超声靶向微泡破坏技术简介

摘要

超声靶向微泡破坏技术（UTMD）可用于将生物活性分子（包括治疗性基因）特异性递送至超声可及的靶器官，例如心脏和肝脏^1-6。

摘要

在超声靶向微泡破坏技术（UTMD）中，将生物活性分子（例如携带目的基因的带负电荷质粒DNA载体）添加到阳离子脂质微泡造影剂的外壳中^7-9。在小鼠中，这些携带载体的微泡可通过静脉注射或直接注入心脏左心室；在较大的动物中，也可通过冠状动脉导管输注。随后，通过微泡共振频率下的声学空化效应，实现从血液循环向靶器官的递送。微泡破裂所产生的机械能很可能在靶向区域微血管内皮细胞膜上或细胞间形成瞬时孔隙¹⁰。由于这种声孔效应，外源基因穿过内皮细胞的转染效率得以提高，携带目的基因的载体被释放至周围组织中。残留在血液循环中的质粒DNA会迅速被血液中的核酸酶降解，这进一步降低了非超声照射组织的基因递送可能性，从而实现高度特异性的靶器官转染。

方案

1. 微泡储备液的制备

1. 在 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 200 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、50 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和 1 g 葡萄糖，混匀。
2. 将混合物置于沸水浴中加热 20–30 分钟，每 5 分钟用移液器混匀一次。
3. 该溶液可在 4°C 下保存长达 6 个月。

2. 微泡制备

1. 取250 μl已制备的微泡储备液，于40°C孵育15分钟。
2. 将预热的微泡溶液转移至含有50 μl甘油的1.5 mL微量离心管中。
3. 加入1–2 mg纯化的编码目的基因表达载体的质粒DNA（本示例中使用Qiagen内毒素去除型大提试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）纯化，最佳浓度为4 mg/ml）。加入磷酸盐缓冲液至终体积为500 μl。使用无内毒素的Qiagen大提纯化试剂盒以及无菌PBS，以确保无菌性。
4. 随后用八氟丙烷气体置换微量离心管中的空气。
5. 将微量离心管在牙科合金振荡器中剧烈震荡20秒。
6. 小心移除未与微泡结合的残余DNA和缓冲液（下层液体），并将微泡层用无菌PBS洗涤三次，以去除未结合的DNA，每次洗涤之间将样品置于冰上。我们通常可达到30–40%的结合效率。所有试剂均为无菌，操作中注意尽量避免污染。
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讨论

UTMD 代表了一种新型的基因递送方法。作为一种平台技术，它可与多种潜在的基因治疗策略相结合，在需要高度组织特异性时递送多种生物活性分子。该技术的主要生物学局限性在于转染效率较低。另一个重要考虑因素是靶器官对超声的可及性，而骨骼或气体的介入会显著降低其可及性。该技术需要根据靶组织对操作方法进行优化¹¹，并需具备声学基础知识，以减少组织损伤¹¹并提高效率。然而，该方法为评估组织特异性转基因表达的效果提供了一种经济、快速且可重复的手段，并可能为某些疾病提供有效的治疗方案，尤其适用于低水平转基因表达即具治疗作用的情况。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Sigma-Aldrich	P-5911	微泡脂质壳的组分
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺	Sigma-Aldrich	P-3275	微泡脂质壳的组分
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5400	被认为可稳定微泡
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5368
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	被认为可防止微泡融合
八氟丙烷气体	Airgas	N/A	临床应用中使用的惰性气体
VialMix 牙科银汞合金振荡器	Bristol-Myers Squibb	N/A
1 MHz，13 mm，非聚焦换能器	Olympus Corporation	A303S-SU
20 MHz 函数/任意波形发生器	Agilent Technologies	33220A
功率放大器	Krohn-Hite Co.	Model 7500
水听器	Bruel and Kjaer	Type 1803
电荷放大器	Bruel and Kjaer	Type 2634
500 MHz 示波器	LeCroy	9354L
VisualSonics’ Vevo 2100 成像系统，配备 34 MHz 换能器	VisualSonics, inc.	2100
27G 一英寸尾静脉导管	VisualSonics, inc.	N/A
Genie Plus 注射泵	Kent Scientific	GENIE