在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位 原位杂交（ISH）方法用于可视化小鼠胎儿前列腺组织切片中mRNA表达的模式。该方法可轻松适用于可视化其他小鼠组织或其他物种组织中mRNA的表达模式。
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摘要
摘要
下泌尿生殖道（LUT）的发育是一个复杂的过程。在雄性胎儿尿道形成前列腺的过程中，这种复杂性尤为明显，该过程依赖于雄激素信号以及上皮-间质间的相互作用1,2。了解调控前列腺发育的分子机制，可能揭示在生命后期被异常重新激活的生长机制，从而导致良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的发生。
发育中的泌尿生殖窦（LUT）具有复杂的解剖结构。当前列腺芽体在受孕后16.5天（dpc）开始形成时，已存在多种细胞类型。血管、神经和平滑肌位于间质性间充质中3。该间质包裹着多层上皮，并通过雄激素受体依赖的旁分泌信号诱导胎儿前列腺的形成4。目前尚不完全清楚在前列腺发育过程中，间质中哪些雄激素受体响应基因是必需的，以及前列腺导管上皮如何响应这些基因而形成。精确识别细胞类型并定位其中特定因子的表达，对于进一步理解前列腺发育至关重要。原位杂交（ISH）技术可实现mRNA在组织内的定位。因此，该方法可用于确定信号分子及其受体的表达模式与时间，从而揭示潜在的前列腺发育调控因子。
本文介绍了一种高通量原位杂交（ISH）技术，用于鉴定胎鼠下泌尿生殖道（LUT）中mRNA的表达模式，所用组织切片由振动切片机切割而成。该方法相较于其他ISH方案具有多项优势。在载玻片上进行薄切片ISH在技术上较为困难；冷冻切片常存在组织结构质量差的问题，而冷冻切片和石蜡切片均常导致信号分辨率较弱。对整体组织进行ISH则可能导致探针滞留。相比之下，我们的高通量技术采用厚切片，可清晰显示组织精细结构。经改良的微量离心管便于在ISH过程中对切片进行操作。单个17.5天胎龄（dpc）LUT样本最多可同时筛查4种mRNA转录本，单次实验最多可检测24种mRNA转录本，从而降低成本并提高效率。该方法允许将多个处理组以完全相同的方式作为单一整体进行处理，避免数据分析中的偏差。对于前列腺研究者而言尤为关键的是，该方法可提供胎鼠尿道中低丰度和高丰度mRNA转录本在空间和时间上的精确定位，而尿道正是前列腺导管网络的发育起源。
方案
1. 从PCR生成的模板合成地高辛-11-UTP标记的核糖探针
- 为了合成基因特异性核糖探针，使用 Entrez Gene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）获取该基因的 cDNA 参考序列（RefSeq）。利用 Primer3 程序（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）5 针对 cDNA 序列的 3’ 区域设计基因特异性 PCR 引物。有关 PCR 引物选择的推荐参数，可参见其他文献（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）。
- 使用 MegaBLAST 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）6 评估所选 DNA 序列的特异性。当使用 0.01 的 EXPECT 阈值时，若该 DNA 序列在 RefSeq 数据库中不与其他序列比对，则认为其具有特异性。
- 通过 PCR 扩增核糖探针模板。PCR 反应组分和热循环条件应针对每对引物进行优化。一个典型的 50 μl 反应体系包含：1X 缓冲液、2 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、1X Q 溶液、1 μg cDNA、2.5 U Taq DNA 聚合酶、0.25 μM 引物以及无核酸酶水（nuclease-free H2O）。典型的热循环程序包括：94°C 初始变性 2 分钟，随后进行 40 个循环（94°C 变性 30 秒、57°C 退火 30 秒、72°C 延伸 1 分钟），最后在 72°C 延伸 10 分钟。PCR 反应中使用的 cDNA 是从小鼠泌尿生殖系统 mRNA 反转录合成的。
