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一个 体外 研究肿瘤休眠及其向转移性生长转换的系统

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DOI：

10.3791/2914

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2011年8月11日

 , 
1Department of Biology, University of Haifa, 2Transgenic Oncogenesis and Genomics Section, Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute

本文内容

摘要

一种改良的三维体外系统被用于研究多种肿瘤细胞系在重建基底膜中的生长特性，这些特性与肿瘤细胞在转移性继发部位所表现出的休眠或增殖行为相关 体内.

摘要

乳腺癌的复发通常发生在一段漫长的潜伏期之后，此期间无任何癌症迹象，且转移灶可能在原发肿瘤切除及辅助治疗多年后才出现临床表现。这一现象的可能解释是，肿瘤细胞已播散至转移部位，对常规治疗具有耐药性，并在长时间内保持休眠状态1-4。

继发部位存在休眠的癌细胞，此前已被描述为静息的单个细胞，既不增殖也不发生凋亡5-7。此外，这些单个细胞已被证明在疾病进展的早期阶段即从原发肿瘤播散8-10，并在患者的骨髓、血液和淋巴结中处于生长停滞状态1,4,11。因此，理解调控休眠状态或向增殖状态转换的机制，对于发现预防疾病复发的新靶点和干预策略至关重要。然而，由于缺乏可用的模型系统，揭示从肿瘤休眠向转移性生长转换的调控机制一直受到阻碍。

已有文献报道过用于研究肿瘤细胞转移进展的体内和离体模型系统1,12-14。然而，这些模型系统尚无法实时、高通量地揭示导致孤立的静止性肿瘤细胞转变为增殖性转移性疾病的具体分子机制。我们近期开发了一种三维体外模型系统，用于模拟在体内表现为静止（D2.OR、MCF7、K7M2-AS.46）或增殖性（D2A1、MDA-MB-231、K7M2）转移特性的细胞的体内生长特征。我们证明，在转移部位体内表现为静止的肿瘤细胞，在三维基底膜提取物（BME）培养环境中仍保持静止状态；而体内高度转移性的细胞则在经历一段可变但相对较短的静止期后，迅速在三维培养中增殖。尤为重要的是，通过利用该三维体外模型系统，我们首次证实细胞外基质（ECM）的组成在调控静止性肿瘤细胞是否向增殖状态转变中发挥重要作用，并在体内研究中验证了这一发现15-17。因此，本报告所述的模型系统提供了一种体外方法，可用于模拟肿瘤细胞静止状态，并研究微环境诱导其向增殖性生长转变的过程。

方案

1. 休眠及转移性肿瘤细胞系的细胞培养维持

  1. 在含有高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）和抗生素的 10 cm 培养皿中培养休眠期肿瘤细胞（D2OR/MCF7/K7M2-AS.46）和转移性肿瘤细胞（D2A1/MDA-MB-231/K7M2）。当细胞融合度达到 70–80% 时，进行以下实验分析。

2. 在3D-BME系统中培养的静息（休眠）和转移性（增殖）肿瘤细胞的细胞增殖检测

在三维系统中培养休眠/转移性细胞

  1. 在进行实验前一天晚上，将Cultrex生长因子减少型基底膜提取物（BME）置于4°C冰箱中解冻。注意：BME在操作过程中应始终置于冰上。
  2. 次日，在超净工作台内的冰盘上放置一块96孔板。使用带注射器的分配器，向每孔加入50–100 μl预冷的BME，确保孔内无气泡产生。将包被了BME的96孔板置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。
  3. 与此同时，吸除静息状态或转移性肿瘤细胞（按第1节制备）的培养基。用10 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿，吸除PBS后，向培养皿中加入2 ml预热至37°C的胰蛋白酶。将培养皿置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育5分钟。
  4. 将细胞转移至含有5 ml添加了10%胎牛血清（FCS）和抗生素的高糖DMEM培养基的15 ml锥形管中，并对细胞进行计数。
  5. 在室温下，以1500g的转速在组织培养离心机中离心5分钟，沉淀待培养的全部细胞。在我们的实验中，每种细胞系或时间点均准备2×103个细胞/孔。然而，具体数量可能因所用细胞系的不同而有所调整。
  6. 小心吸除上清液。注意：大多数情况下沉淀不可见，因此应保留少量液体。用手指轻弹15 ml锥形管底部，确保获得单细胞悬液。用含抗生素、补充2% FCS和2% BME的低糖DMEM（实验用培养基）重悬细胞沉淀。每2×103个细胞应加入100 μl实验用培养基。使用5 ml移液器反复吹打细胞多次，以维持单细胞悬液状态。
  7. 将100 μl细胞悬液接种至已包被BME的96孔板各孔中。为进行背景评估（见第2.8节），另在已包被BME的96孔板中每孔仅加入100 μl实验用培养基。将接种后的96孔板置于37°C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。每隔4天需用实验用培养基更换一次培养液。

