在本报告中，我们描述了一种三维皮肤重建模型，该模型在结构和组成上模拟了人类皮肤。该皮肤重建模型已被用于研究黑素细胞的生理特性、黑色素瘤的进展以及真皮干细胞的命运。此外，该模型还可作为药物评估的临床前工具。
本文内容
摘要
摘要
目前，实验性皮肤生物学中的大多数体外研究均在二维（2D）单细胞培养体系中进行，而越来越多的证据表明，当细胞生长于三维（3D）细胞外基质中并与其他细胞相互作用时，其行为会有所不同（1-5）。小鼠模型已被广泛用于研究组织形态发生的体内过程。然而，小鼠与人类皮肤在细胞结构和生理特性上存在显著差异，这使得将小鼠研究结果外推至人类变得困难。由于小鼠皮肤中的黑素细胞主要定位于毛囊中，因此其生物学特性与主要位于表皮基底层的人类黑素细胞明显不同。近年来开发的3D人皮肤重建模型使研究人员能够探究不同类型细胞之间的细胞-基质及细胞-细胞相互作用。这些重建皮肤包含一个由成纤维细胞嵌入I型胶原基质构成的“真皮”层，一个由多层分化角质形成细胞组成的“表皮”层，以及一个将表皮与真皮分离的功能性基底膜。胶原蛋白提供结构支架、营养输送以及细胞间相互作用的可能。包含黑素细胞的3D皮肤模型可重现人类皮肤中黑素细胞稳态及黑色素瘤进展的自然特征。与体内情况相似，在重建皮肤中，黑素细胞位于基底膜处，并与基底层角质形成细胞交错分布。黑色素瘤细胞表现出与原始肿瘤阶段（RGP、VGP及转移性黑色素瘤细胞）一致的特征体内特性。最近，研究人员已在人类真皮中鉴定出真皮干细胞（6）。这些多能干细胞可迁移至表皮并分化为黑素细胞。
方案
1. 三维人皮肤重建模型：
- 无细胞层的制备：在50 mL离心管中，将以下试剂在冰上混合：0.59 mL 10X EMEM， 50 μl 200 mM L-谷氨酰胺，0.6 mL 胎牛血清 120 μl 7.5% 碳酸氢钠和 4.6 mL 牛 I 型胶原蛋白。将 1 mL 混合液加入组织培养板的每个插件中。室温孵育 30 分钟，使凝胶充分凝固。混合液的颜色应为淡黄色至粉红色。
- 用0.25%胰蛋白酶/EDTA将培养瓶中的人成纤维细胞消化，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化。离心收集细胞，重悬于0.45 × 10⁶6 在含10% FBS的1.5 mL DMEM中培养细胞。对于真皮干细胞，通过轻敲培养瓶使细胞球脱落，离心收集6600个真皮细胞球（当真皮干细胞在干细胞培养基中生长时，会形成类似于神经球的细胞球状结构）。
- 细胞层制备：在50 mL离心管中加入以下成分，冰上混合：1.65 mL 10X EMEM， 150 μl 200 mM L-谷氨酰胺，1.85 mL 胎牛血清 350 μl 7.5% 碳酸氢钠，14 mL 牛 I 型胶原蛋白，以及步骤 2 中制备的 1.5 mL 成纤维细胞悬液（或 alternatively，使用 0.45 x 10⁶ 个细胞）6 成纤维细胞和6600个真皮球体加入1.5 mL真皮干细胞重建培养基I中，充分混匀。将3 mL混合液加入每个去细胞层包被的插入式培养小室中。于37℃孵育45分钟 37 °C 在5 % CO₂环境中2 组织培养孵育箱。混合液的颜色应从淡黄色至粉红色。待凝胶凝固后，在皮肤重建培养板的每个孔中加入含10%胎牛血清的DMEM（插入物内2 mL，外10 mL）。孵育4天，并确保凝胶发生收缩。
- 吸弃每个小室内外两侧的培养基。向小室内侧加入2 mL洗涤液（含1%透析胎牛血清的HBSS），外侧加入10 mL，以去除常规血清。于37°C孵育1小时 37 °C.