- 通过琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物，使用凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）进行纯化，并通过分光光度法测定纯化产物的浓度。预期产量为 1.2 – 3.6 μg。
- 将 PCR 产物转录为标记的核糖探针。转录反应体系（40 μl）包含：400 ng 纯化的 PCR 产物、1X 核苷酸标记混合物（含地高辛标记的 11-UTP）、1X 转录缓冲液、5 U RNase 抑制剂、80 U T7 RNA 聚合酶以及无核酸酶水（nuclease-free H2O）。在 37°C 下孵育 3–4 小时，每 30 分钟轻轻振荡样品一次。
- 使用 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒，按照柱上 DNase 消化进行 RNA 纯化的说明纯化核糖探针。通过分光光度法定量核糖探针。预期产量为 4–20 μg。通过将部分样品在 1.5% 非变性琼脂糖凝胶上电泳分离，评估探针质量。高质量的探针应呈现清晰条带，无明显拖尾。
- 为确保核糖探针能特异性识别其靶标，在首次原位杂交（ISH）实验中应包含阳性对照组织。该阳性对照组织中，核糖探针所针对的 mRNA 表达模式应已知且明确。
2. 振动切片机刀片的制备（基于先前描述的方案）7
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%的低熔点琼脂糖溶液。将溶液微波加热至琼脂糖完全溶解，并维持溶液温度在62°C。
- 通过从直径12 mm的Millicell培养板小室插入物上移除膜，制备一个聚苯乙烯环形模具，并保留聚苯乙烯环作为琼脂糖模具使用。每次使用前，将环状模具在RNase抑制剂溶液中浸泡过夜。
- 为确保切片表面光滑，使用以下纯溶剂依次冲洗Wilkinson刀片表面，以去除防锈剂及其他添加剂：石油醚、二甲苯、氯仿、甲醇和MilliQ水。将双刃刀片沿长度方向分离为两个单刃刀片。
- 使用Loctite胶水将Wilkinson刀片粘附于切片机刀片上。该切片机刀片不用于切割，仅用于增强Wilkinson刀片的刚性。应使用金属剪刀将切片机刀片裁剪至与Wilkinson刀片等长，粘合后使其边缘较Wilkinson刀片的切割刃错开3–4 mm。
3. 泌尿生殖组织的解剖、保存与切片制备
- 制备 PBSTw 溶液（含 0.1% Tween™ 20 和 0.2 mM 叠氮化钠的 PBS 溶液，经 0.22 μm Stericup® 滤器过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。
- 将新鲜解剖的小鼠下泌尿道组织（膀胱、盆腔尿道以及相关的沃尔夫管和缪勒管来源结构）在含 4% 多聚甲醛固定液的 PBS 中，于 4°C 下孵育过夜。
- 通过在梯度浓度甲醇/PBSTw（1:3、1:1、3:1 v/v）溶液中于 25°C 洗涤 10 分钟进行组织脱水。将样品在 100% 甲醇中于 –20°C 至少保存过夜。存档组织可在 –20°C 保存至少 2 年。
- 通过梯度浓度甲醇/PBSTw（3:1、1:1、1:3 v/v）溶液在 25°C 下洗涤 10 分钟，对存档组织进行再水化，以备切片。
- 解剖并弃去约三分之二的膀胱组织，保留大部分三角区与尿道相连。
4. 在琼脂糖中包埋泌尿生殖组织
- 将聚苯乙烯环形模具平的一面朝下放置在 25°C 的普通玻璃显微镜载玻片上。
- 用 62°C 的琼脂糖溶液填充环形模具，并冷却约 2 分钟。
- 从 PBSTw 中取出 LUT 组织，并用吸水纸轻轻吸干。
- 将组织转移至琼脂糖溶液中。
- 使用镊子调整 LUT 组织在琼脂糖中的方向，使其悬浮于环形模具顶部与底部之间的中间位置，并在 4°C 下孵育，直至琼脂糖完全凝固。
- 若在琼脂糖凝固过程中组织完全下沉，可将其从琼脂糖中切出并重新包埋；在重新包埋过程中，可根据需要调整琼脂糖的冷却时间。
5. 使用振动切片机对泌尿生殖组织进行切片（基于先前描述的方案）7
- 将加强型Wilkinson刀片安装到振动切片机上，并将刀片角度设置为 35°将PBS加入豪华型标本浴槽中，并在浴槽周围放置湿冰。
- 从环形模具中取出凝固的琼脂糖凝胶块，并用吸水纸擦拭其底面。确认组织方向正确。若需调整组织方向，可用剃刀刀片对琼脂糖凝胶块的平直边缘进行斜切以校正方向。
- 将琼脂糖凝胶块用Loctite胶水粘附到振动切片机样品安装盘上，如图所示 图 1A.
