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Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

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DOI：

10.3791/2976

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2012年3月14日

 ,  ,  , 
1Center for Integrative Genomics, University of Lausanne, 2Department of Biology, University of Konstanz

本文内容

摘要

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）触角叶中由气味诱发的钙反应。

摘要

触角叶是昆虫大脑中的主要嗅觉中枢，相当于脊椎动物的嗅球，在解剖结构和功能上具有同源性1-5。外界的嗅觉信息由嗅觉感觉神经元（OSNs）传递至触角叶，这些神经元根据其所表达的特异性嗅觉受体，将其轴突投射到神经毡中被称为嗅小球的不同区域。在嗅小球内，OSN轴突与局部中间神经元（LNs）和投射神经元（PNs）形成突触连接：LNs的神经突可支配多个不同的嗅小球，而PNs则负责将嗅觉信息传递至更高级的嗅觉脑区。

对触角叶中嗅觉感受神经元（OSNs）、局部神经元（LNs）和投射神经元（PNs）活动的光学成像——传统上使用合成钙指示剂（如钙绿素、FURA-2）或电压敏感性染料（如RH414）——长期以来一直是理解多种昆虫中嗅觉刺激如何以嗅小球活动的空间和时间模式表征的重要技术6-10。随着基因编码的神经活动报告分子的发展，如果蝇中广泛应用的荧光钙指示剂G-CaMP11,12和Cameleon13、生物发光钙指示剂GFP-aequorin14,15，以及突触传递报告分子synapto-pHluorin16，果蝇Drosophila melanogaster的嗅觉系统在神经生理成像研究中变得更加易于操作，与其已全面阐明的分子、电生理和神经解剖学特性相互补充2,4,17。这些报告分子可通过二元转录调控系统（如GAL4/UAS18、LexA/LexAop19,20、Q系统21）在嗅觉环路中特定神经元群体中选择性表达，从而以高时空分辨率解析气味诱发的神经活动如何被表征、调控和转换22-24。

在此，我们描述了用于测量气味诱发反应的制备与分析方法 果蝇 使用 G-CaMP 的触角叶成像25-27动物准备过程具有最小侵入性，可适用于宽场荧光、共聚焦和双光子显微镜成像。

方案

1. 安装模块组装

  1. 应按照蓝图中的精确规格制作亚克力安装块（图1A），以便于果蝇的安装和解剖（蓝图可从
    http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint 获取）。将螺丝从背面穿入，但不要使其超出块的前表面；其位置将在动物准备过程中进行调整（见2.7）。
  2. 使用精密钻头，在果蝇圆形腔室的上边缘处钻出凹槽，向表面下方挖掘以留出果蝇身体的空间，从而减小该位置的块厚度。
  3. 用手术刀在狭缝底部附近垂直切割铜网，形成一个“领圈”。确保切割后形成的两个翻边处于同一水平面，这有助于果蝇的插入。
  4. 用牙签在果蝇圆形腔室上方的安装块上放置一小滴瞬干胶。将铜网置于胶水上，并调整位置，使狭缝居中于安装块上（图1A）。轻轻按压，并去除多余的胶水。用镊子在两侧翻边下方各添加微小的胶滴，然后将铜网向前折叠覆盖安装块前端，使狭缝垂直向下。确保铜网顶部与安装块表面齐平。待其完全干燥。
  5. 组装一个金属丝支架：将塑料盖玻片切成两半，并移除中间部分，形成“U”形。使用蜂蜡将一段金属丝粘在“U”形顶部；注意不要将金属丝拉得过紧。
  6. 制作触角屏蔽片：使用打孔器在塑料盖玻片上打一个孔。将盖玻片边缘修剪至0.5 × 0.7 cm。将打孔后的塑料盖玻片粘在胶带上，然后在孔洞暴露的胶带区域滴加一滴乙醇，以去除粘性残留物。