- 皮肤重建培养基的制备：
- 对于正常黑素细胞和真皮干细胞重建：配制基础培养基（500 mL），混合以下试剂：490 mL 无血清角质形成细胞培养基、1.8 mL 牛垂体提取物、10 mL 透析胎牛血清。 500 μl 的 10 μg/mL 干细胞因子， 562.5 μl 的 4 μg/mL bFGF 和 500 μl 的 264 μg/mL ET-3。培养基 I：加入 10 μl EGF的 100 μg/mL 至100 mL基础培养基中。培养基II：添加 2 μl EGF 加至 100 mL 基础培养基中。培养基 III：添加 720 μl CaCl2 从1 M稀释至300 mL基础培养基。
- 用于黑色素瘤皮肤重建：配制 Medium I（100 mL），混合以下试剂：72.5 mL DMEM、24 mL F12（HAM's）、2 mL 200 mM L-谷氨酰胺， 200 μl 氢化可的松 269 μg/mL, 200 μl 500X ITES 200 μl 0.05 M O-磷酸乙醇胺， 200 μl 90 mM 腺嘌呤， 200 μl 2 nM 的孕酮， 240 μl CaCl2 1 M 的 200 μl 10 nM 三碘甲状腺原氨酸及 100 μl 去螯合新生小牛血清（将3 g Chelex 100溶解于100 mL血清中，搅拌1.5小时） 4 °C，过滤除菌）。配制100 mL培养基II，混合以下试剂：72.5 mL DMEM、24 mL F12（HAM's）、2 mL 200 mM L-谷氨酰胺， 200 μl 氢化可的松 269 μg/mL, 200 μl 500X ITES 200 μl 0.05 M O-磷酸乙醇胺， 200 μl 90 mM 腺嘌呤， 200 μl 2 nM 的孕酮， 240 μl 1 M CaCl2 200 μl 10 nM 三碘甲状腺原氨酸及 100 μl 新生牛血清。制备300 mL培养基III，混合以下试剂：142.5 mL DMEM、142.5 mL F12（HAM's）、6 mL 200 mM L-谷氨酰胺， 600 μl 氢化可的松 269 μg/mL, 600 μl 500X ITES 600 μl 0.05 M 磷酸乙醇胺 600 μl 90 mM 腺嘌呤， 600 μl 2 nM 的孕酮， 720 μl CaCl2 1 M 的 600 μl 10 nM 三碘甲状腺原氨酸和 6 mL 新生小牛血清
- 用0.05%胰蛋白酶/EDTA将人角质形成细胞从培养瓶中消化，用大豆胰蛋白酶抑制剂（250 mg/L，溶于1×磷酸盐缓冲液）中和胰蛋白酶，离心，将细胞沉淀重悬于4.17 × 10⁶细胞/mL6 细胞/mL，于皮肤重建培养基 I 中。
- 用0.05%胰蛋白酶/EDTA将人黑色素细胞或黑色素瘤细胞从培养瓶中消化，用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，离心，将细胞沉淀重悬于0.83 × 10⁶6 细胞/mL，于皮肤重建培养基 I 中
- 移除每个小室内外两侧的洗涤液。
- 加入皮肤重建培养基I（1.5 mL加至每个插入物内侧，10 mL加至外侧）。
- 取 600 μl 角质形成细胞的细胞悬液 600 μl 黑色素细胞或黑色素瘤细胞的细胞悬液，充分混匀。分装 200 μl 将混合细胞悬液逐滴加入每个插入物的内侧。对于真皮干细胞重建，使用 100 μl 仅用于角质形成细胞悬液。在37°C、5% CO2培养箱中孵育2天。 37 °C.
- 吸出每个插入物内部和外部的皮肤重建培养基 I。加入皮肤重建培养基 II（内部 2 mL，外部 10 mL）。于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续培养 2 天 37 °C.
