高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

摘要

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位 原位杂交（ISH）方法用于可视化小鼠胎儿前列腺组织切片中mRNA表达的模式。该方法可轻松适用于可视化其他小鼠组织或其他物种组织中mRNA的表达模式。

摘要

下泌尿生殖道（LUT）的发育是一个复杂的过程。在雄性胎儿尿道形成前列腺的过程中，这种复杂性尤为明显，该过程依赖于雄激素信号以及上皮-间质间的相互作用^1,2。了解调控前列腺发育的分子机制，可能揭示在生命后期被异常重新激活的生长机制，从而导致良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的发生。

发育中的泌尿生殖窦（LUT）具有复杂的解剖结构。当前列腺芽体在受孕后16.5天（dpc）开始形成时，已存在多种细胞类型。血管、神经和平滑肌位于间质性间充质中³。该间质包裹着多层上皮，并通过雄激素受体依赖的旁分泌信号诱导胎儿前列腺的形成⁴。目前尚不完全清楚在前列腺发育过程中，间质中哪些雄激素受体响应基因是必需的，以及前列腺导管上皮如何响应这些基因而形成。精确识别细胞类型并定位其中特定因子的表达，对于进一步理解前列腺发育至关重要。原位杂交（ISH）技术可实现mRNA在组织内的定位。因此，该方法可用于确定信号分子及其受体的表达模式与时间，从而揭示潜在的前列腺发育调控因子。

本文介绍了一种高通量原位杂交（ISH）技术，用于鉴定胎鼠下泌尿生殖道（LUT）中mRNA的表达模式，所用组织切片由振动切片机切割而成。该方法相较于其他ISH方案具有多项优势。在载玻片上进行薄切片ISH在技术上较为困难；冷冻切片常存在组织结构质量差的问题，而冷冻切片和石蜡切片均常导致信号分辨率较弱。对整体组织进行ISH则可能导致探针滞留。相比之下，我们的高通量技术采用厚切片，可清晰显示组织精细结构。经改良的微量离心管便于在ISH过程中对切片进行操作。单个17.5天胎龄（dpc）LUT样本最多可同时筛查4种mRNA转录本，单次实验最多可检测24种mRNA转录本，从而降低成本并提高效率。该方法允许将多个处理组以完全相同的方式作为单一整体进行处理，避免数据分析中的偏差。对于前列腺研究者而言尤为关键的是，该方法可提供胎鼠尿道中低丰度和高丰度mRNA转录本在空间和时间上的精确定位，而尿道正是前列腺导管网络的发育起源。

方案

1. 从PCR生成的模板合成地高辛-11-UTP标记的核糖探针

1. 为了合成基因特异性核糖探针，使用 Entrez Gene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）获取该基因的 cDNA 参考序列（RefSeq）。利用 Primer3 程序（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）⁵ 针对 cDNA 序列的 3’ 区域设计基因特异性 PCR 引物。有关 PCR 引物选择的推荐参数，可参见其他文献（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）。
2. 使用 MegaBLAST 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）⁶ 评估所选 DNA 序列的特异性。当使用 0.01 的 EXPECT 阈值时，若该 DNA 序列在 RefSeq 数据库中不与其他序列比对，则认为其具有特异性。
3. 通过 PCR 扩增核糖探针模板。PCR 反应组分和热循环条件应针对每对引物进行优化。一个典型的 50 μl 反应体系包含：1X 缓冲液、2 mM MgCl₂、0.2 mM dNTPs、1X Q 溶液、1 μg cDNA、2.5 U Taq DNA 聚合酶、0.25....

讨论

采用此处描述的方法，可以在胎鼠泌尿生殖道（LUT）的所有主要细胞类型和组织区室中检测mRNA，包括间充质垫、尿路上皮、平滑肌、前列腺芽、射精管以及阴道。本方案使用的50μm切片具有以下优势：厚度足以分辨组织结构（如血管），同时又足够薄以避免探针滞留，而探针滞留是整体原位杂交（whole-mount ISH）中常见的方法学问题。每种新合成的核糖探针都会在阳性对照组织上进行评估，这些组织的染色结果已在先前发表的研究中得到验证。我们确保在这些组织中观察到的染色模式具有特异性。本方法的另一优势在于，可对同一LUT组织的相邻切片进行多种mRNA表达模式的分析。此外，该方法可与免疫组织化学技术联用，以可视化特定细胞的蛋白标志物，并识别原位杂交（ISH）染色所标记的细胞类型。该方法不适用于传统的复染方法，例如使用Fast Red或苏木精进行细胞核复染。然而，我们已成功使用荧光细胞核染料对样本进行复染，包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（propidium iodide）。

本文所述方法相较于先前描述的方法⁷有多项改进。当前文稿中几乎所有缓冲液和试剂储备.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗地高辛抗体，Fab 片段	罗氏集团	11214667001
封闭剂	罗氏集团	11096176001
BM 紫色 AP 底物，沉淀型	罗氏集团	11442074001
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP1600-100
24孔细胞培养板	Corning	3524
地高辛-11-UTP	罗氏集团	1277073910
dNTPs	罗氏集团	11969064001
双面剃须刀片	Wilkinson Sword	经典模型
Eliminase RNase 去除剂	Decon Laboratories	1102
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F5786-1L
凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
戊二醛，25% 水溶液2O	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393
过氧化氢，30% 水溶液2O	Fisher Scientific	BP2633-500
左旋咪唑	Sigma-Aldrich	L9756
Loctite 404 快干瞬干胶	Henkel Corp	46551
氯化镁	Fisher Scientific	M33-500
马来酸	Sigma-Aldrich	M0375-500G
1.5 mL 微量离心管	Biologix 研究公司	BP337-100
Millicell 培养板插件	EMD Millipore	PICM01250
分子研磨树脂	G-Biosciences	786-138PR
4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液	Affymetrix	19943
磷酸盐缓冲液，不含 Ca && Mg	MP Biomedicals	ICN1760420
聚酯网，33 微米，12" × 24"	Small Parts, Inc.	CMY-0033-D
蛋白酶K溶液，20 mg/ml	Amresco	E195-5ML
QIAshredder 离心柱	Qiagen	79654
Q溶液	Qiagen	提供Taq DNA聚合酶
RNase	Sigma-Aldrich	R6513
RNase 抑制剂	罗氏集团	03335399001
RNeasy mini试剂盒	Qiagen	74104
RNEASY mini试剂盒	Qiagen	74104
RQ1 无RN酶的DNase	Promega Corp.	M6101
SeaPlaque 低熔点琼脂糖	Lonza Inc.	50101
羊血清	Sigma-Aldrich	S2263-500mL
Stericup 滤器，0.22μ米，聚醚砜，500毫升	EMD Millipore	SCGPU05RE
叠氮化钠，颗粒状	Fisher Scientific	S227I-100
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific	S529-500
SSC，20倍浓度溶液	Research Products International Corp.	S24022-4000.0
SuperScript III 第一链合成系统	Invitrogen	18080-051
T7 RNA聚合酶	罗氏集团	10881767001
Taq DNA聚合酶	Qiagen	201203
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
配备豪华型标本槽的振动切片机	徕卡显微系统	VT1000A
酵母tRNA	罗氏集团	109495