高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

摘要

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位 原位杂交（ISH）方法用于可视化小鼠胎儿前列腺组织切片中mRNA表达的模式。该方法可轻松适用于可视化其他小鼠组织或其他物种组织中mRNA的表达模式。

摘要

下泌尿生殖道（LUT）的发育是一个复杂的过程。在雄性胎儿尿道形成前列腺的过程中，这种复杂性尤为明显，该过程依赖于雄激素信号以及上皮-间质间的相互作用^1,2。了解调控前列腺发育的分子机制，可能揭示在生命后期被异常重新激活的生长机制，从而导致良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的发生。

发育中的泌尿生殖窦（LUT）具有复杂的解剖结构。当前列腺芽体在受孕后16.5天（dpc）开始形成时，已存在多种细胞类型。血管、神经和平滑肌位于间质性间充质中³。该间质包裹着多层上皮，并通过雄激素受体依赖的旁分泌信号诱导胎儿前列腺的形成⁴。目前尚不完全清楚在前列腺发育过程中，间质中哪些雄激素受体响应基因是必需的，以及前列腺导管上皮如何响应这些基因而形成。精确识别细胞类型并定位其中特定因子的表达，对于进一步理解前列腺发育至关重要。原位杂交（ISH）技术可实现mRNA在组织内的定位。因此，该方法可用于确定信号分子及其受体的表达模式与时间，从而揭示潜在的前列腺发育调控因子。

本文介绍了一种高通量原位杂交（ISH）技术，用于鉴定胎鼠下泌尿生殖道（LUT）中mRNA的表达模式，所用组织切片由振动切片机切割而成。该方法相较于其他ISH方案具有多项优势。在载玻片上进行薄切片ISH在技术上较为困难；冷冻切片常存在组织结构质量差的问题，而冷冻切片和石蜡切片均常导致信号分辨率较弱。对整体组织进行ISH则可能导致探针滞留。相比之下，我们的高通量技术采用厚切片，可清晰显示组织精细结构。经改良的微量离心管便于在ISH过程中对切片进行操作。单个17.5天胎龄（dpc）LUT样本最多可同时筛查4种mRNA转录本，单次实验最多可检测24种mRNA转录本，从而降低成本并提高效率。该方法允许将多个处理组以完全相同的方式作为单一整体进行处理，避免数据分析中的偏差。对于前列腺研究者而言尤为关键的是，该方法可提供胎鼠尿道中低丰度和高丰度mRNA转录本在空间和时间上的精确定位，而尿道正是前列腺导管网络的发育起源。

方案

1. 从PCR扩增模板合成地高辛-11-UTP标记的核糖探针

1. 为合成基因特异性的核糖探针，使用 Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) 获取基因cDNA参考序列（RefSeq）。使用Primer3程序（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）⁵ 针对cDNA序列的3’区域设计基因特异性PCR引物。PCR引物选择的推荐参数详见其他资料（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）。
2. 使用 MegaBLAST 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）⁶ 通过设置0.01的EXPECT阈值，若所选DNA序列在RefSeq数据库中不与其他序列发生比对，则认为该DNA序列具有特异性。
3. PCR扩增核糖探针模板。应针对每对引物优化PCR反应组分及热循环条件。一个典型的50 μl反应体系包含：1X缓冲液，2 mM MgCl₂₂，0.2 mM dNTPs，1× Q 溶液，1 μg cDNA，2.5 U Taq DNA 聚合酶，0.25 μM 引物，以及无核酸酶的 H₂典型的热循环程序包括：94°C 预变性 2 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 94°C 变性 30 秒、57°C 退火 30 秒、72°C 延伸 1 分钟，最后在 72°C 延伸 10 分钟。PCR 反应中使用的 cDNA 是由小鼠泌尿生殖系统 mRNA 合成的。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，使用凝胶回收试剂盒进行纯化，并通过分光光度法对纯化产物进行定量。预期产量为1.2 - 3.6μg。
5. 将PCR产物转录为标记的核糖探针。转录反应体系（40 μl）包含：400 ng纯化的PCR产物、1×核苷酸标记混合物（含地高辛11-UTP）、1×转录缓冲液、5 U RNase抑制剂、80 U T7 RNA聚合酶以及无核酸酶的H₂O₂O. 37°C孵育3-4小时，每30分钟振荡混匀样品一次。
6. 使用 Qiagen RNEASY Mini 试剂盒，按照柱上 DNase 消化进行 RNA 纯化的说明，纯化核糖探针。通过分光光度法对核糖探针进行定量，预期产量为 4–20 μg。取部分样品在 1.5% 非变性琼脂糖凝胶上电泳，以评估探针质量。高质量的探针呈现清晰条带，弥散程度极低。
7. 为确保核糖探针特异性识别其靶标，首次原位杂交实验时应包含阳性对照组织。该阳性对照组织中，核糖探针所靶向的mRNA表达模式应已知。