- 吸出每个插入物内部和外部的皮肤重建培养基II，仅在外侧加入7.5 mL皮肤重建培养基III。从此开始，重建皮肤表面暴露于空气中。每隔一天更换一次培养基III，持续至第18天。
- 第18天收获皮肤重建组织：
- 吸出插入物内部和外部的培养基。
- 用镊子从托盘中取出插件。
- 用手术刀片沿接近边缘处画出一个圆形，切割出重建结构（包括聚碳酸酯滤膜）。
- 在硬质表面上将重建物和滤膜各切成两半。
- 对于石蜡切片：将重建组织的一半置于组织学包埋盒中，夹在两张黑色TBS活检纸之间，将整个包埋盒浸入10%福尔马林中固定超过4小时。随后将包埋盒转移至70%乙醇中，并于 4 °C 直到准备进行石蜡包埋切片处理时为止。
- 对于冷冻切片：
- 将另一半重建样本置于50%蔗糖溶液中 4 °C 1-2小时，然后将蔗糖更换为2 M，并置于 4 °C 再继续孵育1-2小时。
- 将最佳切割温度冷冻介质（OCT）加入一次性底模中，使其充满约50%的模具体积。避免OCT中产生气泡。
- 用镊子夹住重建组织的边缘，将其从蔗糖溶液中取出。放置于Kimwipes纸上，直至Kimwipes吸干蔗糖溶液。
- 用镊子和刮勺将重建组织转移至覆盖有OCT的底模上。用更多OCT覆盖重建组织的顶部，直至底模完全填满。确保OCT中无气泡，以免影响切片操作。
- 将底模均匀地放置在粉碎的干冰上，使OCT完全冻结。
- 用锡箔纸包裹基模并置于 -70 °C 直到准备使用冷冻切片机进行切片为止。
- 在小鼠身上移植皮肤重建组织：
- 准备一个50 mL Falcon管，加入5 mL DMEM（用于小鼠皮肤的冻存与解冻）。
- 使用约6周龄的雌性SCID裸鼠（无毛非近交系）。
- 小鼠使用异氟烷（EZ麻醉系统）进行麻醉：首先在诱导室中以4%异氟烷进行初始麻醉（在将小鼠移至手术台之前），随后在手术过程中通过鼻罩呼吸器维持麻醉（异氟烷浓度：1.5–2%）。使用加热垫提供保温以防止低体温，并涂抹无菌眼用润滑剂以预防麻醉期间的眼部损伤。
- 将600 mL水倒入烧杯中，置于加热板上，保持水温在40 - 60 °C.
- 用复方安息香酊和酒精棉片清洁小鼠皮肤。
- 在小鼠背部上方标记一条线，以便后续缝合时保持相同位置。
- 使用虹膜剪和镊子在小鼠背部上方剪出一个直径约1.2 cm的圆形创面。用无菌纱布覆盖创面。将圆形小鼠皮肤放入5 mL DMEM中，然后置于液氮容器中直至完全冻结。将冻存管放在加热板上的热水中解冻，直至完全融化。重复此冻融过程3次。
- 使用手术刀将皮肤重建组织从Transwell上分离，并极为小心地移除膜，将皮肤重建组织（表皮面朝上）转移至创面床顶部。
- 将小鼠皮肤（表皮面朝上）放置在皮肤重建模型的顶部。
- 在先前标记的位置缝第一针，第二针缝在底部，然后在两侧各缝两针以固定小鼠皮肤。
- 移植后清洁小鼠皮肤。取下鼻罩，将小鼠置于加热垫上直至清醒并能自主活动。
- 将小鼠放入新笼子中。
- 术后镇痛：手术后立即皮下注射美洛昔康（1 mg/kg），术后24小时和48小时各给药一次。
2. 代表性结果：
含有正常黑素细胞和真皮干细胞的皮肤重建
皮肤重建物在带有插件的特殊6孔板中进行培养。真皮层在前四天使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基进行培养（图1A）。当角质形成细胞与黑素细胞或黑色素瘤细胞共接种时，使用皮肤重建培养基I（图1B）。在第9天将表皮暴露于空气中，以促进角质形成细胞的分化（图1C）。到第18天，皮肤重建物的表皮由多层分层的角质形成细胞构成，未分化的基底层与逐级分化的上层细胞呈垂直排列（图1D）。利用黑素细胞标志物S100对重建组织切片染色显示，黑素细胞定位于表皮基底层，并通过树突状突起与多个角质形成细胞相互连接（图1E）。真皮层包含嵌入I型胶原基质中的成纤维细胞，而IV型胶原的沉积则标志着分隔表皮与真皮的基底膜（图1F）。当将真皮干细胞（用GFP慢病毒载体标记）与成纤维细胞共同嵌入I型胶原基质中时，这些干细胞会迁移至表皮并分化为黑素细胞（1）（图2）。表皮中形成多层角质形成细胞结构。
黑色素瘤肿瘤的皮肤重建
临床病理学研究表明，黑色素瘤的进展呈逐步过程：普通获得性痣、发育不良痣、RGP（水平生长期）黑色素瘤、VGP（垂直生长期）黑色素瘤以及转移性黑色素瘤（7）。在二维培养中，不同阶段的黑色素瘤细胞系在形态上彼此相似（图3A-D），但当它们被纳入皮肤重建模型时，细胞的行为则反映了其体内的特征。in vivo。在皮肤重建模型中，正常黑色素细胞的位置和增殖速率受到严格调控（图3E）。RGP期原发性黑色素瘤WM35主要在表皮中增殖（图3F），而VGP期黑色素瘤WM793则侵入真皮层生长（图3G）。转移性黑色素瘤1205Lu则强烈侵袭至真皮深层（图3H）。