2. 动物准备

  1. 具有适当基因型（即携带所需“驱动”元件和活性报告基因转基因组合）的果蝇应为1-3周龄；较年轻的果蝇外骨骼过软，难以切割。当实验需要直接比较不同基因型时，为匹配转基因表达水平，应使用年龄一致的果蝇，以避免与年龄相关的生理差异。若性别不影响实验结果，我们倾向于使用雌性果蝇，因其头部较大，更易于操作。
  2. 将果蝇置于冰上冷却以进行麻醉。
  3. 将一只果蝇引入固定块中。捏住果蝇的翅基关节，使其背面向前，沿铜网的狭缝滑动，使果蝇颈部悬挂在狭缝上（图1B-C）。如有必要，旋转果蝇使其朝下。
  4. 将一根细小的仙人掌刺置于果蝇头部前方，以防止其逃脱（图1B-C）。将仙人掌刺置于喙前，以限制其移动。使用蜂蜡将仙人掌刺固定在支撑块上。确保果蝇头部顶端与支撑块顶端齐平。
  5. 用一小滴溶于乙醇的松香将果蝇头部固定在载块上。将载块放入湿润的盒子中，静置约一小时，使松香硬化。
  6. 用镊子将触角板向前拉，将导线（蜡面向外；参见1.5）置于触角与头部之间的体壁褶皱处的持针器上。用蜂蜡将持针器固定在包埋块的前方。
  7. 使用固定块上的螺丝，轻轻将导线固定器向前推动，以在触角板与头部之间留出一些空间。
  8. 将触角护罩（见1.6）置于果蝇头部上方，使孔位居中。用蜂蜡将其固定在固定块顶部。
  9. 使用刀片分切器在屏蔽胶带上切出一个小孔，暴露果蝇触角后方头部的外骨骼。小孔范围不应超过复眼，以防止制备物泄漏。
  10. 用双组分硅胶密封胶带与果蝇头壳之间的缝隙，并清除果蝇头部表面多余的硅胶。
  11. 放置一滴 果蝇 林格氏生理盐水（130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂）2，2 mM CaCl2，36 mM 蔗糖，5 mM HEPES，pH 7.3）施加于头部。确保无泄漏：触角应始终保持完全干燥。使用蓝宝石刀片在角质层上切出一个孔。首先，沿触角后方的角质层褶皱处轻轻划痕，然后沿复眼并横跨后部单眼处进行切割。最后，将角质层片沿已划痕的边缘翻起，从下方进行切割，以避免切断触角神经。
  12. 用精细镊子小心去除腺体和气管。用 果蝇 林格氏液，在头部留下大量液滴。

3. 气味刺激递送

  1. 气味注射器：使用洁净镊子将一片纤维素垫插入2 ml塑料注射器中，并用移液枪（使用滤芯吸头）将20 μl所需浓度的气味物质溶于适当溶剂后加入垫片上，再用移液枪头将垫片推入注射器筒深处。盖上堵头和帽盖，备用。气味稀释液应至少每3个月重新配制一次（对于高挥发性或使用频繁的气味物质，应更频繁更换），且每次记录实验前均应为气味注射器制备新的垫片。每个气味垫片使用不得超过三次刺激，以免气味浓度衰减。
  2. 自制嗅觉仪（图2）：一路主气流（1 l/min）通过聚四氟乙烯管（内径0.4 mm）输送；在该管出口上游27 cm处，引入第二路次级气流（1 l/min）。两路气流均由隔膜泵产生，流量通过两个独立的流量计进行调节。气流可通过气体洗瓶中的水进行加湿，但需注意避免过度加湿（即相对湿度高于约60%）。次级气流可选择通过气味注射器或空注射器，注射器通过穿刺活塞的针头（外径1.2 mm）与气路连接。使用由阀控制器单元（例如Harvard Apparatus VC6）控制的三通电磁阀，切换洁净空气与气味刺激。