2. 振动切片机刀片的制备（基于先前描述的方案）⁷

1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%低熔点琼脂糖溶液。将溶液放入微波炉中加热溶解琼脂糖，并维持溶液温度在62°C。
2. 通过移除直径为12 mm的Millicell培养板小室插入物的膜，制备聚苯乙烯环形模具，并保留聚苯乙烯环作为琼脂糖模具使用。每次使用前，将环在RNase抑制剂溶液中浸泡过夜。
3. 为确保切面光滑，用以下纯溶剂依次冲洗Wilkinson刀片表面，以去除防锈剂及其他添加剂：石油醚、二甲苯、氯仿、甲醇和MilliQ水。将双刃刀片沿长度方向分离为两个单刃刀片。
4. 用Loctite胶将Wilkinson刀片粘附于切片机刀片上。切片机刀片不用于切割，仅用于增强Wilkinson刀片的刚性。使用金属剪刀将切片机刀片裁剪至与Wilkinson刀片等长，并在粘合后使其边缘比Wilkinson刀片的切割刃后退3–4 mm。

3. 泌尿生殖组织的解剖、保存及切片前准备

1. 配制 PBSTw 溶液（含 0.1% Tween™ 20 和 0.2 mM 叠氮化钠的 PBS 溶液，经 0.22 μm Stericup® 滤器过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。
2. 将新鲜解剖的小鼠下泌尿道组织（LUT，包括膀胱、盆腔尿道以及相关的沃尔夫管和缪勒管来源结构）在含 4% 多聚甲醛固定液的 PBS 中于 4°C 过夜孵育。
3. 通过在梯度甲醇/PBSTw 溶液（体积比分别为 3:1、1:1、1:3）中于 25°C 每次洗涤 10 分钟，对组织进行脱水处理。样品随后在 100% 甲醇中于 –20°C 至少保存过夜。存档组织可在该条件下保存至少 2 年。
4. 为进行切片，需对存档组织进行再水化处理：在梯度甲醇/PBSTw 溶液（体积比分别为 3:1、1:1、1:3）中于 25°C 每次洗涤 10 分钟。
5. 解剖并弃除约三分之二的膀胱组织，保留大部分三角区与尿道相连。

4. 在琼脂糖中包埋泌尿生殖组织

1. 将聚苯乙烯环形模具的平面朝下放置在25°C的普通玻璃显微镜载玻片上。
2. 用62°C的琼脂糖溶液填充环形模具，并冷却约2分钟。
3. 从PBSTw中取出LUT组织，用吸水纸擦拭至干燥。
4. 将组织转移至琼脂糖溶液中。
5. 使用镊子调整LUT组织在琼脂糖中的方向，使其悬浮于环形模具顶部与底部之间的中间位置，并在4°C孵育，直至琼脂糖完全凝固。
6. 若组织在琼脂糖凝固过程中完全下沉，可将其从琼脂糖中切除并重新包埋。在重新包埋过程中，可根据需要调整琼脂糖的冷却时间。

