需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

47.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/2969

⸱

2011年10月26日

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

本文内容

摘要

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。

摘要

尽管在模拟人类药物毒性方面已取得进展，但由于不可预知的副作用，许多化合物在临床试验中仍会失败。临床研究的成本十分高昂，因此在药物开发早期开发并应用更具预测性的毒理学筛选方法至关重要（Greenhough 等，2010）。人肝细胞是目前评估药物毒性的金标准模型，但其资源有限且功能存在变异性。因此，由于永生化细胞系和动物组织模型来源丰富，常被常规使用。尽管这两种来源均能提供一定信息，但其应用受限于功能较差、物种差异和/或在培养中不稳定等问题（Dalgetty 等，2009）。多能干细胞（PSCs）是获得类人肝细胞（HLCs）的一种有吸引力的替代来源（Medine 等，2010）。PSCs 具有自我更新能力，并可分化为成体中存在的所有体细胞类型，因而代表了一种潜在无限的分化细胞来源。我们已开发出一种简单、高效、易于自动化且能产生功能性人源 HLCs 的方法（Hay 等，2008；Fletcher 等，2008；Hannoun 等，2010；Payne 等，2011 和 Hay 等，2011）。我们相信，该技术将推动 HLCs 在药物发现、疾病建模、体外装置构建以及可能的细胞移植治疗中的规模化生产。

方案

1. 所有化学试剂储备液的初始配制及培养塑料器皿的包被

所有步骤均须在无菌条件下于组织培养罩内进行。

  1. 人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）的制备
    1. 在PBS中配制10% BSA溶液，并通过0.22 μm滤膜过滤。
    2. 用10% BSA溶液配制0.2% BSA溶液。
    3. 每100 μg hbFGF加入10 mL 0.2% BSA溶液。
    4. 用5 mL 10% BSA溶液通过0.22 μm滤膜进行预润洗滤膜。弃去10 mL BSA洗涤液。
    5. 将hbFGF溶液通过预润洗的滤膜过滤。
    6. 将hbFGF分装至无菌离心管中，于-20°C保存。
  2. 人Activin A储存液的制备
    1. 向注射器中加入1 mL 0.2% BSA溶液，预润洗滤膜。
    2. 用0.2% BSA将Activin A稀释至100 μg/mL的储存浓度。
    3. 过滤Activin A溶液，分装至无菌离心管中，于-20°C保存。
  3. 小鼠Wnt3a储存液的制备
    1. 向含有2 μg Wnt3a的冻干管中加入200 μL PBS，配制成10 μg/mL的储存液。
    2. 分装至无菌离心管中，于-20°C保存。
  4. 人HGF储存液（1000倍浓缩液）的制备
    1. 用PBS将HGF稀释至10 μg/mL的储存浓度。
    2. 过滤HGF溶液，分装至无菌离心管中，于-20°C保存。
  5. 抑瘤素M（OSM）储存液（1000倍浓缩液）的制备
    1. 用PBS将OSM稀释至20 μg/mL的储存浓度。
    2. 过滤OSM溶液，分装至无菌离心管中，于-20°C保存。
  6. 培养器皿的Matrigel包被
    1. 将10 mL Matrigel原液置于冰上，在4°C过夜融化，然后加入10 mL KO-DMEM。使用预冷的移液器充分混匀，并将1 mL分装液于-20°C保存。
    2. 在4°C条件下解冻一份Matrigel分装液，至少2小时或过夜，以避免凝胶形成。
    3. 向Matrigel中加入5 mL冷的KO-DMEM，用移液器充分混匀。
    4. 用冷的KO-DMEM定容至15 mL，并用移液器混匀。
    5. 将Matrigel溶液加入待包被的培养板或培养瓶中（见表(i)）
培养板 / 培养瓶每孔或每瓶体积
12孔板每孔 0.5 mL
6孔板每孔 1 mL
25cm2 培养瓶每瓶 2 mL

