我们介绍一种低成本、高通量的方法，用于在大肠杆菌（E. coli.）中筛选真菌内切葡聚糖酶活性。该方法依赖于底物降解的简单视觉读数，无需酶纯化步骤，且具有高度可扩展性，因而能够快速筛选大量酶变异体文库。
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摘要
摘要
纤维素酶（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶）可将纤维素水解为组分糖类，这些糖类继而可转化为燃料醇1。利用纤维素生物质进行酶水解以提供可再生能源的潜力，已促使人们加大努力，通过蛋白质工程改造纤维素酶以实现经济高效的燃料生产2。其中特别受到关注的是真菌纤维素酶3-8，这类酶目前已在食品和纺织品加工等工业领域中得到应用。
在纤维素酶突变体文库中鉴定出具有活性的变异体对酶的改造过程至关重要；具有活性的突变体可进一步用于检测其改良特性，或进行额外的诱变处理。真菌纤维素酶的高效改造一直受到缺乏针对天然宿主的遗传工具以及在异源宿主中表达酶的困难所限制。最近，Morikawa 及其同事开发了一种在大肠杆菌（E. coli）中表达来自斜卧青霉（H. jecorina）内切葡聚糖酶催化结构域的方法3,9，斜卧青霉是一种重要的工业真菌，能够大量分泌纤维素酶。此外，已有研究报道在大肠杆菌中成功实现了其他真菌来源纤维素酶的功能性表达，包括来自菜豆根腐菌（Macrophomina phaseolina）10和黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）11-12的纤维素酶。
我们介绍一种在E. coli中高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性的方法。（图1）该方法利用常见的微生物染料刚果红（CR）来可视化细胞在固体培养基上降解羧甲基纤维素（CMC）的酶解过程。该活性检测方法所需试剂廉价，操作简便，结果明确，表现为菌落周围出现降解区域（“晕圈”）。尽管该方法无法定量测定酶活性，但我们发现晕圈大小与细胞内的总酶活性呈正相关。对各个阳性克隆的进一步表征将确定其相对蛋白适应性。
传统的细菌全细胞CMC/刚果红（CR）活性检测方法13通常涉及将含有羧甲基纤维素（CMC）的琼脂倾注于菌落上，这种方法容易发生交叉污染；或者将培养物孵育在含有CMC的琼脂孔中，但后者较难适用于大规模实验。本文报道了一种改进的纤维素酶活性检测方案，该方案对现有的洗涤方法14进行了优化：在进行刚果红染色之前，先将生长在CMC琼脂平板上的菌体去除。本方案显著减少了交叉污染，并具有高度可扩展性，能够快速筛选数千个克隆。除了H. jecorina的酶外，我们还表达并筛选了来自Thermoascus aurantiacus和Penicillium decumbens的内切葡聚糖酶变体（见图2），表明该方案适用于来自多种生物体的酶。
方案
1. 筛选平板的制备
- 在1L蒸馏水中加入25g LB培养基、15g琼脂和1.5g羧甲基纤维素（CMC）底物，高压灭菌以进行消毒。
- 灭菌后，让培养基冷却，并加入适当的抗生素和IPTG，使其终浓度为100μM。
- 将200mL培养基分别倒入5个大型方形培养皿/生物测定托盘（240 × 240 × 20 mm 或更大尺寸）中。让平板完全干燥。
2. 内切葡聚糖酶文库的构建与筛选
- 构建内切葡聚糖酶催化结构域的文库。可通过多种方式实现（例如定点突变、随机突变、重组等），具体方法由研究人员决定。
- 将文库克隆至载体中，使其受T7启动子和lac操纵子调控，并包含pelB信号肽序列以靶向周质空间。合适的载体示例为Novagen公司的pET22b(+)。
- 将内切葡聚糖酶文库转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 菌株，并涂布获得单菌落。
- 于37°C培养过夜。
- 使用无菌牙签将克隆接种至含有400μL LB培养基（添加适当抗生素）的96孔深孔板中，于37°C、250 rpm振荡培养过夜。
- 向96孔过夜培养物中加入无菌甘油，终浓度为10%，用于-80°C长期保存。此板作为主库板。
- 使用96针复制仪将过夜培养物复制至含有IPTG和CMC的筛选平板上。每块筛选板最多可复制5组过夜培养物。
- 标记筛选板，确保每个96孔板的身份和方向清晰可辨。
- 将复制后的文库在室温（17–25°C）孵育过夜，或直至可见菌落形成。
- 用蒸馏水冲洗平板，直至所有菌落痕迹完全去除。
- 将刚果红（CR；0.5%水溶液）倒入清洗后的平板，确保加入量足以覆盖整个平板表面。
- 室温孵育15分钟。刚果红染色时间不得超过15分钟，否则会导致水解圈不清晰。
- 倒去刚果红溶液，加入足量1M NaCl溶液（用量应超过覆盖平板所需）。
- 室温孵育15分钟。
- 倒去NaCl溶液，即可观察到CMC降解产生的透明圈。为获得更清晰的透明圈，可能需要延长NaCl孵育时间或进行多次NaCl漂洗。
- 使用无菌牙签从主库板中挑取具有活性的酶克隆，用于进一步表征。
3. 代表性结果：
图3展示了该高通量筛选的一个读出结果示例。根据降解区的大小，克隆可被鉴定为无活性、弱活性和高活性。如果在文库中包含已知活性的酶作为参照，则此方法尤为有用。如图所示，活性酶的鉴定结果可靠且可重复。然而，请注意，对筛选平板进行充分标记至关重要。研究人员必须能够在洗去菌落后仍能识别出具有活性的变异体，以便从保存于-80°C的主平板上挑取这些克隆，用于进一步表征。最后，难以预先评估酶在人工底物与天然底物上活性之间的关系。因此，研究人员必须在工业相关材料上测试所有阳性克隆，以确定蛋白质的功能适应性。
图1. 筛选流程示意图。将细胞转化至内切葡聚糖酶文库中，并进行选择性涂布以获得单菌落。挑取克隆并在96孔深孔板中过夜培养，用于（1）在-80°C下保存，以及（2）在含有CMC和IPTG的平板上进行复制平板培养，以诱导内切葡聚糖酶表达。从保存于-80°C的主平板上挑取有活性的克隆。
图2. 真菌催化结构域在E. coli中的克隆与表达。(A) 内切葡聚糖酶表达载体。将基因克隆至pET22b(+)（Novagen）中，由T7启动子调控。(B) 右图：表达内切葡聚糖酶的BL21 (DE3) 菌落。左图：经刚果红染色并洗脱后出现的羧甲基纤维素（CMC）降解圈。
图3. CMC/刚果红筛选的示例结果。洗涤并经刚果红显色后拍摄的筛选平板照片。筛选平板上所有菌落大小相似。
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讨论
本文所述方案能够快速、高通量地鉴定具有活性的酶，且操作步骤极少。活性检测具有较高的灵敏度，并能定性反映细胞内酶活性的水平。该方法操作简便，适用于多种酶文库的筛选，其应用范围仅受限于目标酶在大肠杆菌（E. coli）中的功能性表达。此外，此类活性筛选不仅限于真菌来源的纤维素酶，还可推广应用于任何具有可溶性底物（如羧甲基纤维素，CMC）的内切葡聚糖酶或其他纤维素酶活性的检测。
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致谢
本工作由戈登与贝蒂·摩尔基金会以及联合黑人学院基金会/默克科学计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| 刚果红 | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| 羧甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| 细菌琼脂 | BD Biosciences | 214030 | |
| 生物测定板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
参考文献
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