超声靶向微泡破坏技术简介

摘要

超声靶向微泡破坏技术（UTMD）可用于将生物活性分子（包括治疗性基因）特异性递送至超声可及的靶器官，例如心脏和肝脏^1-6。

摘要

在超声靶向微泡破坏技术（UTMD）中，将生物活性分子（例如携带目的基因的带负电荷质粒DNA载体）添加到阳离子脂质微泡造影剂的外壳中^7-9。在小鼠中，这些携带载体的微泡可通过静脉注射或直接注入心脏左心室；在较大的动物中，也可通过冠状动脉导管输注。随后，通过微泡共振频率下的声学空化效应，实现从血液循环向靶器官的递送。微泡破裂所产生的机械能很可能在靶向区域微血管内皮细胞膜上或细胞间形成瞬时孔隙¹⁰。由于这种声孔效应，外源基因穿过内皮细胞的转染效率得以提高，携带目的基因的载体被释放至周围组织中。残留在血液循环中的质粒DNA会迅速被血液中的核酸酶降解，这进一步降低了非超声照射组织的基因递送可能性，从而实现高度特异性的靶器官转染。

方案

1. 微泡储备液的制备

1. 在 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 200 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、50 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和 1 g 葡萄糖，混匀。
2. 将混合物置于沸水浴中加热 20–30 分钟，每 5 分钟用移液器混匀一次。
3. 该溶液可在 4°C 下保存长达 6 个月。

2. 微泡制备

1. 取250 μl已制备的微泡储备液，于40°C孵育15分钟。
2. 将预热的微泡溶液转移至含有50 μl甘油的1.5 mL微量离心管中。
3. 加入1–2 mg纯化的编码目的基因表达载体的质粒DNA（本示例中使用Qiagen内毒素去除型大提试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）纯化，最佳浓度为4 mg/ml）。加入磷酸盐缓冲液至终体积为500 μl。使用无内毒素的Qiagen大提纯化试剂盒以及无菌PBS，以确保无菌性。
4. 随后用八氟丙烷气体置换微量离心管中的空气。
5. 将微量离心管在牙科合金振荡器中剧烈震荡20秒。
6. 小心移除未与微泡结合的残余DNA和缓冲液（下层液体），并将微泡层用无菌PBS洗涤三次，以去除未结合的DNA，每次洗涤之间将样品置于冰上。我们通常可达到30–40%的结合效率。所有试剂均为无菌，操作中注意尽量避免污染。
7. 质粒DNA结合的微泡可在冰上保存最多两小时，直至使用。
8. 混合后从微量离心管中移除的下层液体以及PBS洗涤液可用于测定未结合DNA的浓度，进而根据已知的初始浓度计算结合量，方法是使用分光光度计在260 nm波长下测定该溶液的光密度。

3. 仪器校准

1. 首次使用前，需对1 MHz空化换能器进行校准，以确保其具备适当的机械指数和脉冲重复频率。将一个可浸入式1 MHz、13 mm、非聚焦换能器通过功率放大器连接至20 MHz函数/任意波形发生器。
2. 将该换能器置于盛满水的塑料容器中，并正对已通过电荷放大器连接至500 MHz示波器的水听器。
3. 可调节波形、频率、振幅、脉冲周期和功率放大倍数，以获得适合微泡空化的最佳占空比和机械指数。在本实验中，我们已将系统校准至在1 MHz下机械指数约为1.3的水平。

4. 微泡递送与超声靶向微泡破裂技术

1. 在微泡递送和超声靶向微泡破坏（UTMD）之前，通过腹腔注射给予C57BL/6小鼠100 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪进行麻醉。
2. 微泡递送通过直接注射至心脏左心室或经尾静脉插管进行静脉注射。对于直接心脏注射，注射体积最高可达 100 μl 将质粒DNA负载的微泡溶液通过插入前部4处的30号针头注射^th 在超声引导下，经肋间隙穿刺进入左心室。
3. 通过将 Visual Sonics 公司的 38 MHz 高频超声探头固定于小鼠胸壁，在长轴切面下使用 VisualSonics Vevo 2100 成像系统观察经左心室注射产生的微泡溶液团注。所有注射器和针头均为无菌，以确保注射过程尽可能处于无菌环境。
4. 注射后立即使用第二个尺寸较小的低频1.0 MHz换能器，在目标器官上方直接进行约5分钟的微泡破坏，以实现对该区域的靶向破坏。本示例中，超声施加于肝脏，脉冲重复频率为1.0 MHz，机械指数约为1.3–1.5，每20个周期的脉冲重复周期为100 ms。 alternatively，可将脉冲与小鼠心电图（ECG）同步（本实验未显示），即每4–6个心动周期给予一次包含3帧超声的脉冲爆发。当采用允许在超声脉冲爆发间期毛细血管床重新充盈微泡的方案时，可获得更高的转染效率。