表1. hESC培养中用于包被典型塑料器皿的Matrigel推荐体积。

    1. 将包被好的培养板或培养瓶在 4°C 下孵育过夜，或在室温下孵育 1 小时后再使用。
    2. 用 Matrigel 包被的培养板或培养瓶可在 4°C 下保存长达 1 周。应明确标记其包被日期。超过 1 周未使用的培养板或培养瓶应予以丢弃。
      1. 使用前，将包被好的培养容器置于超净工作台内，使其恢复至室温。
      2. 使用前立即吸除 Matrigel，并将细胞悬液加入孔或培养瓶中。

2. hESC 培养的常规维护与鉴定

  1. 人胚胎干细胞系的复苏
    1. 将人胚胎干细胞（hESC）从液氮中取出，并在37°C水浴中快速解冻。
    2. 小心地将细胞悬液转移至含有数毫升预温培养基的无菌离心管中。
    3. 以低速离心5分钟（1000 RPM）使细胞沉淀。
    4. 吸除上清液，非常轻柔地将细胞重悬于预温的ES培养基中，并接种至小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上。
    5. 每日更换新鲜ES培养基；当细胞达到亚汇合状态时，需进行传代。
  2. 人胚胎干细胞的常规维持
    胚胎干细胞在涂有Matrigel的培养板或培养瓶中培养。细胞需每日观察并换液：
    1. 在显微镜下检查是否存在污染、细胞形态及汇合度。
    2. 吸除用过的培养基。
    3. 加入适量的新鲜小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）+人bFGF（终浓度4 ng/mL），或其它无血清培养基6。
  3. 使用胶原酶进行细胞传代
    人胚胎干细胞系（H1、H9和RCM-1）在以1:3比例传代后，通常每5–7天达到汇合状态。早期传代的hESC在基质细胞存在下生长较慢，因此在Matrigel上的培养时间可能成为重要影响因素。由于基质降解，人胚胎干细胞在同一批Matrigel上培养不应超过14天；若细胞尚未汇合，可能需要以1:1或1:2的比例进行传代。

    酶消化孵育
    1. 所有操作均须在组织培养超净台内无菌条件下进行。
    2. 确保已按第1.6节所述准备新的涂有Matrigel的培养皿或培养瓶。
    3. 确定细胞所需的传代比例。决定传代比例时需考虑以下多个因素：
      1. 基质细胞较多而克隆数量较少：可传代至较小孔径的培养板，或以1:1比例传代，有助于去除部分基质细胞，从而提高克隆与基质细胞的比例，促进hESC生长。
      2. 基质细胞较多且存在大克隆，根据克隆数量，若大hESC克隆足够多，可按1:1或1:2比例传代。
      3. 正常生长、基质细胞较少或无基质细胞，或伴有少量分化的hESC，可按1:2或1:3比例传代。
      4. 吸除培养孔或培养瓶中的培养基。
      5. 用2 mL PBS（不含MgCl2、不含CaCl2）洗涤一次。
      6. 加入适量胶原酶（200 U/mL，溶于KO-DMEM中），于37°C孵育2–5分钟。自2分钟起，每隔1分钟在显微镜下定期观察。当分化细胞开始脱落、克隆边缘开始翘起时，即可进行传代。
    刮取并收集hESC
    1.  
      1. 吸除胶原酶溶液。
      2. 用2 mL PBS（不含MgCl2、不含CaCl2）洗涤一次。
      3. 根据传代比例加入适量MEF-CM，使用细胞刮刀将细胞从培养孔或培养瓶表面物理刮下，然后用10 mL移液管轻轻吹打2–3次以混匀。重要的是保持hESC以细胞团块形式存在，避免分散为单个细胞。
    重接种hESC
    1.  
      1. 将所得细胞悬液接种至新的涂有Matrigel的培养瓶或培养孔中。
      2. 对于6孔板中的每个孔，将MEF-CM体积补至4 mL。
      3. 将细胞放入培养箱时，轻轻摇动组织培养容器，以确保克隆尽可能均匀分布，避免克隆沉降于组织培养板/瓶中央，从而影响细胞重接种和分化。
  4. 通过流式细胞术对hESC群体进行常规表征
    1. 每月通过流式细胞术检测hESC群体的干细胞标志物，如Oct 3/4、Tra 1-60和SSEA-4。
    2. 使用胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen）处理5分钟，将hESC从基质上解离为单细胞悬液。
    3. 将单细胞重悬于含0.1% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS中，浓度为1×106 个细胞/mL。
    4. 在4°C下，加入相应抗体孵育40分钟。
    5. 用含0.1% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体，最后重悬于100 μL体积中，进行流式细胞术分析。
    6. 使用配备488 nm激光的FACS Calibur流式细胞仪，对每份样本采集30000–40000个“活细胞”事件的数据，并采用CellQuest软件（Becton Dickinson, San Jose, CA）进行分析。未染色细胞作为对照。通过前向散射和侧向散射参数设置电子活门，排除死细胞、凋亡细胞及碎片。