5. 使用振动切片机对泌尿生殖组织进行切片（基于先前描述的方案）⁷

1. 将加强型 Wilkinson 刀片安装在振动切片机上，并将刀片角度设置为 35°。用 PBS 填充豪华型样本浴槽，并在样本浴槽周围放置湿冰。
2. 从环形模具中取出凝固的琼脂糖凝胶块，用吸水纸擦拭底部表面。确认组织方向正确。可通过使用剃刀刀片对琼脂糖凝胶块的平坦边缘进行斜切，以调整组织方向。
3. 如图 1A所示，使用 Loctite 胶将琼脂糖凝胶块粘附在振动切片机的样本安装盘上。
4. 将样本安装盘插入振动切片机中。
5. 将切片机的切片厚度调整为 50μm，速度调整为 2，刀片振幅调整为 4，然后开始切割组织切片。
6. 使用钝头镊子将每个组织切片（图 1B）转移至含有冰浴 0.5 mL PBSTw 的 24 孔细胞培养板孔中。
7. 为进行原位杂交（in situ hybridization）样品制备，切除组织切片周围大部分琼脂糖（残留的琼脂糖将在 ISH 过程中融化），并清除所有相关碎片。将切片在 4°C 的 PBSTw 中保存最多 48 小时。

6. 样品篮制备 原位 杂交

1. 在微量离心管的100μL刻度处切去管底。
2. 将切口边缘在火焰上加热至塑料软化，然后将微量离心管牢固地压在一块直径0.5英寸的聚酯网片中心。
3. 修剪多余的网片，并用加热的18号针头在每个管盖上穿刺两个孔，完成篮式装置的制备（图1C）。
4. 取下24孔板的盖子，在每孔正上方中心位置钻一个直径12mm的孔。在原位杂交（ISH）实验流程的洗涤步骤之间，使用该盖子转移样本篮（图1D）。

7. 胚胎粉末制备 原位 杂交（基于先前描述的方案）⁸

1. 采集与待检测组织切片处于相同发育阶段的小鼠胚胎组织，于 –80°C 保存。将冷冻组织放入陶瓷研钵中，浸入液氮，用研杵研磨成细粉。
2. 将胚胎粉末与 4 倍体积的丙酮混合，使用玻璃匀浆器（Dounce 匀浆器）反复研磨数次进行匀浆。
3. 将匀浆液转移至 15 mL 玻璃螺口瓶中，在 4°C 下提取过夜。
4. 在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，收集胚胎粉末沉淀，弃去含脂质的上清液。用 4 倍体积的新鲜丙酮重悬组织沉淀，在 4°C 下继续提取 2 小时。
5. 在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，再次收集胚胎粉末沉淀，弃去上清液。
6. 将沉淀物置于 Whatman #2 滤纸上空气干燥。研碎成细粉后，置于密封良好的玻璃瓶中，4°C 保存。每 1 g 胚胎湿重约可获得 50 mg 粉末。

8. 原位 杂交第一天

1. 将预杂交液（50% 甲酰胺、5x SSC、1% 封闭剂、10μg/mL 酵母 tRNA、10μg/mL 肝素，储存于 -20°C）预热至 60.5°C。该溶液可预先配制并储存于 -20°C。
2. 通过在小型塑料储存容器中加入约 0.5 英寸的自来水，制备加湿的杂交室。盖上容器并预热至 60.5°C。
3. 向 24 孔培养板的孔中加入 2mL PBSTw。将样品篮置于 24 孔板盖的孔洞中，并将组织切片转移至篮中（每个篮中最多可放置 10 片切片）。
4. 在含 6% H₂O₂ 的溶液中，25°C 下孵育组织切片 30 分钟。此步骤及后续所有孵育步骤均应在旋转摇床上轻柔振荡进行，除非另有说明。所有孵育和洗涤均在 24 孔板中进行，每孔使用总体积为 2mL 的溶液。
5. 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。
6. 在含 5μg/mL 蛋白酶 K 的 PBSTw 中，25°C 下孵育组织切片 12 分钟。
7. 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 1 次，每次 5 分钟。
8. 在含 4% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的 PBS 中，25°C 下对组织切片进行后固定 20 分钟。
9. 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 2 次，每次 5 分钟。
10. 每孔加入 2mL 预热的预杂交缓冲液，并将组织切片置于加湿的杂交室中，在 60.5°C 下孵育至少 1 小时。
11. 在每孔的预杂交缓冲液中加入 0.65μg 标记的核糖探针，并将组织切片在加湿的杂交室中于 60.5°C 下过夜孵育。