4. 在体 成像

  1. 本文所述成像使用配备20倍水镜（例如Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x/1,0 M27 DIC）的直立荧光显微镜（例如直立固定载物台Zeiss Axio Examiner D1）进行（图2）。使用G-CaMP进行成像时（激发/发射：488/509 nm），应采用具有以下特性的滤光片组：450–490 nm激发滤光片、分色镜（T495LP）和500–550 nm发射滤光片（Chroma ET）。将含有果蝇的制备载物块置于显微镜下，并将嗅觉仪出口置于果蝇触角前方约0.5 cm处。
  2. 降低物镜直至其接触果蝇头部的任氏液。在明场照明下通过目镜观察，调整样品位置，使头壳上的开孔居中，并使其边缘清晰对焦。切换至荧光照明，并调节焦距，直至可见标记的神经元（通过G-CaMP的基础绿色荧光判断）。
  3. 通过安装在显微镜上的电荷耦合器件（CCD）相机（例如CoolSNAP-HQ2 Digital Camera System）并使用适当的采集软件（例如Metafluor）获取图像，精细对焦于目标嗅小球（图3A）。关闭照明光路中的光圈，以将激发光限制在成像区域。
  4. 为记录气味诱发的活性，将采集速率设为4 Hz，并调整曝光时间，使荧光值处于CCD相机的动态范围之内，但不低于1000（任意单位），且具备至少12位动态分辨率。若可能，曝光时间不应超过100 ms，以减少G-CaMP的光漂白。若相机的空间分辨率允许，可增加像素合并（binning）（即芯片上多个感光单元合并为一个数字像素），以缩短所需曝光时间。我们通常获取350×225像素的图像（采用2×2合并），对应样品区域约为210×135 μm。这些参数设置可在限制报告分子光漂白的同时，以良好的空间和时间分辨率捕捉G-CaMP的嗅小球气味诱导反应。
  5. 设定测量参数。通常记录10秒（即40帧），气味刺激通常在采集开始后4秒（第15帧）启动，持续1秒（至第19帧）。一个果蝇样品通常可测试多达25–30种不同的气味刺激，此数量常受限于报告分子因光漂白导致的不可逆荧光信号下降。刺激间隔时间取决于所观察到的反应强度和光漂白速率。为避免感觉适应，可通过预实验重复呈现已知的阳性对照气味（若已知），大致确定合适的刺激间隔时间。在一系列实验中，每约10次刺激加入一次该对照气味，可用于验证样品的持续活性及其反应的一致性。

5. 数据处理与分析

数据使用 ImageJ（配备 Mac biophotonics 插件，www.macbiophotonics.ca）以及在 Matlab 和 R 中编写的自定义程序进行处理，步骤如下：

  1. 校正样本移动伪影：使用 ImageJ 中 StackReg/TurboReg 的“刚体”模式（bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg），对同一动物样本的所有图像（例如，每次40帧，共30次测量）进行对齐。此步骤用于消除标记神经元在单次测量内及不同测量间相对于采集帧的位置偏移。然而，仅能校正xy平面内的位移。若出现明显的焦距变化，则应舍弃相关数据。
  2. 将图像序列分割为独立的10秒（40帧）测量片段。
  3. 校正漂白伪影：荧光光照会导致单次测量过程中荧光信号逐渐衰减10。在某些情况下，分析数据前必须对此衰减进行校正。对每次测量计算一个背景帧，即刺激开始前若干帧（例如第6至14帧）的平均值。将每一帧除以该背景帧，以获得相对荧光变化。通过取G-CaMP标记区域内所有像素的平均值，计算每帧的平均相对荧光强度。对平均荧光曲线拟合双指数函数，其中刺激前的帧赋予较高权重，而气味响应时段（本实验中为刺激开始后20帧）则赋予零权重。将每个像素的相对荧光曲线减去拟合得到的曲线，再将校正后的帧乘以背景帧，以恢复原始数据。如果信号在测量结束时未回到基线（例如诱发了抑制性或极强的兴奋性反应），此类校正可能改变响应动力学特征（见图4）。尽管在多数情况下漂白校正是有益的，但在应用漂白校正后，对时间参数的解释应谨慎进行。
  4. 计算每次测量中每一帧的相对荧光变化（ΔF/F），公式为 (Fi-F0)/F0*100，其中 F0 为背景帧（见步骤5.3），Fi 为该次测量中第 ith 帧的荧光值。
  5. 在直径为10像素的圆形感兴趣区域内（见图3B），计算每个肾小球内的平均ΔF/F，以获得活动轨迹（见图5A）。如需要，可使用 ImageJ 将这些轨迹转换为热图（见图5A）。
  6. 通过从响应峰值期间四个帧的平均ΔF/F中减去刺激前四个帧的平均ΔF/F，计算响应的峰值幅度。该方法既可用于展示空间响应模式（见图3B），也可用于量化不同果蝇特定感兴趣区域的响应幅度（见图5B）。峰值响应亦可通过积分刺激时段曲线下面积，或对响应最大值附近的帧取平均来量化。