3. 将hESCs分化为肝内胚层

  1. 将 hESC 分化为肝内胚层的培养基制备。所有培养基的制备均应在生物安全柜中以无菌条件进行。
    1. 内胚层分化用 RPMI:B27 诱导培养基的制备
      1. 配制 RPMI-B27 培养基：混合 RPMI 1640（500 mL）和 B27（50 倍浓缩液，10 mL）
      2. 轻轻旋转混匀各组分。
      3. 将所有组分加入滤器装置中，真空过滤，4 °C 保存。
    2. 肝细胞分化用 SR-DMSO 培养基的制备
      1. 配制 SR-DMSO 培养基：混合 80% KO-DMEM、20% KO-SR、0.5% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇和 1% DMSO。
      2. 真空过滤溶液，4 °C 保存；如需长期保存，可分装后于 -20 °C 保存。
      3. 每孔 6 孔板使用 4 mL，每 T25 培养瓶使用 6 mL。
    3. 肝细胞成熟用 L15 成熟培养基的制备
      1. 配制 L-15 培养基：混合 500 mL Leibovitz L-15 培养基、胰蛋白胨磷酸盐肉汤（终浓度 8.3%）、热灭活胎牛血清（终浓度 8.3%）、10 μM 氢化可的松 21-半琥珀酸酯、1 μM 胰岛素（牛胰腺来源）、1% L-谷氨酰胺、0.2% 抗坏血酸。
      2. 真空过滤溶液，4 °C 保存；如需长期保存，可分装后于 -20 °C 保存。
    4. 终末 RPMI:B27 诱导培养基的制备
      1. 根据实验需要量取诱导培养基（每孔 6 孔板 1 mL，每 T25 培养瓶 2 mL）。
      2. 加入 Activin A 至终浓度 100 ng/mL。
      3. 加入重组 Wnt3a 至终浓度 50 ng/mL。
      4. 充分混匀，培养基即可使用。
      5. 该终末培养基应每日新鲜配制。
    5. 终末 L-15 成熟培养基的制备
      1. 根据实验需要量取 L-15 培养基（每孔 6 孔板 4 mL，每 T25 培养瓶 6 mL）。
      2. 加入 HGF 至终浓度 10 ng/mL。
      3. 加入 OSM 至终浓度 20 ng/mL。
      4. 充分混匀，培养基即可使用。
      5. 该终末培养基应每日新鲜配制。
  2. 将 hESC 诱导为定型内胚层
    1. 将 hESC（H1、H9 和 RCM-1）在基质胶包被的培养板上培养，并使用添加 bFGF 的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）进行传代。
    2. 当 hESC 达到约 30%–60% 汇合度时（依具体 hESC 细胞系而定），更换为诱导培养基（RPMI 1640-B27，添加 100 ng/mL Activin A 和 50 ng/mL Wnt3a），启动肝向分化。
    3. 细胞在诱导培养基中培养 3 天（每 24 小时更换一次培养基），每日新鲜配制含 Activin A 和 Wnt3a 的终末诱导培养基。
    4. 诱导 72 小时后，更换为第二阶段分化培养基（SR-DMSO），继续培养 5 天（每 48 小时更换一次培养基）。
    5. 第 8 天起，将细胞转入成熟与维持培养基（L-15），添加 10 ng/mL hHGF 和 20 ng/mL OSM，培养 9 天（每 48 小时更换一次培养基）。含 hHGF 和 OSM 的成熟与维持培养基应每日新鲜配制。
    6. 细胞逐渐发生形态学变化，从尖状/三角形转变为具有多边形特征的典型肝细胞形态（图 2A）。
    7. 肝细胞分化的示意图：