- 将样本固定盘插入振动切片机中。
- 调节切片机切片厚度至 50μm，将速度调至2，刀片振幅调至4，开始切片。
- 使用钝头镊子转移每一片组织切片（图 1B) 加入含有 0.5 mL 冰冷 PBSTw 的 24 孔细胞培养板孔中。
- 为准备样品 原位 杂交后，切去每个组织切片周围的大部分琼脂糖（剩余的琼脂糖将在原位杂交过程中融化），并清除所有相关碎片。切片可在48小时内储存 4°C 在 PBSTw 中。
6. 样品篮制备 原位 杂交
- 在微量离心管的100μL刻度处剪去管底。
- 将剪切后的管边缘置于火焰中加热，直至塑料软化，然后将微量离心管牢固地压在一块直径0.5英寸的聚酯网片中心。
- 修剪多余的网片，并使用加热的18号针头在每个管盖上穿刺两个孔，以完成篮式装置的制备（图1C）。
- 取下24孔板的盖子，并在每孔正上方中心位置钻一个直径12mm的孔。在原位杂交（ISH）实验流程的洗涤步骤之间，使用该盖子转移样品篮（图1D）。
7. 胚胎粉末制备 原位 杂交（基于先前描述的方案）8
- 采集与待检测组织切片相同发育阶段的小鼠胚胎组织，于 –80°C 保存。将冷冻组织放入陶瓷研钵中，浸入液氮，用研杵研磨成细粉。
- 将胚胎粉末与 4 倍体积的丙酮混合，使用玻璃匀浆器（Dounce 匀浆器）反复匀浆数次。
- 将匀浆液转移至 15 mL 玻璃螺口瓶中，于 4°C 过夜提取。
- 在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，沉淀胚胎粉末。移除并弃去含脂质的上清液。将组织沉淀用 4 倍体积的新鲜丙酮重悬，并于 4°C 提取 2 小时。
- 在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，再次沉淀胚胎粉末。移除并弃去上清液。
- 将沉淀物置于 #2 Whatman 滤纸上空气干燥。研碎沉淀物以获得细粉，置于密封良好的玻璃瓶中，4°C 保存。每克胚胎湿重可获得约 50 mg 粉末。
8. 原位 杂交第一天
- 将预杂交液（50% 甲酰胺、5x SSC、1% 封闭试剂、10μg/mL 酵母 tRNA、10μg/mL 肝素，储存于 -20°C）预热至 60.5°C。该溶液可预先配制并储存于 -20°C。
- 通过在小型塑料储存容器中加入约 0.5 英寸的自来水，制备加湿的杂交室。盖上容器并预热至 60.5°C。
- 向 24 孔培养板的孔中加入 2mL PBSTw。将样品篮置于 24 孔板盖的孔洞中，并将组织切片转移至篮中（每个篮中最多可放置 10 片切片）。
- 在含 6% H2O2 的溶液中，25°C 下孵育组织切片 30 分钟。此步骤及后续所有孵育步骤均应在旋转摇床上轻柔振荡进行，除非另有说明。所有孵育和洗涤均在 24 孔板中进行，每孔使用总体积为 2mL 的溶液。
- 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。
- 在含 5μg/mL 蛋白酶 K 的 PBSTw 中，25°C 下孵育组织切片 12 分钟。
- 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 1 次，每次 5 分钟。
- 在含 4% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的 PBS 中，25°C 下对组织切片进行后固定 20 分钟。
- 用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 2 次，每次 5 分钟。
- 每孔加入 2mL 预热的预杂交缓冲液，并将组织切片置于加湿的杂交室中，在 60.5°C 下孵育至少 1 小时。
- 在每孔的预杂交缓冲液中加入 0.65μg 标记的核糖探针，并将组织切片在加湿的杂交室中于 60.5°C 下过夜孵育。
9. 原位 杂交第2天
- 准备以下用于杂交后洗涤步骤的溶液：溶液 1（50% 甲酰胺，5× SSC，1% SDS）、溶液 2（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 M NaCl，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）和溶液 3（2× SSC，50% 甲酰胺）。这些溶液可预先配制。溶液 1 和溶液 3 储存于 -20°C，溶液 2 储存于 25°C。溶液储存寿命至少为 3 个月。
- 用预热的溶液 1 在 60.5°C 下对组织切片进行 3 次，每次 30 分钟的洗涤。洗涤过程中使用加湿孵育盒。
- 用预热的溶液 1 与溶液 2 按体积比 1:1 混合的溶液在 60.5°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤。洗涤过程中使用加湿孵育盒。