9. 原位 杂交第二天

1. 准备以下用于杂交后洗涤步骤的溶液：溶液1（50% 甲酰胺，5x SSC，1% SDS）、溶液2（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 M NaCl，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 过滤）和溶液3（2x SSC，50% 甲酰胺）。这些溶液可预先配制。溶液1和溶液3储存于-20°C，溶液2储存于25°C。溶液的保存期限至少为3个月。
2. 使用预热的溶液1，在60.5°C下对组织切片进行3次，每次30分钟的洗涤。洗涤过程中使用湿化室。
3. 使用预热的溶液1与溶液2按1:1（v/v）比例混合的溶液，在60.5°C下对组织切片进行1次10分钟的洗涤。洗涤过程中使用湿化室。
4. 在25°C下使用溶液2对组织切片进行4次，每次10分钟的洗涤。
5. 在含有0.25 μg/mL RNase的溶液2中，于37°C孵育组织切片15分钟。
6. 使用不含RNase的溶液2，在25°C下对组织切片进行1次10分钟的洗涤。
7. 在25°C下使用溶液3对组织切片进行1次10分钟的洗涤，随后在60.5°C下使用溶液3进行2次，每次1小时的洗涤。60.5°C的洗涤过程中使用湿化室。
8. 准备以下用于DIG标记核糖探针免疫组织化学检测的溶液：组织封闭缓冲液（TB，1x TBS，10% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.22 μm 过滤）、抗体稀释缓冲液（AD，1x TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 过滤）、抗体吸附缓冲液（AA，1x TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，6 mg/mL 胚胎粉）和TBSTw（1x TBS，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 过滤）。这些溶液可预先配制。TBSTw储存于25°C，其余所有溶液均储存于-20°C。
9. 在25°C下使用TBSTw对组织切片进行3次，每次10分钟的洗涤。
10. 将组织切片在TB缓冲液中于25°C孵育至少2小时。
11. 在组织切片于TB缓冲液中孵育的同时，为每个孔加入1.1 μL抗DIG抗体至200 μL AA缓冲液中。将AA缓冲液加抗体混合物于4°C孵育至少2小时，然后以10,000 rpm离心1分钟。弃去AA缓冲液上清，并将其加入2 mL AD缓冲液中。
12. 从TB缓冲液中取出组织切片，并在含有抗体的AD缓冲液中于4°C湿化室内过夜孵育。

10. 原位 杂交第三天

1. 配制显色液 NTMT（100 mM Tris-HCl pH 9.5，100 mM NaCl，50 mM MgCl₂，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤膜过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。使用前立即加入 2 mM 左旋咪唑和 0.1% Tween™ 20。
2. 从孔中移除抗体溶液（AD 缓冲液 + 抗体），并将溶液储存于 4°C。该溶液最多可重复使用两次。
3. 用含有 2 mM 左旋咪唑的 TBSTw 在 25°C 下洗涤组织 8 次，每次 10 分钟。
4. 小心将组织从篮子中转移至含有 TBSTw 的培养皿中。使用镊子去除可见的碎片。将组织转移至洁净的微量离心管中。
5. 用 1 mL NTMT 在 25°C 下洗涤组织一次，持续 10 分钟。
6. 移除 NTMT，每管加入 1 mL 含有 2 mM 左旋咪唑的 50% NTMT 与 50% BM Purple 的混合液，将离心管置于避光盒中，在 25°C 下孵育。显色时间范围为数小时至数天。若显色缓慢，可使用 100% BM Purple。
7. 监测显色进程，若溶液中出现沉淀晶体或颜色由黄色变为紫色，则更换 NTMT/BM Purple 溶液。完全显色后（4–250 小时），用每管 1 mL 含 2 mM 左旋咪唑的 NTMT 在 25°C 下洗涤组织两次，每次 5 分钟。
8. 在每管含 4% 多聚甲醛后固定液的 1 mL PBS 中，于 4°C 过夜孵育组织。
9. 为漂白组织，将组织在每管含 3% H₂O₂ 的 1 mL PBSTw 中于 25°C 孵育 30 分钟。然后在每管 1 mL PBSTw 中于 25°C 洗涤一次，每次 10 分钟，并将组织储存在每管含 4% 多聚甲醛后固定液的 1 mL PBS 中，置于 4°C。
10. 将组织切片置于载玻片上，加盖盖玻片，并使用复式显微镜成像。