图1. 含正常黑素细胞的皮肤重建结构。 A-C展示了皮肤重建结构的大体外观。A. 成纤维细胞与胶原混合后在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，形成真皮层。B. 将角质形成细胞和黑素细胞接种于真皮层上方，并在皮肤重建培养基中生长。C. 第9天将表皮暴露于空气中。D. H&E染色的皮肤重建切片显示表皮具有垂直排列的基底层以及依次分化的多层细胞结构；真皮层中含有嵌入Ⅰ型胶原基质中的成纤维细胞。E. S100阳性黑素细胞（黑色箭头）排列于基底膜处，并与多个角质形成细胞相接触。F. 胶原Ⅳ染色显示了分隔表皮与真皮的基底膜。D-F中所有染色均在经甲醛固定、石蜡包埋的切片上进行。
图2. 皮肤重建结构中的真皮干细胞迁移至表皮并分化为黑色素细胞。 在接种角质形成细胞后的第5天，单个GFP阳性细胞（绿色）开始从细胞球向外迁移。此时表皮仍由单层细胞构成。第8天时，少数细胞到达表皮-真皮交界处。到第10天，GFP阳性细胞紧密排列于基底膜位置。迁移至表皮的GFP阳性细胞表达黑色素细胞标志物HMB45（红色，由白色箭头指示）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。表皮已发育成多层结构。基底膜以白色虚线标示。
图3. 不同阶段黑色素瘤的皮肤重建模型： A-D. 在二维培养条件下生长的正常黑素细胞和黑色素瘤细胞。A. 包皮来源的黑素细胞。B. RGP期WM35细胞。C. VGP期WM793细胞。D. 转移性黑色素瘤1205Lu细胞。E. 正常黑素细胞定位于基底膜处。F. RGP期黑色素瘤WM35细胞在表皮内以细胞簇形式生长。G. VGP期黑色素瘤WM793细胞通过基底膜侵入真皮层。H. 转移性黑色素瘤1205Lu细胞强烈侵袭至真皮深层。
故障排除
| 问题 | 故障排除 |
| 胶原混合物未凝固 | 胶原混合物的颜色应为淡黄色至粉红色，否则pH值可能不正确，导致胶原无法形成凝胶。如果颜色呈亮黄色，应逐滴加入更多碳酸氢钠。 |
| 胶原在混合过程中提前沉淀 | 在将胶原混合物加入插入物之前，应始终保持所有组分处于冰上 |
| 收缩后的胶原不均匀（一侧比另一侧厚） | 校准培养箱的搁板 |
| 表皮形成的角质形成细胞层数少于三层 | 使用低代次的未分化角质形成细胞 |
讨论
我们已描述了利用正常人黑素细胞、真皮干细胞和黑色素瘤细胞生成三维皮肤重建模型的方法。在单层培养条件下，无论细胞来源或临床分期如何，黑素细胞均呈现相似的形态（扁平状、梭形或更具树突状）。相比之下，三维皮肤重建模型能够重现黑色素瘤细胞分期特异性的生物学特性。正常人黑素细胞以单个细胞形式定位于表皮与真皮层之间的基底膜处。RGP期原发性黑色素瘤细胞沿基底膜形成小簇状生长，而更具侵袭性的VGP期黑色素瘤细胞则形成大簇并突破基底膜侵入真皮层。转移性黑色素瘤细胞则向各个方向生长，以单个细胞或细胞簇的形式深入侵入真皮层。该模型可通过测量侵袭深度和增殖范围进行定量分析。除了用于正常及恶性黑素细胞的表征外，利用该模型还可直接诱导真皮干细胞分化为成熟黑素细胞，后者可归巢至表皮基底层并建立 真正有效的 通过上调E-cadherin与角质形成细胞进行通讯（6）。
利用病毒载体，我们能够激活或失活基因功能，从而更好地理解皮肤重建中每种细胞类型所表达基因的动态变化及其功能意义，这有望成为研究黑素细胞转化机制以及黑色素瘤进展的有效模型（8）。通过将皮肤重建物移植到免疫缺陷动物体内，现已能够对细胞表型进行长期观察。这种人源皮肤-小鼠嵌合体是研究黑色素瘤发生及黑色素瘤转移的优秀研究工具。
皮肤重建模型也可作为药物评估的有效平台。许多在二维培养条件下能够清除癌细胞的药物，在实验和临床应用中往往效果甚微。如图所示，在 体内 肿瘤，三维培养中的黑色素瘤细胞通常对在二维培养中有效的药物产生耐药性，表明微环境会调控黑色素瘤的信号通路。为了成功进行药物研发，三维皮肤重建模型是预测化合物效应的理想临床前工具。 体内 (9,10).
总之，皮肤重建模型弥合了体外与体内研究之间的鸿沟。 体外 和 体内 研究将有助于更深入地了解哪些基因参与了转化过程，以及干细胞如何促进这一转化。
致谢
感谢Wistar研究所动物设施、显微技术设施、组织技术设施和研究中心供应中心。本研究部分由美国国立卫生研究院资助，项目编号为CA 076674、CA 098101、CA 025874和CA 10815。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | BioWhittaker | 12-684F | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 25030-081 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH-30071.02 | |