- 用溶液 2 在 25°C 下对组织切片进行 4 次，每次 10 分钟的洗涤。
- 在含 0.25 μg/mL RNase 的溶液 2 中，于 37°C 孵育组织切片 15 分钟。
- 用不含 RNase 的溶液 2 在 25°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤。
- 用溶液 3 在 25°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤，随后在 60.5°C 下用溶液 3 进行 2 次，每次 1 小时的洗涤。60.5°C 洗涤过程中使用加湿孵育盒。
- 准备以下用于 DIG 标记的核糖探针免疫组织化学检测的溶液：组织封闭缓冲液（TB，1× TBS，10% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.22 μm 滤过）、抗体稀释缓冲液（AD，1× TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）、抗体吸附缓冲液（AA，1× TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，6 mg/mL 胚胎粉）和 TBSTw（1× TBS，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）。这些溶液可预先配制。TBSTw 储存于 25°C，其余所有溶液均储存于 -20°C。
- 用 TBSTw 在 25°C 下洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 将组织切片在 TB 缓冲液中于 25°C 孵育至少 2 小时。
- 在组织切片于 TB 缓冲液中孵育的同时，每 200 μL AA 缓冲液中加入 1.1 μL 抗 DIG 抗体。将 AA 缓冲液加抗体混合物于 4°C 孵育至少 2 小时，然后以 10,000 rpm 离心 1 分钟。弃去上清液，将上清液转移至 2 mL AD 缓冲液中。
- 将组织切片从 TB 缓冲液中取出，置于含抗体的 AD 缓冲液中，在加湿孵育盒中于 4°C 过夜孵育。
10. 原位 杂交第3天
- 配制显色液 NTMT（100 mM Tris-HCl pH 9.5，100 mM NaCl，50 mM MgCl2，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤膜过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。使用前立即加入 2 mM 左旋咪唑和 0.1% Tween™ 20。
- 从孔中移除抗体溶液（AD 缓冲液 + 抗体），并将溶液储存于 4°C。该溶液最多可重复使用两次。
- 在含 2 mM 左旋咪唑的 TBSTw 中，于 25°C 下洗涤组织 8 次，每次 10 分钟。
- 小心将组织从篮子中转移至含有 TBSTw 的培养皿中。用镊子去除可见杂质，再将组织转移至洁净的微量离心管中。
- 用 1 mL NTMT 在 25°C 下洗涤组织一次，持续 10 分钟。
- 吸除 NTMT，每管加入 1 mL 含 50% NTMT（含 2 mM 左旋咪唑）和 50% BM Purple 的混合液，将离心管置于避光盒中，于 25°C 孵育。显色时间从数小时至数天不等。若显色缓慢，可使用 100% BM Purple。
- 监测显色进程，若溶液中出现沉淀晶体或颜色由黄色变为紫色，则更换 NTMT/BM Purple 溶液。完全显色后（4–250 小时），用每管 1 mL 含 2 mM 左旋咪唑的 NTMT 在 25°C 下洗涤组织 2 次，每次 5 分钟。
- 在含 4% 多聚甲醛后固定液的 PBS 中，每管加入 1 mL，于 4°C 过夜孵育组织。
- 为漂白组织，将组织在含 3% H2O2 的 PBSTw 中，每管加入 1 mL，于 25°C 孵育 30 分钟。然后在含 1 mL PBSTw 的离心管中，于 25°C 洗涤组织一次，持续 10 分钟，并将组织储存在含 4% 多聚甲醛后固定液的 PBS 中，每管 1 mL，于 4°C 保存。
- 将组织切片封片于载玻片上，加盖盖玻片，使用复式显微镜成像。
11. 代表性结果：
LUT 组织在琼脂糖中的空间方向决定了组织切片的切面。对于矢状切面，需切除至少三分之二的膀胱，将剩余的 LUT 组织包埋于琼脂糖中，使尿道中线与琼脂糖块的平坦表面平行（图 1A）。可通过倾斜琼脂糖块的平坦边缘对组织切面进行微调。图 1B 展示了按此方向定位的 17.5 天胚胎期（17.5dpc）雄性 LUT 组织的一个代表性矢状切面。
