多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

摘要

本文全面概述了构建口腔癌小鼠模型的技术，以及通过多光子显微镜对标记细胞进行舌内肿瘤侵袭的定量监测方法。该系统可作为评估抗侵袭性化合物分子机制及药物疗效的有用平台。

摘要

头颈部癌症的局部区域侵袭与转移风险相关，为制定和实施患者管理策略带来了巨大挑战。已开发出口腔癌的原位小鼠模型，以促进对影响侵袭因素的研究，并作为评估抗肿瘤治疗药物的模型系统。在这些模型中，通常通过常规组织学或 体内 生物发光方法。这些技术的主要缺点是无法准确地以三维形式可视化并量化原发部位早期肿瘤细胞的侵袭。本文介绍了一种将舌鳞状细胞癌（SCOT）的成熟模型与双光子成像技术相结合的实验方案，以实现对舌部肿瘤扩散的多向可视化。OSCC-19头颈部肿瘤细胞系经稳定改造，可表达与mCherry荧光蛋白融合的F-肌动蛋白结合肽LifeAct（LifeAct-mCherry）。Fox1^nu/nu 注射了这些细胞的小鼠均能稳定形成肿瘤，使得舌部可被观察到 离体 双光子显微镜的应用。该技术能够在不破坏局部肿瘤微环境的前提下，对切除舌组织中肿瘤主体及局部侵袭性细胞进行原位可视化观察。此外，该系统可通过计算侵袭细胞从原发肿瘤部位迁移的距离，实现对肿瘤细胞侵袭程度的定量分析。总体而言，该方法为研究影响舌鳞状细胞癌（SCOT）侵袭的因素以及开发针对性治疗策略以防止局部侵袭和远处转移提供了更为完善的模型系统。该方法还有望最终与其他成像模式结合，应用于活体环境中的研究。

方案

1. 细胞系、载体构建与慢病毒制备

1. 人头颈部肿瘤细胞系（OSC19 或 UMSCC1）在完全培养基中培养，培养基成分为 DMEM（Cellgro 货号 50-003-PB），添加 10% 胎牛血清 FBS（Hyclone 货号 SH30070.03）、1% 青霉素/链霉素（Cellgro 货号 30-002-CI）和 1% 非必需氨基酸（Cellgro 货号 25-025-CI）。
2. 为将 LifeAct-mCherry 编码序列转入 pLL7.0 慢病毒载体，通过定点诱变（Stratagene 货号 200518-5）在母本 mCherry cDNA 的 Sbf1 识别位点引入三个同义突变，从而改变该识别序列。随后，将改造后的 LifeAct-mCherry 序列通过 PCR 扩增，并在两端引入 EcoR1/Sbf1 限制性酶切位点，再亚克隆至 pLL7.0 载体中，构建出 pLL7.0-LifeAct-mCherry 质粒。

2. pLL7.0-LifeAct-mCherry 病毒的制备

1. 病毒生产按照慢病毒表达系统手册（System Bioscience 版本 2-051018）进行。
2. 包装细胞系 293T/17 细胞（ATCC 货号 # CRL-11268）在与 HNSCC 细胞系相同的完全培养基中培养至 40% 汇合度。
3. 使用 CalPhos（Clontech 货号 # 631312）以 3:2:1 的比例分别转染 pLL7.0-LifeAct-mCherry、psPAX2 和 pVSV-G 载体。
4. 24 小时后，将转染后的初始培养基更换为新鲜培养基。
5. 随后每 12 小时收集并更换一次培养基，持续 72 小时，并将收集的培养基储存于 4°C。

3. 稳定表达 LifeAct-mCherry 的头颈部细胞系的建立

1. 收集的培养基在 4°C 下以 2000 rpm 离心 10 分钟。
2. 将 1 ml 含病毒的澄清培养基直接加入 OSC19 或 UMSCC1 细胞中，孵育 12 小时。随后洗涤细胞，并再加入 1 ml 病毒继续孵育 12 小时。
3. 用含有 200 mg/ml 嘌呤霉素的培养基处理细胞，持续两周，以筛选耐药克隆。
4. 通过荧光显微镜观察，对存活的克隆进行 LifeAct-mCherry 表达的视觉筛选。使用无菌 3 mm 克隆环（Fisher 货号 # 0790710A）对单个阳性克隆进行胰蛋白酶消化分离。
5. 阳性细胞在含有 200 mg/ml 嘌呤霉素的培养基中维持培养，直至冻存或用于原位注射。