6. 代表性结果

我们采用上述方案记录并分析了在嗅觉共受体IR8a启动子控制下表达G-CaMP1.628的果蝇对丙酸的响应，该启动子在多种不同的嗅觉神经元（OSN）群体中具有活性29,30（图3-5）。使用1%丙酸刺激可诱导投射至两个肾小球DC4和DP1l的OSN中G-CaMP荧光增强——表明细胞内钙离子浓度升高（图3B）。我们在图5中展示了来自多只果蝇数据的不同呈现方式：神经活动轨迹线、热图以及峰值响应的柱状图。丙酸诱导的响应在DC4和DP1l中表现出不同的峰值幅度和时间动力学特征。此外，尽管响应通常较为稳定，但在两个肾小球中均可观察到个体动物之间的差异（见图5A中的热图）。对峰值响应的量化（图5B）可实现不同肾小球及不同气味分子在不同动物间进行简单的统计学比较。然而，气味诱发的钙信号响应可能具有非均一的时间动力学特征，仅用单一数值来量化其强度将忽略这一复杂性。

昆虫神经生物学实验装置；包含铜网、仙人掌刺和触角叶的示意图。
图 1. 固定装置的示意图：（A）放入果蝇前，（B）放入果蝇后，以及（C）放大后的顶视图（改编自31）。

带有光源、CCD相机和触角叶荧光以进行气味分析的嗅觉仪示意图。
图 2. 实验装置示意图。

钙成像图示，触角叶对丙酸的反应，ΔF/F峰值幅度分析（%）
图3. （A）完成步骤2.8后的果蝇制备样本的俯视图（左图），以及用G-CaMP1.6标记的触角叶的原始荧光图像（基因型：IR8a promoter:GAL4; UAS:G-CaMP1.6）。DC4和DP1l神经小球可通过其形态、大小和位置加以区分，分别以红色和蓝色标出。
（B）对丙酸（1% v/v）反应的彩色编码图像。该图像对应于按步骤5.6所述方法计算得到的反应峰值ΔF/F值（另见图5A）。左侧的颜色标尺表示%ΔF/F值。黑色圆圈标示了用于量化反应的感兴趣区域的位置和大小（见图5）。

显示漂白校正、ΔF/F% 变化、荧光信号数据比较的气味反应图。
图4. 荧光报告信号漂白的校正。如步骤5.3所述，漂白校正效果的示例。左侧面板中的样本数据可在响应曲线形状无明显改变的情况下完成校正。右侧面板中的样本数据受漂白校正影响较为严重，可能是因为在气味刺激结束后，信号下降并持续低于基线水平。

荧光变化图；分析气味反应，DC4 与 DP1l，以 ΔF/F % 峰值幅度表示。
图 5. （A）上图：小球 DC4（左）和 DP1l（右）对丙酸（1% v/v）的钙反应时间动态。黑色轨迹显示了八个动物在感兴趣区域（见图 3B）内平均 ΔF/F 的中位数。灰色区域表示分布的第一和第三四分位数之间的范围。使用中位数和四分位数范围比使用均值和标准误能更全面地反映观测反应的变异性与分布情况。绿色和品红色方框表示用于计算图 3B 中所示并在图 5B 中量化的峰值反应的帧。下图：热图显示了每个单独动物的反应数据，每行代表一个动物，ΔF/F 值由右侧的颜色标尺表示。水平黑色条表示刺激的时间和持续时间。（B）八个动物中 DC4 和 DP1l 小球对丙酸的中位峰值反应。误差线表示分布的第一和第三四分位数之间的范围。