11. 代表性结果：

LUT 组织在琼脂糖中的空间方向决定了组织切片的切面。对于矢状切面，需切除至少三分之二的膀胱，将剩余的 LUT 组织包埋于琼脂糖中，使尿道中线与琼脂糖块的平坦表面平行（图 1A）。可通过倾斜琼脂糖块的平坦边缘对组织切面进行微调。图 1B 展示了按此方向定位的 17.5 天胚胎期（17.5 dpc）雄性 LUT 组织的代表性矢状切面。

在长达数天的原位杂交（ISH）实验过程中，样本篮可保护 delicate 组织切片，避免其丢失以及积聚灰尘和颗粒物。样本篮的制备方法是将聚酯网膜熔接到 1.5 mL 微离心管的切割端（图 1C）。每个样本篮的管盖上均穿刺一个小孔，以促进溶液流入和流出篮内。通过将样本篮置于 24 孔板盖上钻出的 12 mm 孔中，可使其悬浮于 ISH 溶液内（图 1D）。当在不同 24 孔板之间转移溶液时，经改造的板盖可支撑样本篮，防止其倾倒或移位。

在检测低丰度 mRNA 所需的长时间孵育过程中，限制非特异性背景染色具有挑战性。在样本缓冲液中添加 0.2 mM 叠氮化钠，并通过 0.22 μm 滤器过滤，可有效降低背景染色（图 2）。采用本文所述方法，在显色发育溶液中长时间孵育样本时，背景染色未出现明显可见的差异（图 3）。

图1. 小鼠下泌尿生殖道（LUT）组织切片的制备及用于原位杂交（ISH）的微量离心管篮。包含部分膀胱、盆腔尿道以及来源于沃尔夫管和缪勒管结构的LUT组织被包埋于圆柱形的4%低熔点琼脂糖凝胶中。（A）将凝胶块粘附于样品固定盘上，并（B）使用振动切片机切成50 μm厚的切片。（C）将LUT组织切片转移至微量离心管篮中，该离心管篮通过在管盖上打孔，并将聚酯网膜固定于管底切割端制成。（D）将微量离心管插入预先在24孔板盖上钻好的12 mm孔中，使组织切片在ISH实验过程中悬浮于缓冲液中。箭头指示琼脂糖凝胶块中的LUT组织位置。

图2. 在0.22μm滤过的溶液中加入0.2 mM叠氮化钠可改善组织质量并减少背景染色。取17.5天胎龄雄性小鼠下泌尿生殖道（LUTs），沿矢状面切片至50μm厚度。组织切片采用针对twist同源物1的探针进行原位杂交（ISH）染色。ISH所用缓冲液分别为（A）经0.22μm滤过并添加0.2 mM叠氮化钠（NaAz）或（B）未滤过且未添加NaAz。箭头指示背景染色区域。图像以相同放大倍数采集。结果代表典型的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠。

图3. 背景染色强度似乎不会随着显色时间的延长而增加。17.5天孕龄雄性小鼠下泌尿生殖道（LUTs）被切成矢状面，厚度为50μm。切片通过原位杂交（ISH）进行染色，使用识别高丰度转录本雌激素相关受体γ（estrogen-related receptor gamma）的探针，在显色液中孵育（A）9.5小时Esrrg)，（B）使用识别中等丰度转录本溴结构域邻近锌指结构域2A（bromodomain adjacent to zinc finger domain, 2A）的探针孵育43.5小时Baz2a)，或使用识别低丰度转录本wingless-type MMTV整合位点家族成员10a（Wnt10a）的探针处理236小时（C）Wnt10a）。图像在相同放大倍数下采集。结果为代表性的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠。