增殖实验：

  1. 细胞增殖实验：在预定时间点向各孔中加入 20 μl Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation 检测试剂。在 37°C、含 5% CO2 的湿化培养箱中孵育 2 小时。使用酶标仪在 490 nm 波长处测定吸光度。为进行背景评估与扣除，向预先包被 BME 并仅覆盖检测培养基的孔中加入 20 μl Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation 检测试剂，使用酶标仪在 490 nm 处记录吸光度。

3. 静息（休眠）肿瘤细胞和/或转移性（增殖）肿瘤细胞中细胞信号分子的免疫荧光染色

在三维系统中培养休眠/转移细胞以进行免疫荧光染色

*以下方案改编自 Debnath J et al 发表的三维培养方案18。

  1. 按照第2.1节所述方法制备BME。次日：在超净工作台内将一个8孔玻璃载片系统放置于盛有冰的托盘上。使用200μl移液器向每个孔中加入50μl冰冷的BME。确保BME均匀铺展，孔内无气泡产生。将包被有BME的8孔玻璃载片置于37°C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育20分钟。
  2. 从第1节中收获静息或转移性细胞，并按照第2.3–2.4节所述方法进行培养准备。将待培养的全部细胞收集至一个15 ml锥形管中。我们为每种细胞系及每个时间点准备5 × 103个细胞/孔。在室温下以1500g离心力在组织培养离心机中离心5分钟。小心吸除上清液。注意沉淀通常不可见，因此需保留少量培养基。用手指轻弹15 ml锥形管底部，确保获得单细胞悬液。用检测培养基重悬细胞沉淀。每5 × 103个细胞应加入400μl检测培养基。使用5 ml移液管反复吹打细胞多次。此步骤至关重要，以确保维持单细胞悬液状态。
  3. 将400μl细胞混合液接种至每个包被有BME的8孔中的孔内。将接种后的8孔玻璃载片培养系统置于37°C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。每隔4天需用检测培养基更换一次培养液。

免疫荧光染色：

  1. 在预定时间点，吸除上层培养基，每孔加入 200 μl 含 4% 多聚甲醛（PFA）、5% 蔗糖和 0.1% Triton X-100 的固定液，室温孵育 5 分钟。吸除固定液，每孔加入 200 μl 含 5% 蔗糖的 4% PFA，室温孵育 25 分钟。
  2. 吸除固定液，每孔加入 400 μl 磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育 10 分钟。吸除 PBS，每孔加入 400 μl 含 0.05% Tween 20 的 PBS，室温孵育 10 分钟。
  3. 用 200 μl 10% 驴血清或 3% BSA 在室温下封闭固定后的细胞 1 小时（封闭液的选择应根据每种一抗的经验确定）。
  4. 吸除封闭液，每孔加入 200 μl 一抗（一抗稀释度应根据每种抗体的经验确定）。若使用 10% 驴血清进行封闭，则将一抗稀释于 10% 驴血清中；若使用 3% BSA 封闭液，则将一抗稀释于 3% BSA 中。4°C 条件下避光孵育过夜。
  5. 吸除一抗溶液，用 400 μl PBS 洗涤各孔，每次 15 分钟，共洗涤两次。吸除 PBS，每孔加入 200 μl 相应的驴抗 IgG-罗丹明红标记二抗（稀释度需根据经验确定），用铝箔包裹八孔载玻片，室温孵育 1 小时。
  6. 用 400 μl PBS 洗涤各孔（每次 15 分钟，共 3 次）。吸除 PBS，用含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂封片。将载玻片置于暗处室温干燥 40 分钟。载玻片可在 4°C 避光保存 1 周。使用共聚焦显微镜观察成像。

4. 代表性结果：

在3D培养中对休眠的D2.0R细胞和转移性D2A1肿瘤细胞进行增殖分析的示例如图1A所示。D2.0R细胞在整个为期14天的实验培养期间保持休眠（静止）状态，而高度转移性的D2A1细胞仅在培养后4至6天内保持休眠，随后开始增殖。在初始休眠阶段，许多细胞在3D培养中保持单细胞状态（图1B；第4天），而其他非增殖细胞则形成多细胞球状体。D2A1细胞在3D培养中由休眠状态向增殖状态转变（图1B；第12天）伴随着细胞形态的显著变化。因此，该检测可用于测试哪些因素可能促使休眠的D2.0R细胞从休眠状态中激活，以及哪些因素可能阻止D2A1细胞由休眠状态向增殖状态转变。图2展示了一种能够阻止D2A1细胞由休眠状态向增殖状态转变的试剂。如图2所示，使用肌球蛋白轻链激酶特异性抑制剂（ML-7）处理D2A1细胞，可使D2A1细胞维持在休眠状态。

