	Sutter Instruments	BF150-86-10	1.5 x 0.86 mm
显微镜–电极拉制仪	Narashige	PE-2
目镜光学测微尺	蔡司
光学显微镜测微尺	蔡司
复合显微镜	蔡司
显微镜载玻片	Surgipath	00210
一维微管–电极操纵器	Narashige	MO-10
三维显微–电极操作器	Narashige	MM-3
黏性腻子	苏格兰威士忌
100 mm Nalgene 容器	Fisher Scientific
表5. 材料制备：记录电极
[标题]
铂铱合金镀铁氟龙导线	A-M Systems	7780	125 μm 裸露的， 200 μm 包被的
镊子	Thermo Fisher	13-812-38
止血钳	精细科学工具	13018-14
30号导线	Tensolite
电烙铁	库珀工具	UTC 100
焊料	Bernzomatic		树脂芯，无铅，含银
浓盐酸	Fisher Scientific	A144-212
巴斯德移液管	Fisher Scientific	13-678-30
防水环氧树脂	JB Weld
香蕉杰克	纽瓦克电子
表6. 材料制备：刺激电极
[标题]
Falcon 35 mm 培养皿	Becton Dickinson 实验室耗材
玻璃丝毛细管	Sutter Instrument Co.	BF100-58-10	1.0 mm，12 mm 长
棉片	Walgreens
镊子	Thermo Fisher	13-812-38
导管	Masterflex	95809-34
聚氯乙烯薄膜	Fisher Scientific	01810	18英寸 x 1000英尺
#9 单刃剃须刀片	Smith
表7. 材料制备：记录培养皿
[标题]
记录室	Medical Systems Corp.	PDMI-2	记录室
双极温度控制	Medical Systems Corp.	TC-202
组合式pH电极	Microelectrodes Inc.	MI-413
pH计	贝克曼	250	电池供电
微型T型热电偶	Physiotemp		IT系列
DigiSense 温度计	Cole-Palmer	8528-10
内联加热器	Warner Instruments	SH278
直布罗陀桌	Burleigh
倒置显微镜	徕卡	DMIRE2
防振台	技术制造商’s Corp	63-541
电烙器	双子座		电池供电
显微镜–电极显微操作器	Narashige	WR60	左侧和右侧
稳压电源	MGE UPS 系统	Ellipse 1200	±5 伏特（共 120 个）
Axoprobe 放大器系统	Axon Instruments	1-A
活动筛选器	频率设备	Model 900
Axoscope Digidata	Axoscope	1322-A
Axoscope 软件	Axoscope	第9期
计算机系统	Dell	Precision T5400
Origin8	OriginLab Corp	8.1版
刺激器隔离单元	Bak Electronics, Inc.	BSI-II
1/2英寸位置磁铁	Dexter	PMO90-3
3英寸位置磁铁	Dexter	PMC-800T
多个 X-方块	Narishige	X-12	用于定位球形关节
阀门	Hamilton	HVD-3	用于培养基递送
注射泵	Razel	A99
数字示波器	安捷伦科技
数码相机系统	定量电子显微镜	512-SC
MetaMorph 软件	Molecular Devices	7.5.04 版
使用Pi foc进行显微镜物镜聚焦	Physik Instrumente	E-662.LR
智能快门	Lambda SC
双波长荧光显微镜	应用科学仪器	多色染色 II
蠕动泵	Masterflex	77120-62
吸液器	哈佛仪器		PDMI 组件
表8. 电生理实验装置
[标题]
1 M 氯化镁	Sigma	057K8620
1 M 氯化锰	Sigma	018K6107
1 M 氯化钙	Sigma	GA10984
AlexaFluor594 标记的异凝集素-IB4	Invitrogen	I21413
Neurobasal	Invitrogen	21103
聚氯乙烯薄膜	Fisher Scientific	01810
MetaMorph	Molecular Devices	7.5.04 版
倒置显微镜	Leica	DMIRE2
相机	QuantEM	512SC
紫外光	Kubler	CODIX
双极温度控制器	Medical Systems Corp	TC-202
智能快门	Lambda SC
Sytox Green	Invitrogen	S7020
Falcon 35 mm 培养皿	Becton Dickinson Labware
玻璃毛细管	Sutter Instrument Co.	BF100-58-10	1.0 mm，12 mm 长
导管	Masterflex	95809-34
记录室	Medical Systems Corp.	PDMI-2	记录室
双极温度控制	Medical Systems Corp.	TC-202
复合pH电极	Microelectrodes Inc.	MI-413
直布罗陀桌	Burleigh
防振台	技术制造商’s Corp	63-541
表9. 海马脑片培养物中的活体成像
[标题]
RNA稍后	Ambion	AM7021
无RNase/DNase的1.5 mL微量离心管	USA Scientific	1615-5500
金刚石刀	精细科学工具	10100-00
细头画笔	Ted Pella	11806
TRIzol	Invitrogen	15596-026
离心	Eppendorf	5451C
Vortex-genie	VWR	G-560
表 10. PCR制备：脑片培养物收获
[标题]
氯仿	Sigma	C-2432
离心	Eppendorf	5451C	在冷室中
分子生物学用200度乙醇	Sigma	E7023
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004
表11. PCR 准备：RNA 提取