在为期多天的原位杂交（ISH）实验过程中，样本篮可保护精细的组织切片，避免样本丢失以及灰尘和颗粒物的沉积。图1C 所示，通过将聚酯网膜熔接到1.5 mL 微离心管的切口端制备样本篮。每个样本篮的管盖上均穿刺一个小孔，以促进溶液流入和流出样本篮。将样本篮置于经改造的24孔板盖上所钻的12 mm 孔中，使其悬浮于ISH溶液中（图1D）。在更换溶液并转移样本篮至不同24孔板时，经改造的板盖可提供支撑。
在检测低丰度 mRNA 所需的长时间孵育过程中，限制非特异性背景染色具有挑战性。在样本缓冲液中添加 0.2 mM 叠氮化钠，并随后通过 0.22 μm 滤器过滤，似乎能够降低背景染色（图 2）。采用本文所述方法，在显色发育溶液中长时间孵育样本时，背景染色未出现明显可见的差异（图 3）。
图 1. 小鼠下泌尿生殖道（LUT）组织切片及用于原位杂交（ISH）的微量离心管篮的制备。包含部分膀胱、盆腔尿道以及来源于沃尔夫管和缪勒管结构的LUT组织被包埋于圆柱形的4%低熔点琼脂糖凝胶中。（A）将凝胶块粘附于样品固定盘上，并（B）使用振动切片机切成50 μm厚的切片。（C）将LUT组织切片转移至微量离心管篮中，该管篮通过在管盖上打孔，并将聚酯网膜固定于管底切割端制备而成。（D）将微量离心管插入24孔板盖上钻出的12 mm孔中，以便在ISH实验过程中使组织切片悬浮于缓冲液中。箭头指示琼脂糖凝胶块中的LUT组织位置。
图2. 加入0.2 mM叠氮化钠 0.22μm 过滤后的溶液可提高组织质量并减少背景染色。17.5天孕龄（dpc）雄性小鼠下泌尿生殖道（LUTs）沿矢状面切片，厚度为 50μm组织切片采用针对 twist 同源物 1 的探针通过原位杂交（ISH）进行染色。ISH 实验中使用的缓冲液为 (A) 0.22μm 过滤并添加0.2 mM叠氮化钠（NaAz），或（B）未过滤且未添加NaAz。箭头指示背景染色。图像以相同放大倍数拍摄。结果为代表性的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠
图3. 背景染色强度似乎不会随着显色时间的延长而增强。17.5天孕龄雄性小鼠的下泌尿生殖道（LUTs）被切成矢状面切片，厚度为 50μm. 采用原位杂交（ISH）对切片进行染色，使用识别高丰度转录本雌激素相关受体γ（estrogen-related receptor gamma）的探针，在（A）9.5小时的显色染色液孵育条件下进行染色Esrrg使用可识别中等丰度转录本溴结构域邻近锌指结构域 2A 的探针Baz2a)，或使用识别低丰度转录本wingless-type MMTV整合位点家族成员10a（Wnt10a）的探针处理236小时（C）Wnt10a）。图像在相同的放大倍数下采集。结果为代表性的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠
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讨论
采用此处描述的方法，可以在胎鼠泌尿生殖道（LUT）的所有主要细胞类型和组织区室中检测mRNA，包括间充质垫、尿路上皮、平滑肌、前列腺芽、射精管以及阴道。本方案使用的50μm切片具有以下优势：厚度足以分辨组织结构（如血管），同时又足够薄以避免探针滞留，而探针滞留是整体原位杂交（whole-mount ISH）中常见的方法学问题。每种新合成的核糖探针都会在阳性对照组织上进行评估，这些组织的染色结果已在先前发表的研究中得到验证。我们确保在这些组织中观察到的染色模式具有特异性。本方法的另一优势在于，可对同一LUT组织的相邻切片进行多种mRNA表达模式的分析。此外，该方法可与免疫组织化学技术联用，以可视化特定细胞的蛋白标志物，并识别原位杂交（ISH）染色所标记的细胞类型。该方法不适用于传统的复染方法，例如使用Fast Red或苏木精进行细胞核复染。然而，我们已成功使用荧光细胞核染料对样本进行复染，包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（propidium iodide）。
本文所述方法相较于先前描述的方法7有多项改进。当前文稿中几乎所有缓冲液和试剂储备...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢新泽西癌症研究所的 Lan Yi 博士在制备组织篮过程中提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院基金 DK083425 和 DK070219 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗地高辛抗体，Fab 片段 | 罗氏集团 | 11214667001 | |
| 封闭剂 | 罗氏集团 | 11096176001 | |