肝细胞分化示意图；阶段：启动、分化、成熟，共17天。

4. 人胚胎干细胞来源肝内胚层的表征

  1. 免疫染色
    1. 用 PBS 洗涤由 hESC 衍生的 HLCs，每次 1 分钟，共洗涤两次。
    2. 在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 HLCs 20 分钟（细胞可在 4°C 的 PBS 中保存，并在日后进行染色）。也可在 -20°C 下用冰冻甲醇固定 10 分钟。
    3. 用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
    4. 用 100% 乙醇在室温下孵育细胞 2 分钟，以进行核染色（若使用甲醇固定，则此步骤非必需）。
    5. 用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
    6. 在室温下用 PBS/T（0.1% Tween）/10% BSA 封闭细胞 1 小时。
    7. 去除封闭液，加入用 PBS/T（0.1% Tween）/1% BSA 稀释的相应一抗，在室温下孵育 2 小时，或在 4°C 下过夜震荡孵育。
    8. 在室温下用 PBS/T（0.1% Tween）/1% BSA 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
    9. 加入用 PBS 稀释的适当 Alexa Fluor 二抗（1:400），在室温下避光震荡孵育 1 小时。
    10. 用 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
    11. 每孔加入 MOWIOL 4-88 和 DAPI（1:1000）封片。盖上盖玻片，轻轻按压以确保去除所有气泡，并在 4°C 避光保存。
  2. RNA 提取与分离
    1. 用 PBS 洗涤由 hESC 衍生的 HLCs 并吸除液体。
    2. 加入 1 mL TRIZOL 试剂，在室温下孵育 5 分钟。
    3. 刮取细胞并转移至 1.5 mL 离心管中（如需可于 -80°C 保存以备后续使用）。
    4. 向离心管中加入 0.5 mL 氯仿，通过倒置混匀；务必在通风橱内操作。
    5. 在 4°C 下以 13,000 RPM 离心 15 分钟。
    6. 收集水相层并转移至新的洁净离心管中，注意避免界面污染。
    7. 加入 1 mL 异丙醇，通过倒置混匀，室温静置 10 分钟以沉淀 RNA。
    8. 在 4°C 下以 13,000 RPM 离心 10 分钟。
    9. 吸除上清液，注意不要扰动 RNA 沉淀。用 0.5 mL 70% 乙醇洗涤，室温放置 5 分钟。
    10. 在 4°C 下以 8,000 RPM 离心 5 分钟。
    11. 吸除乙醇，室温干燥 5–10 分钟。
    12. 待乙醇完全挥发后，将沉淀重悬于 30 μL 去离子水中。将 RNA 储存于 -80°C 以备后续使用。
    13. 使用 Nanodrop 测定 RNA 浓度。
  3. 逆转录 PCR
    1. 在薄壁 0.5 mL 离心管中，使用先前提取的 RNA（200 ng）、随机六聚体引物、dNTPs（10 mM）、逆转录酶及相应缓冲液配制反应体系。
    2. 设置一个无逆转录酶的阴性对照反应（除逆转录酶外其余成分相同）。
    3. 将反应管放入热循环仪（PCR 仪）中，设置如下程序：
      1. 37°C - 5 分钟（1 个循环）
      2. 42°C - 1 小时（1 个循环）
      3. 95°C - 5 分钟（1 个循环）
    4. 如需后续使用，可将 cDNA 储存于 -20°C。
  4. TAQMAN 定量逆转录聚合酶链式反应 在分化方案的不同时间点收获细胞。提取 RNA，并使用以下引物及“即用型”检测（Assay on demand，Applied Biosystems）进行定量逆转录 qPCR：
    1. Oct 4 Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumin Hs00910225_m1
    4. Alpha-fetoprotein Hs00173490_m1