| 牛跟腱酸提取胶原蛋白 | Organogenesis | 200/50 | |
| 带插件的组织培养6孔板 | Organogenesis | 9285 | |
| 无血清角质形成细胞培养基 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 17005042 | |
| 透析胎牛血清 | Hyclone | SH-30079.03 | |
| 重组人干细胞因子 | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 | |
| 人内皮素-3 | American Peptide | 88-5-10 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C-7902 | |
| DMEM | JRH 生物科学 | 56430-10L | |
| F12 (HAM’s) | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 11765-54 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H-0888 | |
| 胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒（ITES） | BioWhittaker | 17839Z | |
| O-磷酸乙醇胺 | Sigma-Aldrich | P0503 | |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P-8783 | |
| 三碘甲腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| 新生小牛血清 | Hyclone | SH3011802 | |
| 10% 缓冲福尔马林 | Surgipath | 00600 | |
| 最佳切割温度冷冻介质（OCT） | Sakura Finetek | 4583 | |
| 多用包埋盒 | Surgipath | 02293-BX | |
| TBS 活检纸 | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| TBS 活检纸 | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| 一次性底模 | Fisher Scientific | 15-182-501C | |
| 复方安息香酊 | Professional Disposables, Inc | S42450 | |
| 酒精消毒棉片 | CVS 药房 | ||
| 黑色编织丝线 5-0 | Ethicon Inc. | 682G | |
| 纱布敷料（无菌） | CVS 药房 | ||
| 镊子 | Roboz 外科器械公司 | RS5070 | |
| 虹膜剪 | Roboz 外科器械公司 | RS5913 | |
| 手术刀片 | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976 | |
| EZ 麻醉系统 | Euthanex Corp. | ||
| SCID 无毛非近交系小鼠 | Charles River Laboratories |
参考文献
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).
- Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).
- Kremer, M., Lang, E., Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).
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- Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).
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