4. 原位肿瘤异种移植模型的建立

1. 所有动物实验均按照西弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准的方案（09-0821）进行。
2. 将表达 LifeAct-mCherry 的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化，离心后将 2.5 × 10⁴ 个细胞重悬于 50 μL 完全培养基中。
3. 将肿瘤细胞加载至连接 27½ 号针头的 1 mL 注射器中。
4. 使用 80 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪联合麻醉 8 周龄雌性裸鼠（Fox1^nu/nu，Harlan Laboratories）。麻醉期间将小鼠置于加热垫上，维持体温在 37–40 °C 之间。
5. 使用无菌镊子轻轻夹住舌尖，并小心地将其拉出口腔。
6. 缓慢将细胞注射至每侧舌体的一侧，以在舌中央形成一个膨大的肿块，同时避免损伤舌动脉。
7. 小鼠注射 2.1 mg/kg 育亨宾后放回加热垫，麻醉恢复期间持续监测 2–3 小时。
8. 苏醒后，将小鼠转移至含有软质转基因面团饲料（Bioserve 货号 S3472）的无菌笼具中。
9. 每 2–3 天称量小鼠体重，并通过肉眼观察监测肿瘤的发生情况。

5. 小鼠舌头的制备 离体 成像

1. 在不同时间点（通常为注射后2-4周）携带肿瘤的小鼠通过吸入二氧化碳实施安乐死。
2. 取出舌组织，用1×PBS冲洗，并使用本地手工店购买的单丝缝纫线和8号缝纫针，将其固定在常规石蜡组织包埋盒（StatLab 货号 H104）的一侧。
3. 舌组织固定后，将整个包埋盒组件置于30 mm的细胞培养皿中，并浸入1×PBS中。
4. 处理后的舌组织立即用于双光子激发显微镜成像。

6. 使用双光子显微镜对舌部肿瘤进行成像

1. 将舌组织盒置于盛有1×PBS的60 mm培养皿中，并固定在特制支架上，该支架连接于倒置显微镜（可移动显微镜（MOM）；Sutter Instruments）物镜下方的可伸缩悬臂装置（Chamber Shuttle，Siskiyou Instruments）。
2. 将40倍/0.8数值孔径的水浸物镜直接放置在可见肿瘤病灶表面或上方。使用双光子显微镜成像，钛宝石激光器（Mira，Coherent）的激光强度设为60 mW，输入波长为755 nm，以优化mCherry荧光信号。
3. 以1 μm为步进深度，在15至100 μm的总组织深度范围内（根据肿瘤体积而定），连续采集1 mm范围内的激光扫描图像。图像采集使用基于MATLAB平台开发的开源程序ScanImage（由HHMI Janelia Farms的Karel Svoboda实验室研发）。ScanImage生成双通道光栅扫描信号，用于控制x/y轴的检流计扫描镜，同时通过数据采集卡（PCI-6610S，National Instruments）同步接收最多四个通道的光电倍增管（PMT）信号。PMT信号在输入NI-DAQ采集卡并在显示器上显示前，先经由低噪声电流前置放大器（SR570，Stanford Research System）进行放大。ScanImage通过控制物镜的z轴实现z轴层扫图像采集，并支持单次或循环模式下的延时成像。图像以单个TIFF文件保存，位深度为16位。