关于RNA的分离与提取，请参见第3.3.2节

  1. 逆转录与TAQMAN qPCR
    1. 取1 μg RNA，按照Invitrogen Superscript III逆转录试剂盒的说明书操作，将其逆转录为cDNA。
    2. 取1 μl cDNA用于25 μl的TAQMAN反应体系中，体系包含Applied Biosystems提供的特异性引物、18S核糖体对照引物、Invitrogen的2x platinum qPCR supermix UDG（含ROX）以及适量的水。
    3. 充分混匀后，将每份样品各10 μl加入96孔或384孔qPCR板中的两个孔内。
    4. 所有样品（包括相应的对照）加样完成后，密封反应板，并在Applied Biosystems 7900HT TAQMAN仪器上进行分析。
    5. 结果以相对于对照样品的相对表达量表示。
  1. 人胚胎干细胞来源肝内胚层细胞的功能分析 细胞色素P450检测 - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. 将第17天的人胚胎干细胞来源肝内胚层细胞（HE）与特异性底物在37°C下孵育5小时（n=3）。以组织培养基作为阴性对照，在37°C下孵育5小时。
    2. 收集上清液，并按照制造商说明书进行检测。
    3. 测定基础活性的相对水平，并根据BCA法测定的每毫克蛋白量进行归一化处理（http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101）。

注意事项

  1. 所有体积均基于6孔板规格。若使用其他规格的培养板或培养瓶，请相应调整体积。
  2. 诱导、分化和成熟培养基在使用前需经真空过滤。
  3. 诱导、分化和成熟培养基可在4°C保存不超过2周。请根据实验需求评估所需培养基量，将剩余部分分装后于-20°C保存以备后续使用。
  4. Matrigel按制造商说明书配制；可分装为1 mL每份，保存于-20°C直至使用。
  5. 生长因子配制并分装后可保存于-20°C；解冻后可在4°C保存不超过2周。
  6. 通常用于表征hESC来源的HLCs的一抗为白蛋白（1:250，Sigma-Aldrich，Saint Louis, MO）。

5. 代表性结果：

肝细胞分化前维持的人胚胎干细胞的表征

为了表征本研究中所用H9 hESCs的干细胞状态，我们检测了多个参数。这些细胞呈现出典型的人类胚胎干细胞（hESC）形态，即体积小、排列紧密，并在明确界定的克隆中生长（图1A）；同时表达多能干细胞基因标志物Oct-3/4和Nanog（图1B）。与H7 hESC系阳性对照相比，这些基因的表达水平未见显著差异。此外，90.1%的hESC群体对干细胞标志物SSEA-4呈阳性反应（图1C）。

人胚胎干细胞向肝内胚层分化

人类胚胎干细胞可被高效分化为肝内胚层 体外 （Hay 等，2008）。在分化第9天收获细胞，并评估人胚胎干细胞（hESC）向肝样细胞（HLCs）的分化情况。如先前报道，hESC表现出一系列显著的形态学变化，至第9天时呈现早期肝细胞形态，呈多边形外观（图2A）。此外，在9天的分化过程中，Oct-3/4的表达逐渐下调（图2B）。相反，肝脏特异性转录因子AFP和白蛋白从第7天起开始上调（图2C）。

体外 肝内胚层成熟

肝内胚层被成熟化 体外 采用既定方案（Hay et al 2008）进行操作。在分化培养的最后一天，对细胞进行免疫染色，检测人肝脏标志物白蛋白、甲胎蛋白（AFP）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）。使用本方案获得的肝样细胞（HLCs）产量通常可达90%（Hay et al 2008；Hanoun et al 2010；Payne et al 2011）。HLCs对白蛋白、甲胎蛋白和E-钙黏蛋白呈阳性染色（图3）。

干细胞集落生长、SSEA-4 的基因表达柱状图和流式细胞术直方图。
图 1. 本研究中使用的人胚胎干细胞（hESCs）的表征。（A） 培养中人胚胎干细胞形态的代表性相差显微镜图像，放大倍数分别为 4× 和 10×。图像使用 Nikon TE3000/U 倒置显微镜拍摄。（B） 培养的人胚胎干细胞表达Octamer（Oct-3/4）和Nanog。H7 人胚胎干细胞用作多能性基因表达水平的对照。相对表达量指相对于内源性基因对照 β-2-微球蛋白的诱导倍数。（C） 流式细胞术（FACS）图显示人胚胎干细胞表面标志物的表达水平，包括阶段特异性胚胎抗原 SSEA-4。