通过细胞信号分子的免疫荧光染色，可研究在三维培养系统中处于静息状态和增殖状态的肿瘤细胞中的细胞信号传导。如图3所示，D2A1细胞在从静息状态（第1-4天）向增殖状态（第7天）转变过程中，肌球蛋白轻链的磷酸化水平显著升高（红色染色），并伴随F-肌动蛋白丝的重排，形成肌动蛋白应力纤维（绿色染色）。然而，通过shRNA或特异性药物（ML-7）抑制D2A1细胞中肌球蛋白轻链激酶的活性，可使D2A1细胞维持在静息状态，并导致肌球蛋白轻链磷酸化以及F-肌动蛋白应力纤维结构的形成受到抑制（图4）。

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图1. 体外 用于研究单个肿瘤细胞休眠及其向转移性生长转变的模型。A）休眠型 D2.0R 与转移型 D2A1 在三维条件下的增殖情况 Cultrex BME，n=8（均值 ± SE）。三次实验的代表性结果（* p≤0.05）。B）在三维条件下培养的 D2.0R 和 D2A1 细胞的光学显微镜图像 Cultrex BME 放大倍数 ×20。图示经 Barkan 等人修改 17.

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图2. 通过抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）阻止D2A1细胞在三维培养系统中从静息（G0期）向增殖状态的转变。D2A1细胞在三维Cultrex BME中培养的增殖时间过程，n=8（均值±标准误）。细胞未处理（对照组），或从培养第5天开始用特异性MLCK抑制剂（ML-7；5 μM）处理48小时。该图改编自Barkan等17。

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图3. D2A1细胞从静止状态向增殖性生长转变过程中，肌球蛋白轻链磷酸化伴随F-肌动蛋白的重新排列。将D2A1细胞培养在8孔玻璃载片上的3D Cultrex BME中。在不同时间点，固定细胞并使用DAPI（蓝色）标记细胞核定位，鬼笔环肽（绿色）标记F-肌动蛋白，以及抗磷酸化肌球蛋白轻链（MLC-p）抗体（红色）进行染色。F-肌动蛋白与MLC-p染色合并图像显示为黄色。在D2A1细胞从静止状态（第1–4天）向增殖性生长（第7天）转变的过程中，MLC-p表达增加，并伴随肌动蛋白应力纤维的形成（箭头所示）。共聚焦显微镜观察，放大倍数×63。白色标尺=20微米。该图改编自Barkan等17。

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图4. 抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）介导的D2A1细胞中F-肌动蛋白应力纤维的形成。 D2A1细胞未作处理（对照组），或在培养第5天开始用MLCK抑制剂（ML-7；5 μM）处理48小时，或转染随机序列shRNA或MLCK特异性shRNA，随后对磷酸化的肌球蛋白轻链（MLC-p，红色）、F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）进行染色。F-肌动蛋白与MLC-p染色的合并图像显示黄色信号。共聚焦显微镜观察，放大倍数×63。白色标尺=20微米。

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讨论

维持播散性肿瘤细胞处于休眠状态或促使其转变为转移性生长的潜在机制在很大程度上仍不清楚。这一现象在人类患者中极难研究4,12，且目前仅有少数临床前模型被开发用于解决这一问题。尽管如此，一些用于研究肿瘤休眠的体内和离体模型系统已被建立（详见文献1,12综述）。然而，现有的肿瘤休眠体内模型主要用于验证调控肿瘤休眠的潜在机制，却难以实现实时观察单个播散性休眠肿瘤细胞的生物学行为。

本文首次报道的三维系统模型可模拟单个肿瘤细胞的休眠状态及其向转移性生长的转变过程 体外 模型系统。可在3D系统中随时间追踪模拟肿瘤休眠（静息）及其向增殖转化的增殖检测。该检测可用于在相对短的时间内以高通量方式研究潜在维持肿瘤细胞处于静息状态或促使其活化增殖的因素/基因。此外，增殖检测还可作为高通量平台，用于筛选可能具有休眠表型的其他肿瘤细胞系。

由于从休眠肿瘤细胞中提取的RNA/蛋白质含量较低，因此通过传统的生化方法（如RT-PCR/蛋白质印...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究部分得到了美国国家癌症研究所院内研究计划的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM 高糖培养基Invitrogen11965-118
DMEM 低糖培养基Invitrogen11885-092
胎牛血清（FBS）Invitrogen10091-148
生长因子减少型 3-D Cultrex 基底膜提取物Trevigen Inc.蛋白浓度为 14–15 mg/ml
D2.0R 和 D2A1 细胞系5,19
K7M2 和 K7M2AS1.46 细胞20
MCF-7 和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞ATCC
8 孔玻璃载片系统Lab-Tek177402
Cell Titer 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒Promega Corp.G3580
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂Vector LaboratoriesH-1200
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
酶标仪Bio-Tec记录 490 nm 吸光度
共聚焦显微镜Carl Zeiss, Inc.放大倍数 ×63

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