一个 体外 研究肿瘤休眠及其向转移性生长转换的系统

摘要

一种改良的三维体外系统被用于研究多种肿瘤细胞系在重建基底膜中的生长特性，这些特性与肿瘤细胞在转移性继发部位所表现出的休眠或增殖行为相关 体内.

摘要

乳腺癌的复发通常发生在一段漫长的潜伏期之后，此期间无任何癌症迹象，且转移灶可能在原发肿瘤切除及辅助治疗多年后才出现临床表现。这一现象的可能解释是，肿瘤细胞已播散至转移部位，对常规治疗具有耐药性，并在长时间内保持休眠状态^1-4。

继发部位存在休眠的癌细胞，此前已被描述为静息的单个细胞，既不增殖也不发生凋亡^5-7。此外，这些单个细胞已被证明在疾病进展的早期阶段即从原发肿瘤播散^8-10，并在患者的骨髓、血液和淋巴结中处于生长停滞状态^1,4,11。因此，理解调控休眠状态或向增殖状态转换的机制，对于发现预防疾病复发的新靶点和干预策略至关重要。然而，由于缺乏可用的模型系统，揭示从肿瘤休眠向转移性生长转换的调控机制一直受到阻碍。

已有文献报道过用于研究肿瘤细胞转移进展的体内和离体模型系统^1,12-14。然而，这些模型系统尚无法实时、高通量地揭示导致孤立的静止性肿瘤细胞转变为增殖性转移性疾病的具体分子机制。我们近期开发了一种三维体外模型系统，用于模拟在体内表现为静止（D2.OR、MCF7、K7M2-AS.46）或增殖性（D2A1、MDA-MB-231、K7M2）转移特性的细胞的体内生长特征。我们证明，在转移部位体内表现为静止的肿瘤细胞，在三维基底膜提取物（BME）培养环境中仍保持静止状态；而体内高度转移性的细胞则在经历一段可变但相对较短的静止期后，迅速在三维培养中增殖。尤为重要的是，通过利用该三维体外模型系统，我们首次证实细胞外基质（ECM）的组成在调控静止性肿瘤细胞是否向增殖状态转变中发挥重要作用，并在体内研究中验证了这一发现^15-17。因此，本报告所述的模型系统提供了一种体外方法，可用于模拟肿瘤细胞静止状态，并研究微环境诱导其向增殖性生长转变的过程。

方案

1. 休眠及转移性肿瘤细胞系的细胞培养维持

1. 在含有高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）和抗生素的 10 cm 培养皿中培养休眠期肿瘤细胞（D2OR/MCF7/K7M2-AS.46）和转移性肿瘤细胞（D2A1/MDA-MB-231/K7M2）。当细胞融合度达到 70–80% 时，进行以下实验分析。

2. 在3D-BME系统中培养的静息（休眠）和转移性（增殖）肿瘤细胞的细胞增殖检测

在三维系统中培养休眠/转移性细胞

1. 在进行实验前一天晚上，将Cultrex生长因子减少型基底膜提取物（BME）置于4°C冰箱中解冻。注意：BME在操作过程中应始终置于冰上。
2. 次日，在超净工作台内的冰盘上放置一块96孔板。使用带注射器的分配器，向每孔加入50–100 μl预冷的BME，确保孔内无气泡产生。将包被了BME的96孔板置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育30分钟。
3. 与此同时，吸除静息状态或转移性肿瘤细胞（按第1节制备）的培养基。用10 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿，吸除PBS后，向培养皿中加入2 ml预热至37°C的胰蛋白酶。将培养皿置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育5分钟。

讨论

维持播散性肿瘤细胞处于休眠状态或促使其转变为转移性生长的潜在机制在很大程度上仍不清楚。这一现象在人类患者中极难研究^4,12，且目前仅有少数临床前模型被开发用于解决这一问题。尽管如此，一些用于研究肿瘤休眠的体内和离体模型系统已被建立（详见文献^1,12综述）。然而，现有的肿瘤休眠体内模型主要用于验证调控肿瘤休眠的潜在机制，却难以实现实时观察单个播散性休眠肿瘤细胞的生物学行为。

本文首次报道的三维系统模型可模拟单个肿瘤细胞的休眠状态及其向转移性生长的转变过程 体外 模型系统。可在3D系统中随时间追踪模拟肿瘤休眠（静息）及其向增殖转化的增殖检测。该检测可用于在相对短的时间内以高通量方式研究潜在维持肿瘤细胞处于静息状态或促使其活化增殖的因素/基因。此外，增殖检测还可作为高通量平台，用于筛选可能具有休眠表型的其他肿瘤细胞系。

由于从休眠肿瘤细胞中提取的RNA/蛋白质含量较低，因此通过传统的生化方法（如RT-PCR/蛋白质印.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 高糖培养基	Invitrogen	11965-118
DMEM 低糖培养基	Invitrogen	11885-092
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	10091-148
生长因子减少型 3-D Cultrex 基底膜提取物	Trevigen Inc.		蛋白浓度为 14–15 mg/ml
D2.0R 和 D2A1 细胞系			5,19
K7M2 和 K7M2AS1.46 细胞			20
MCF-7 和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞	ATCC
8 孔玻璃载片系统	Lab-Tek	177402
Cell Titer 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒	Promega Corp.	G3580
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
酶标仪	Bio-Tec		记录 490 nm 吸光度
共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Inc.		放大倍数 ×63