细胞分化；高倍显微图像，Oct-3/4 表达图，蛋白质表达分析。
图 2. (A) 人胚胎干细胞（hESC）来源的肝内胚层在分化第9天时的典型相差显微图像，显示培养中的形态，放大倍数分别为 ×4 和 ×10。(B) 基因表达变化的表征。提取RNA并反转录为cDNA，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，显示未分化细胞基因（Oct-3/4）表达逐渐下调，以及(C) 肝细胞相关基因（白蛋白和甲胎蛋白）表达上调。相对表达量是指与分化第0天的内源性对照基因β-2-微球蛋白相比的诱导倍数。与第0天的hESC相比，经学生t检验测定，P<0.05 用 * 表示，P<0.001 用 *** 表示。误差线代表1个标准差。

免疫荧光显微镜显示细胞样本中的蛋白标志物：AFP、ALB、ECAD、IgG。
图3. hESC来源的肝内胚层的表征
免疫细胞化学结果显示hESC（H9）来源的肝内胚层表达肝细胞标志物白蛋白（albumin）、甲胎蛋白（AFP）和E-钙黏蛋白（E-Cadherin）。阴性对照使用相应的免疫球蛋白G（IgG），并展示代表性图像。

Cyp3A蛋白功能分析；柱状图；HLC中的RLU水平；酶活性测量
图4. 人胚胎干细胞（H9）来源的肝样细胞（HLC）具有代谢活性。在第17天，H9细胞分化为HLC后表现出CYP3A代谢活性（n = 6）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们开发了一种简单、均一且高度可重复的 体外 用于规模化生成人源HLCs的模型。我们的模型已通过多家外部合作实验室的验证。我们 routinely 使用内部开发的一套发育标志物和肝脏特异性功能检测方法（其中大多数为商业化试剂盒）对干细胞来源的HLCs进行表征。该流程的关键步骤包括：维持干细胞的多能性；引导干细胞定向分化为定型内胚层；获得均一的肝内胚层细胞群；以及获得具有广泛功能的成熟肝内胚层细胞。 体外.

干细胞来源的HLC技术大规模应用的一个局限性在于成熟肝内胚层在培养中分化功能的短暂性˜在基质胶上培养4天）。因此，我们筛选了一个聚合物文库，以寻找具有生物活性和新颖性的细胞支撑材料。该筛选工作已帮助我们鉴定出一种新型支撑材料，可维持肝细胞功能至少15天。该技术的近期发展方向主要是在药物发现过程中实现工业化应用（Hay et al 2011）。中期来看，该技术有望用于开发人源化体外肝脏支持装置，以用于肝病患者的过渡治疗或治疗手段。从长期来看，该技术可能应用于基于细胞的肝病移植治疗，但目前的数据表明，该策略在临床安全应用前仍需大量研究...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

Hay 博士获得了英国研究理事会（RCUK）研究员项目的资助，West 博士获得了外科系的资助，Medine 博士获得了英国心脏基金会核心基金的资助，Baltasar Lucendo-Villarin 先生获得了英国医学研究理事会（MRC）博士生奖学金的资助，Zhou 博士获得了中国政府奖学金的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

Matrigel 包被培养板和培养瓶

  1. 基质胶（Matrigel，10 mL，BD Biosciences，UK）；于 -20 ℃ 保存°C.
  2. KO-DMEM（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存°C.
  3. 组织培养板（6 孔，12 孔，Corning，UK）
  4. 组织培养瓶（25 cm² 透气，Corning，英国）

hESC 维持

  1. 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）（100 mL，R & D Systems，美国）；于 -20℃ 保存°C.
  2. BSA 溶液（50 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃保存°C.
  3. 人碱性成纤维细胞生长因子（100 μg，Peprotech，美国）；于 -20 保存°C.