讨论

采用此处描述的方法，可以在胎鼠泌尿生殖道（LUT）的所有主要细胞类型和组织区室中检测mRNA，包括间充质垫、尿路上皮、平滑肌、前列腺芽、射精管以及阴道。本方案使用的50μm切片具有以下优势：厚度足以分辨组织结构（如血管），同时又足够薄以避免探针滞留，而探针滞留是整体原位杂交（whole-mount ISH）中常见的方法学问题。每种新合成的核糖探针都会在阳性对照组织上进行评估，这些组织的染色结果已在先前发表的研究中得到验证。我们确保在这些组织中观察到的染色模式具有特异性。本方法的另一优势在于，可对同一LUT组织的相邻切片进行多种mRNA表达模式的分析。此外，该方法可与免疫组织化学技术联用，以可视化特定细胞的蛋白标志物，并识别原位杂交（ISH）染色所标记的细胞类型。该方法不适用于传统的复染方法，例如使用Fast Red或苏木精进行细胞核复染。然而，我们已成功使用荧光细胞核染料对样本进行复染，包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（propidium iodide）。

本文所述方法相较于先前描述的方法⁷有多项改进。当前文稿中几乎所有缓冲液和试剂储备...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗地高辛抗体，Fab 片段	罗氏集团	11214667001
封闭剂	罗氏集团	11096176001
BM 紫色 AP 底物，沉淀型	罗氏集团	11442074001
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP1600-100
24孔细胞培养板	Corning	3524
地高辛-11-UTP	罗氏集团	1277073910
dNTPs	罗氏集团	11969064001
双面剃须刀片	Wilkinson Sword	经典模型
Eliminase RNase 去除剂	Decon Laboratories	1102
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F5786-1L
凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
戊二醛，25% 水溶液2O	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393
过氧化氢，30% 水溶液2O	Fisher Scientific	BP2633-500
左旋咪唑	Sigma-Aldrich	L9756
Loctite 404 快干瞬干胶	Henkel Corp	46551
氯化镁	Fisher Scientific	M33-500
马来酸	Sigma-Aldrich	M0375-500G
1.5 mL 微量离心管	Biologix 研究公司	BP337-100
Millicell 培养板插件	EMD Millipore	PICM01250
分子研磨树脂	G-Biosciences	786-138PR
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液	Affymetrix	19943
磷酸盐缓冲液，不含 Ca && Mg	MP Biomedicals	ICN1760420
聚酯网，33 微米，12" × 24"	Small Parts, Inc.	CMY-0033-D
蛋白酶K溶液，20 mg/ml	Amresco	E195-5ML
QIAshredder 离心柱	Qiagen	79654
Q溶液	Qiagen	提供Taq DNA聚合酶
RNase	Sigma-Aldrich	R6513
RNase 抑制剂	罗氏集团	03335399001
RNeasy mini试剂盒	Qiagen	74104
RNEASY mini试剂盒	Qiagen	74104
RQ1 无RN酶的DNase	Promega Corp.	M6101
SeaPlaque 低熔点琼脂糖	Lonza Inc.	50101
羊血清	Sigma-Aldrich	S2263-500mL
Stericup 滤器，0.22μ米，聚醚砜，500毫升	EMD Millipore	SCGPU05RE
叠氮化钠，颗粒状	Fisher Scientific	S227I-100
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific	S529-500
SSC，20倍浓度溶液	Research Products International Corp.	S24022-4000.0
SuperScript III 第一链合成系统	Invitrogen	18080-051
T7 RNA聚合酶	罗氏集团	10881767001
Taq DNA聚合酶	Qiagen	201203
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
配备豪华型标本槽的振动切片机	徕卡显微系统	VT1000A
酵母tRNA	罗氏集团	109495