7. 使用 Amira 软件进行图像分析

1. 用于肿瘤定量的Amira成像：在Aimra软件中打开包含z轴层叠图像的TIFF文件。
2. 选中文件名，选择并应用Voltex功能以生成三维重建图像。在重建图像中通常可见一个较大的原发性肿瘤，以及多个较小且分离的侵袭性细胞群（IG）（见图6A）。
3. 为选择原发性肿瘤区域，依次选择“Open Data”、“Labeling”和“Label Field”。
4. 对原发性肿瘤进行阈值分割：选中所有z轴层叠图像，并在z平面中滚动浏览图像，确保仅包含三维空间内的原发性肿瘤区域。该区域通常是视野中尺寸最大的结构，在沿z平面扫描时通常呈现为分段显示的图像。
5. 使用魔棒/阈值功能校正背景荧光，并在不丢失任何肿瘤信号的前提下将其从图像中去除。高亮“Inside File”标签，点击⊕按钮，并勾选“All Slices”复选框。此操作将在每个z轴层叠切片中为已阈值化的原发性肿瘤区域生成彩色边框。
6. 为选择IGs，选择“New”功能。选取单个IG，并通过在z平面中滚动确认其与原发性肿瘤无关联。
7. 勾选“All Slices”并点击⊕按钮。重命名该文件（例如：IG 1）。
8. 对已确定的IG重复步骤7.4中的阈值分割操作和步骤7.5中的高亮操作。为IG选择与原发性肿瘤区域不同的轮廓颜色。
9. 根据需要对图像中所有其他IG重复上述操作，通过z平面扫描确保所有IG均被标记。为每个已识别的IG使用不同颜色有助于后续在图像中进行区分。
10. 当原发性肿瘤和所有IG均被选定后，从下拉菜单中选择“Segmentation”，然后选择“Material Statistics”。该功能将提供原发性肿瘤的体积测量值及其X、Y、Z坐标中心点，用于计算各IG距肿瘤中心的距离。
11. 在获得体积数据后，计算每个IG相对于原发性肿瘤中心核心的距离。选择“Segmentation”，然后选择“Material Statistics”。此步骤将所有测量结果转换为像素单位。根据显微镜物镜的校准参数及任何额外的放大倍数（如变焦功能）将像素转换为微米。在本实验所用的显微镜和设置条件下，使用40X物镜且无变焦，校准系数为1像素 = 0.298 μm。将数据导入Excel电子表格，获取原发性肿瘤的三维参数（X1, Y1, Z1）以及每个IG的对应参数（例如：第一个IG为X2, Y2, Z2）。
12. 每个IG距原发性肿瘤中心的侵袭距离（单位：微米）通过公式 √((X2-X1)² + (Y2-Y1)² + (Z2-Z1)²) 计算得出。
13. 肿瘤侵袭指数（T_I）通过公式 T_I = N_T × V_T × D_T 计算，其中 N_T 表示图像中IG的总数，V_T 表示所有IG的总体积，D_T 表示所有侵袭性细胞群从原发性肿瘤中心出发的总移动距离。

8. 使用 Nikon NIS-Elements 软件进行三维渲染

1. 通过将整个肿瘤图像的原始16位单色TIFF文件导入尼康NIS-Elements软件包（Nikon, Melville, NY），可生成具有更高地形细节的三维渲染图像。选择“文件”，然后选择“ND”，再选择“从文件序列创建ND文件”。选择TIFF的z序列图像堆栈，并指定合适的步长。
2. 在xy平面对ND文档进行校准。使用手动校准方法设定单个像素的尺寸。
3. 选择“体积视图”。使用“HQ”功能在z平面计算额外切片以提高图像质量。在“3D渲染设置”中，选择“高级渲染器”，质量设为“超高清细节”和“全分辨率”。选择“Alpha混合”以突出显示肿瘤表面。
4. 优化三维图像以用于展示。对肿瘤及其相关IGs进行放大，按需裁剪图像。在xyz平面旋转图像，并调整LUTs（查找表）。
5. 截取图像用于展示。选择“编辑-创建视图快照（8位RGB）”。根据需要命名并保存文件。

9. 代表性结果

图1. 整体示意图，展示原位舌部肿瘤构建及原位双光子成像的关键步骤。

图 2. 将表达 LifeAct-mCherry 的 OSC19 细胞注射至小鼠舌部。

图3 用于双光子成像的切除后含肿瘤的小鼠舌组织。

图4. 含肿瘤的舌组织在双光子显微镜上准备成像时的放置方向。

图5. 来自ScanImage的代表性截图，展示初始双光子图像的原始数据采集。

图 6. 原位 OSC19 肿瘤中肿瘤侵袭的图像分析与定量。 Amira Voltex 渲染的代表性截图 (A) 和单个阈值化 z 层切面 (B)，其中紫色轮廓标记原发肿瘤，蓝色轮廓标记侵袭组 1（IG-1），红色轮廓标记 IG-2，绿色轮廓标记 IG-3，作为识别流程的示例。箭头在 (A) 和 (B) 中指示 IG。 C. 八个独立 IG 的体积与侵袭距离关系图，用于计算肿瘤侵袭指数（Ti）。