使用胶原酶传代人胚胎干细胞

  1. 汇合的hESC培养孔或培养瓶。
  2. 根据需要使用Matrigel包被的孔板或培养瓶。
  3. 磷酸盐缓冲液（不含 MgCl）2-CaCl2)（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；室温保存。
  4. 胶原酶IV（1 g，Gibco，Invitrogen，英国）；4℃保存°C.
  5. 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）（100 mL，R & D Systems, 美国)
  6. 人碱性成纤维细胞生长因子（100 μg，Peprotech，美国）

hESC向肝内胚层的分化

  1. RPMI 1640（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4℃保存°C.
  2. B27 补充剂（10 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；于 -20 ℃ 保存°C.
  3. Activin A（2 μg，Peprotech，美国）；于 -20 保存°C.
  4. 重组小鼠 Wnt3a (2 μ克，R & D Systems，美国）；于 -20℃ 保存°C.
  5. KO-DMEM（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存°C.
  6. KO-SR（500 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；于 -20 ℃ 保存°C.
  7. 非必需氨基酸（100 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存°C.
  8. β巯基–乙醇（10 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存°C.
  9. DMSO（Sigma Aldrich，英国）；室温保存
  10. Leibovitz L-15 培养基（500 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃ 保存°C.
  11. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（100 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃保存°C.
  12. F–胎牛血清，热灭活（500 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；储存于 -20°C.
  13. 氢化可的松-21-半琥珀酸酯（100 mg，Sigma Aldrich，英国）；于 -20 ℃ 保存°C.
  14. 胰岛素（牛胰腺）（100 mg，Sigma Aldrich，UK）；于 -20 ℃ 保存°C.
  15. L-谷氨酰胺（100 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；储存于 -20°C.
  16. 抗坏血酸（25 g，Sigma Aldrich，UK）；于 -20 ℃ 保存°C.
  17. 人源 HGF（10 μg，Peprotech，美国）；于 -20 保存°C.
  18. 重组人抑瘤素M（OSM）（50 μ克，R & D Systems，美国）；于 -20 ℃ 保存°C.
  19. 注射器驱动滤器单元 0.22 μm（Millipore，英国）

人胚胎干细胞来源的肝内胚层的表征

免疫染色

  1. 磷酸盐缓冲液（不含 MgCl）2-CaCl2)（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；室温保存。
  2. PBST，即含0.1% TWEEN 20（Sigma-Aldrich，UK）的PBS。
  3. 多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，UK）用 PBS 配制，储存于 -20°C.
  4. 甘油（Sigma-Aldrich，英国），室温保存。
  5. Tris碱（Sigma-Aldrich，英国），室温保存。
  6. 乙醇
  7. 血清（AbD Serotech，英国），-20℃保存°C.
  8. 二抗，Alexa Fluor 荧光染料（Molecular Probes，Invitrogen，英国）
  9. MOWIOL 4-88（Polysciences Inc，USA）按照生产商说明书用 Tris HCl 和甘油配制。DAPI（Pierce，Thermo Fisher Scientific，UK）以1:1000稀释度加入MOWIOL溶液中。
<表格 边框="1">
一抗
抗原*类型供应商稀释
ALB小鼠单克隆Sigma Aldrich1/500
E-钙黏蛋白小鼠单克隆默克密理博1/100
α甲胎蛋白小鼠单克隆Sigma1/500
SSEA-4 FITC小鼠单克隆Biolegend1/100
IgG小鼠单克隆DAKO1/500
二抗
抗小鼠 FITC 偶联物山羊单克隆Invitrogen1/400

表2. 用于hESC来源的肝内胚层免疫染色的抗体、使用浓度、宿主物种及购买公司。

肝内胚层功能分析及标准化（按每毫克蛋白质计）

细胞色素P450测定

  1. p4-GLO CYP3A4、CYP1A2、试剂盒和 luminometer（Promega，USA）
  2. 白色平底96孔检测板（BD Biosciences，英国）
  3. BCA 测定试剂盒（Pierce，Thermo Fisher Scientific，英国）
  4. 透明96孔检测板（IWAKI，英国）

参考文献

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。