5. 替代递送方法

我们选择重点介绍心室间注射，因为该操作较为复杂；但在许多情况下，例如微泡的长时间输注，尾静脉注射是首选方法。对于通过尾静脉递送微泡的方法，小鼠的麻醉方式相同。将含有质粒DNA结合微泡的注射器连接至27号针头/尾静脉导管。尾静脉导管插入小鼠尾部右侧或左侧侧静脉的远端三分之一处。含有微泡的注射器置于输液泵中，由泵自动在预设时间段内匀速输注设定体积的溶液。我们通常以每小时3 ml的速度输注200–300 μl。

动物使用

所有动物操作均遵循相关国家和/或地方动物福利机构规定的良好动物实验规范，所有动物实验均经适当委员会批准（夏威夷大学机构动物护理和使用委员会，批准编号 07-100-3）。实验中使用了适当的麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪），并备有镇痛剂（布比卡因和丁丙诺啡），但未实际使用。

6. 代表性结果：

通过构建体所编码的基因，可采用多种方法评估UTMD介导的质粒DNA递送效果，例如但不限于：荧光素酶 体内 成像，β-半乳糖苷酶 离体 染色和/或免疫组织化学。 尤其需要注意的是， 体内 生物发光成像技术可对转染了编码生物发光报告基因（荧光素酶）质粒的小鼠体内基因表达的存在及持续时间进行连续监测。Xenogen 体内 成像系统（IVIS）（Caliper Life Sciences，Hopkinton, MA）用于生物发光成像。通常在UTMD介导转染后的第一天对所有小鼠进行成像，并每三至四天重复一次，直至通过该系统无法再视觉检测到生物发光基因表达（图1）。 为准备小鼠进行生物发光成像，首先经腹腔注射荧光素酶报告探针D-荧光素（D-luciferin）（Caliper Life Sciences），约3分钟后对小鼠实施麻醉。待D-荧光素底物在体内分布约10分钟，将动物置入IVIS成像室并进行全身图像扫描。在数据采集过程中，检测来自萤火虫荧光素酶与D-荧光素之间光化学反应所发射的光子。图1还展示了UTMD后肝脏的类似IVIS生物发光成像结果，图2为使用抗荧光素酶一抗（Sigma-Aldrich）和AlexFluor-568标记的二抗（Invitrogen）对转染肝脏进行的荧光显微（100X）图像。可以明显看出，UTMD介导的肝脏转染不仅影响了内皮细胞，也影响了肝细胞。

图1. 心脏靶向UTMD处理小鼠的Xenogen/IVIS成像。(A) 阴性对照小鼠：质粒 + PBS，随后进行心脏靶向UTMD；(B) 治疗组小鼠：质粒 + 微泡，随后进行心脏靶向UTMD；以及(C) 治疗组小鼠：质粒 + 微泡，随后进行肝脏靶向UTMD。

图2. 肝脏UTMD的免疫组织化学染色（红色为抗荧光素酶）。(A) 无UTMD的质粒，(B) 含UTMD的质粒。共聚焦图像（100倍）；细胞核经DAPI染色呈蓝色。

讨论

UTMD 代表了一种新型的基因递送方法。作为一种平台技术，它可与多种潜在的基因治疗策略相结合，在需要高度组织特异性时递送多种生物活性分子。该技术的主要生物学局限性在于转染效率较低。另一个重要考虑因素是靶器官对超声的可及性，而骨骼或气体的介入会显著降低其可及性。该技术需要根据靶组织对操作方法进行优化¹¹，并需具备声学基础知识，以减少组织损伤¹¹并提高效率。然而，该方法为评估组织特异性转基因表达的效果提供了一种经济、快速且可重复的手段，并可能为某些疾病提供有效的治疗方案，尤其适用于低水平转基因表达即具治疗作用的情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Sigma-Aldrich	P-5911	微泡脂质壳的组分
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺	Sigma-Aldrich	P-3275	微泡脂质壳的组分
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5400	被认为可稳定微泡
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5368
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	被认为可防止微泡融合
八氟丙烷气体	Airgas	N/A	临床应用中使用的惰性气体
VialMix 牙科银汞合金振荡器	Bristol-Myers Squibb	N/A
1 MHz，13 mm，非聚焦换能器	Olympus Corporation	A303S-SU
20 MHz 函数/任意波形发生器	Agilent Technologies	33220A
功率放大器	Krohn-Hite Co.	Model 7500
水听器	Bruel and Kjaer	Type 1803
电荷放大器	Bruel and Kjaer	Type 2634
500 MHz 示波器	LeCroy	9354L
VisualSonics’ Vevo 2100 成像系统，配备 34 MHz 换能器	VisualSonics, inc.	2100
27G 一英寸尾静脉导管	VisualSonics, inc.	N/A
Genie Plus 注射泵	Kent Scientific	GENIE