讨论

此处描述的制备与分析方法可用于研究触角叶中任何神经元群体（OSNs、LN 和 PNs）的气味诱发反应，前提是存在相应的驱动转基因品系。尽管本文以荧光显微镜为例说明该技术的应用，但该制备样品同样适用于共聚焦显微镜或双光子显微镜成像22,32。事实上，后两种仪器可减轻宽场显微镜中的光散射问题，而光散射会降低图像分辨率，尤其是在大量神经元表达报告基因的情况下。该制备样品通常可支持至少半小时的气味诱发反应记录，但实际记录时长可能显著更长或更短，具体取决于记录的测量次数与持续时间、每帧图像的曝光时间以及刺激间间隔。此外，双光子激发可减少荧光报告分子的光漂白及细胞光毒性，从而实现更长时间的连续观测22,32。

无论选择何种显微镜，在完整动物体内成像时，果蝇脑在头囊内的运动始终是最常出现的问题。虽然运动校正能够纠正轻微的位移（步骤 5.1），但通常最好仅从高度稳定的样本中进行记录。减少运动伪影的策略包括：（i）使用仙人掌刺适当地固定果蝇的喙；（ii）在步骤 2.6 之前，用二十烷将果蝇的足固定在载物台上以实现固定（二十烷可在约 37 °C 下熔化；可使用银丝延伸并修整电烙铁的尖端以实现此目的）；（iii）用精细镊子刺破食道（可见于触角神经之间）。

除了本研究中使用的 G-CaMP1.6 外，目前已有多种经过优化的 G-CaMP 版本及其他钙离子指示剂，它们在信噪比、基础荧光水平和时间动力学方面各不相同12,28,33。传感器的具体选择应综合考虑这些特性、待分析神经元的类型以及所研究的生物学问题。现有的传感器所报告的钙离子变化与动作电位具有较好的相关性12,34，随着传感器性能的进一步提升，以及特异性遗传驱动品系数量的不断增加35，完整果蝇中神经活动的光学成像潜力将持续得到增强。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Silke Sachse和Beate Eisermann在本方法开发过程中的贡献，感谢Pablo Traversa绘制安装底座的蓝图，以及Daniela Pelz允许使用图1中的示意图。我们感谢Silke Sachse、Pavan Ramdya和Raphael Rytz对稿件提出的宝贵意见。R. Bell获得了勃林格殷格翰基金会博士奖学金的支持。R. Benton实验室的研究工作由欧洲研究理事会独立科研启动基金和瑞士国家科学基金会资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仙人掌刺园艺中心长约7mm，细长且不宜过软
松香弦乐器商店
双组分硅胶World Precision Instruments, Inc.KWIK-SIL
定制有机玻璃安装块figure-materials-1 蓝图可获取
铜网Athene GridsG220-5通常用于电子显微镜样品。
螺丝五金店直径2 mm
塑料盖玻片Plano GmbHL419322 × 22 mm
电烙铁头Conrad Electronics830283-62
稳压电源Conrad Electronics511407-62
细导线IsabellenhütteIsa-ohm0.013 mm
二十烷Sigma-Aldrich21,927-4
显微镜Carl Zeiss, Inc.Axioexaminer D1
CCD相机Visitron SystemsCoolSnap HQ
MetafluorVisitron Systems采集软件
单色仪Visitron SystemsVisichrome
可折断刀片Fine Science Tools10050-00
刀片夹持器World Precision Instruments, Inc.14134
蓝宝石刀片World Precision Instruments, Inc.500314双刃，1 mm
膜式气体泵KNF NeubergerNMP 830 KVE
蓝宝石刀片夹持架World Precision Instruments, Inc.500317
三通阀Lee CompanyLFAA1200118H配置E
转子流量计 500 ml/minAnalyt-MTC112-08SA
转子流量计 5 L/minAnalyt-MTC102-08SA
蜂蜡Siladent Technik209212
纤维素垫Kettenbach31003
镊子Plano GmbHT5130Dumont生物学#5
注射器BD Biosciences3009282 ml，Discardit II，2件装
针头Braun Sterican4665120外径1.2 mm

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