[标题]
Nanodrop 2000	Thermo Fisher	ND-2000
3-(N-吗啉代)丙磺酸	Sigma	M-1254
ssRNA标准参照物	NEB	N032S
乙酸钠	Sigma	S-9513
EDTA	Sigma	E5134
溴化乙锭溶液	Bio-Rad	161-0433
OWL easycast 水平微型凝胶电泳系统	Thermo Fisher	B1
电泳电源	Bio-Rad	PowerPac HC
超纯琼脂糖	GibcoBRL	15510-019
微波	三星	SJ0390W
RNase 离开	分子生物制品	7000
表12. PCR 准备：RNA 定量
[标题]
iCycler 梯度PCR仪	Bio-Rad	iCycler 光学模块
iCycler 系统软件	伯乐（Bio-Rad）	3.1 版
iCycler iQ PCR 板，96 孔	Bio-Rad	2239441
平盖封板条——光学透明，8联管盖条	Bio-Rad	TCS0803
iScript cDNA合成试剂盒	Bio-Rad	170-8890
iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	170-8880
超纯琼脂糖	GibcoBRL	15510-019
10x TAE 缓冲液	GibcoBRL	15558-026
微波	Samsung	SJ0390W
RNase 离开	分子生物制品	7000
溴化乙锭溶液	Bio-Rad	161-0433
OWL easycast 水平微型凝胶电泳系统	Thermo Fisher	B1
电泳电源	Bio-Rad	PowerPac HC
名称	序列
TNF-α F	5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R	5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F	5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R	5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’
表13 PCR 实验操作：qPCR 引物优化与预筛选
[标题]
RT2 分析型PCR阵列	SABiosciences	PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA合成试剂盒	SABiosciences	C-06
室温2 Nano预扩增cDNA合成引物混合物	SABiosciences	PBR-3021
RT2 SYBR Green/荧光素qPCR预混液	SABiosciences	PA-011
室温2 大鼠 IFN-γ 的 qPCR 引物检测λ	SABiosciences	PPR45050C
多通道移液器	康宁
25 mL Bio-pure 储液罐（带分隔）	多元化生物技术	REBP-2000
iCycler 梯度PCR仪	Bio-Rad	iCycler 光学模块
iCycler 系统软件	Bio-Rad	3.1 版
表14. qPCR阵列板与低水平信号传导
[标题]
离心	Fisher Scientific	微型 7
细胞裂解试剂盒	Bio-Rad	171-304011
BSA 蛋白母液	伯乐（Bio-Rad）	500-0007
BCA蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225
封口胶带	Bio-Rad	2239444
96孔板读板仪	Perkin Elmer	1420-多标签计数器
磷酸化6重检测裂解液	Bio-Rad	X7000000502
磷酸化6重偶联微球	Bio-Rad	X700000050
表 15. 多重磷酸化蛋白检测
[标题]
Accell 5x siRNA 缓冲液	赛默飞世尔科技	B-002000-UB-100
Accell siRNA 递送培养基	赛默飞世尔科技	B-005000-100
Accell 亲环素 Pool-大鼠	Thermo Scientific	D-001920-30-05
表 16. siRNA
[标题]
16% 甲醛	Alfa Aesar	43368
赖氨酸	Sigma	L-6001
磷酸钠	Fisher Scientific	S374-1
高碘酸钠	Sigma	S-1878
叠氮化钠	Sigma	S-2002
冷冻切片机	徕卡	CM3050 S
Tissue-Tek	Ted Pella Inc.	27050
细头画笔	Ted Pella	11806
组织切片	Surgipath	00210
玻璃广口瓶	Fisher	08-815
过氧化氢（30%）	Sigma	H1009
SFX 信号增强剂	Invitrogen	A31631
山羊血清	科罗拉多血清公司	CS 0920
Triton X-100	Sigma	T-8787
抗NFκβ 抗体	圣克鲁斯	SC-109
山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012
yo-yo 核复染	Invitrogen	Y-3601
ProLong 抗荧光淬灭剂	Invitrogen	P7481
表 17 通过免疫组织化学进行蛋白质组学验证
[标题]
抗环孢素B	R&D 系统	MAB5410
3,3-二氨基联苯胺	Sigma	D8001
水浴锅	Pharmacia Biotech	56-1165-33	格布üder HAAKE GmbH
氨水	J.T.Baker	9721-03
硝酸银	Sigma	S-0139
硫代硫酸钠（五水合物）	J.T.Baker	3949-01	&（空格）
0.2% 氯化金	Sigma	G-4022
草酸	Sigma	O-0376
CoolSnap fx CCD相机	光度测量
MetaMorph 软件	Molecular Devices	7.5.04 版
倒置显微镜	徕卡	DM IRBE
中性密度滤光片	Chroma		0.5-3.0 光密度单位范围
表 18 通过银增强免疫组织化学进行蛋白质组学验证