图7. 本方案获得的肿瘤及侵袭性肿瘤组织的代表性图像，与传统免疫组化（IHC）方法获得的图像对比。A. 携带UMSCC1原位肿瘤的整只小鼠舌组织石蜡切片。采用常规程序进行免疫组化染色，一抗为针对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）特异性细胞标志物emmprin的抗体（Zymed；货号# 34-5600），稀释比例为1:1000，使用OmniMap DAB抗兔检测试剂盒（Ventana，货号# 760-149）显色，随后进行铁苏木精染色。使用Olympus ZX70 Provis显微镜配备Optronics MicroFire CCD相机在4倍放大倍数下逐幅采集覆盖整个舌区域的图像，并利用StereoINvestigator成像软件包（MBF Bioscience）进行重建。肿瘤位于舌尖部位清晰可见。图(B)展示了侵袭前沿及单个肿瘤细胞群（箭头）的放大区域。C. 代表性OSCC19肿瘤的Nikon NIS-Elements三维渲染图像。可见轮廓细节增强，侵袭性细胞群（IGs，箭头）清晰可辨。所有图像中的标尺 = 100 μm。

讨论

原位小鼠模型已被证明在研究头颈部癌的多个方面具有重要价值^1,2。我们将一种已建立的SCOT原位模型系统³与标记mCherry的细胞的双光子显微成像相结合，构建了一种用于研究头颈部肿瘤细胞早期侵袭事件的系统。在该操作过程中，我们注意到细胞可能从肿瘤注射部位泄漏，尤其是在六周龄或更小的小鼠中，这是由于舌体尺寸不足所致。因此，我们采用年龄较大的小鼠以避免这一问题。年龄较大的小鼠舌体更大，也有助于避免舌动脉破裂及舌部过度出血。当舌部在初始注射部位出现明显肿胀时，肿瘤成瘤率显著提高。这种肿胀会在一至两小时内随着注射液体的吸收而消退。注射后一至两周即可观察到肿瘤生长，表现为舌表面出现一个小的白色隆起，其大小与注射的细胞数量相对应。我们还注意到，在本研究中使用的40倍物镜下，无法分辨单个肿瘤细胞，但可以识别出侵袭性细胞簇（IGs），这些细胞簇重现了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）典型的侵袭模式。

迄今为止，该模型已广泛用于测试特定分子以及多种抗肿瘤药物对舌癌细胞（SCOT）生长和侵袭的作用，其疗效通过免疫组化（IHC）或生物发光方法监测颈淋巴结转移来评估^4-7。在此系统中形成的肿瘤靠近舌表面（图7），便于应用双光子显微镜对整个肿瘤进行原位成像，以观察其作为侵袭性多细胞簇的形态。该方法还可用于以细胞分辨率可视化肿瘤的侵袭过程。双光子显微镜此前已被用于研究头颈部癌症在原位^8,9和异种移植^8,10模型中的实验性治疗。然而，这些研究与我们的方案存在两个主要差异。首先，这些研究使用细胞外标记物来靶向或识别头颈部肿瘤细胞，这可能仅能检测到充分接触血液循环的肿瘤细胞，从而限制了检测范围。其次，这些研究未将靠近原发灶、可能模拟早期转移活动的肿瘤细胞侵袭作为实验参数进行评估。我们的方案能够在小鼠舌部肿瘤进展的任何阶段，直接定量肿瘤细胞的侵袭情况。尽管本文所述方法使用离体舌组织进行成像，我们目前正在优化该技术，以实现在活体小鼠中对肿瘤侵袭进行成像，并结合生物发光技术，在同一动物体内同步监测早期侵袭、局部淋巴结受累及远处转移。为实现活体成像，需对该方案进行若干改进，包括设计合适的成像平台以固定和维持小鼠体位，以及建立实用的系统，在成像过程中对麻醉小鼠的口腔进行适当灌流。一旦优化完成，这些改进将使研究人员能够在较长时间内，在动物体内研究潜在促侵袭分子的作用，并评估抗侵袭化合物对局部侵袭及更远端转移的影响。