| BM 紫色 AP 底物，沉淀型 | 罗氏集团 | 11442074001 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| 24孔细胞培养板 | Corning | 3524 | |
| 地高辛-11-UTP | 罗氏集团 | 1277073910 | |
| dNTPs | 罗氏集团 | 11969064001 | |
| 双面剃须刀片 | Wilkinson Sword | 经典模型 | |
| Eliminase RNase 去除剂 | Decon Laboratories | 1102 | |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| 戊二醛，25% 水溶液2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| 肝素钠盐 | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| 过氧化氢，30% 水溶液2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| 左旋咪唑 | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 快干瞬干胶 | Henkel Corp | 46551 | |
| 氯化镁 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| 马来酸 | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Biologix 研究公司 | BP337-100 | |
| Millicell 培养板插件 | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 分子研磨树脂 | G-Biosciences | 786-138PR | |
| 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液 | Affymetrix | 19943 | |
| 磷酸盐缓冲液，不含 Ca && Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| 聚酯网，33 微米，12" × 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| 蛋白酶K溶液，20 mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder 离心柱 | Qiagen | 79654 | |
| Q溶液 | Qiagen | 提供Taq DNA聚合酶 | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase 抑制剂 | 罗氏集团 | 03335399001 | |
| RNeasy mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 无RN酶的DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque 低熔点琼脂糖 | Lonza Inc. | 50101 | |
| 羊血清 | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup 滤器，0.22μ米，聚醚砜，500毫升 | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 叠氮化钠，颗粒状 | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC，20倍浓度溶液 | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III 第一链合成系统 | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA聚合酶 | 罗氏集团 | 10881767001 | |
| Taq DNA聚合酶 | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| 配备豪华型标本槽的振动切片机 | 徕卡显微系统 | VT1000A | |
| 酵母tRNA | 罗氏集团 | 109495 |
参考文献
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
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