操纵日本三角涡虫 Dugesia japonica 再生的药理学与功能遗传学实验方法

摘要

在活体动物中研究干细胞分化的理想模型是涡虫（planarian flatworm）。通过简单的截肢实验可研究其再生过程，这些实验在基础实验室中易于操作，并可结合药理学和遗传学方法（in vivo RNAi）进行干预，本文所述的实验方案对此进行了详细说明。

摘要

自由生活的涡虫扁形虫因其卓越的再生能力，长期以来被广泛用于实验研究¹。从这些动物身上切下的小片段能够在缺失身体结构再生后重新形成原有的身体模式。例如，若从完整的虫体上切下一“躯干”片段，其前端将再生出新的“头部”，后端将再生出新的“尾部”，从而恢复截断前原有的“头-尾”身体结构极性（图1A）。

再生过程由涡虫的干细胞（称为“neoblast”）驱动，这些干细胞在正常身体稳态和强制组织再生过程中可分化为约30种不同的细胞类型。该再生过程 robust 且易于演示。由于多个开创性实验室的投入，目前许多工具和功能基因学方法已针对这一模式系统进行了优化。因此，近年来在理解与操控涡虫发育可塑性背后的分子事件方面取得了显著进展^2-9。

涡虫模型系统将引起广大科学家的兴趣。对于神经科学家而言，该模型提供了研究整个神经系统再生的机会，而不仅仅是研究许多现有模型中通常关注的单个神经细胞过程的再生或修复。涡虫表达多种神经递质¹⁰，是研究中枢神经系统进化的重要体系^{11, 12}，并具有行为筛选的潜力^{13, 14.}

再生结果可通过药理学和遗传学方法进行调控。例如，可通过在截肢后不同时间点将生物体片段置于含有药物的溶液中，以筛选药物对再生的影响。通过基因敲降方法可研究单个基因的作用（体内 RNAi），可通过反复显微注射或喂食经细菌表达的dsRNA构建体来实现^{8, 9, 15}两种方法均可产生高外显率的显著表型——例如，再生出双极性动物^16-21为促进该模型的应用及相关方法的实施，本视频文章展示了药理学与遗传学检测的实验方案（体内 通过喂食进行RNA干扰）使用涡虫 日本三角涡虫.

方案

1. 躯干片段再生实验

1. 在进行再生实验前，至少停止喂养一组线虫5天，以确保动物体内无排泄物和摄入的食物（约30条完整线虫，每条线虫在饥饿后长度约为8–10 mm）。
2. 在检测当天，用水冲洗一个预先冷冻并调平的冰盘，并用塑料膜覆盖其平坦的冰面。使用镊子将一张滤纸放置在塑料膜上。
3. 用几滴泉水润湿滤纸。将涡虫转移至滤纸上。<使用移液管将每片滤膜上的线虫调整至20条。如有必要，可加入更多泉水重新吹打以调整线虫在滤膜上的位置。去除多余液体。
4. 使用解剖刀，在动物前端顶点与咽部前端之间约一半位置处，通过单次切割截去头部。图1A).
5. 使用解剖刀，在动物尾端与咽部后端中点附近进行单次切割，截除尾部区域（图1A）。切割后，用70%乙醇润湿的纸巾擦去手术刀上多余的黏液，再将手术刀上的多余乙醇擦拭干净。
6. 用镊子将滤膜转移至含有泉水的培养皿（100 × 25 mm 深度）中。静置约 3 分钟（直至伤口闭合，表现为伤口处收缩并变暗，可观察到）。
7. 将滤纸上的躯干片段冲洗至含有目标培养基的培养皿中，用于再生实验，并转移至恒温培养箱（24 °C）中培养。
8. 约1周后，当再生结构可辨认时，对再生表型进行评分（图1A).

2. 药理学调控再生：吡喹酮诱导的双极性

1. 通过将药物溶于DMSO中配制吡喹酮（PZQ）储备液（1 mL中含62.4 mg PZQ，配制成200 mM储备液）。请于同一天内使用。
2. 在缓冲的Montjuch盐溶液中配制含药溶液（含90 μM PZQ），总体积为50 mL。涡旋震荡约1分钟，以确保充分分散。
3. 按照上述[方案#1]所述进行躯干片段再生实验，在最后一步[1.7]将一批躯干片段暴露于PZQ中。
4. 24–48小时后，将含PZQ的培养介质更换为泉水，并多次（>3次）洗涤蠕虫。
5. 将蠕虫放回培养箱继续培养。在切割后一周观察并记录双头表型（两个头部，图1B）。

3. 再生的遗传学操控：体内 RNAi 饲喂方案

1. 在进行检测前，制备鸡肝匀浆。从食用级鸡肝中剔除脂肪和黄色部分，将剩余肝脏组织匀浆化。将匀浆液通过网筛过滤，并分装至1.5 mL离心管中（每管1.5 mL），于-20 °C保存备用。
2. 在进行检测前，将牛红细胞（RBCs）分装为每份1 mL的样品，于-20 °C保存备用。
3. 选取用于RNA干扰（RNAi）实验的涡虫。共使用三个实验组：目标基因组、阳性对照组（已知具有RNAi表型的基因；图1C、D和E）以及阴性对照组（无RNAi表型的基因，也可用于评估实验组基因敲降水平）。每组使用约250只涡虫（饥饿至少5天后体长约为8–10 mm）。将涡虫保存在塑料容器中的泉水中。
4. 对每个RNAi实验组，解冻表达靶向目标基因的dsRNA的大肠杆菌菌液 [8]，同时解冻一管鸡肝匀浆 [3.1] 和一管红细胞 [3.2]。
5. 离心收集细菌（13,000g，1分钟）。弃上清，将菌体沉淀重悬于2xYT培养基中（约700 μL）。再次离心，弃上清，将沉淀置于冰上备用。
6. 通过剪切P200移液枪头末端制成大口径枪头。将细菌沉淀充分重悬于鸡肝匀浆（150 μL）和红细胞（50 μL）的混合液中，制成RNAi喂食混合物。通过离心去除气泡。
7. 进行喂食操作时，从盛有涡虫的塑料容器中移除大部分水（保留约1英寸深的水量）。轻轻旋转容器使涡虫聚集于中央，然后将RNAi喂食混合物以环形方式滴加，围住涡虫。使用移液管小心地将逃出的个体引导回喂食混合物区域，注意避免干扰其他正在进食的涡虫！
8. 喂食约1小时后，挑选进食良好的个体。这些涡虫因摄入红细胞而呈现深红色。舍弃未进食或进食不佳的个体。
9. 小心地用新鲜泉水替换喂食溶液，尽量减少扰动以防止食物排出。操作时，先用移液管将涡虫轻柔地集中至容器一侧，倾倒出浑浊的水，然后沿容器对侧壁缓慢加入新鲜泉水。应迅速使涡虫重新浸没于水中，因长时间暴露于空气中也会导致食物排出。
10. 将容器盖 loosely 密封后放回培养箱（24 °C）。
11. 重复RNAi喂食程序，进行多个周期（间隔约2–3天），并穿插再生周期 [方案#1]，以筛选RNAi表型。一个适用于多种基因的标准喂食与再生流程如图2所示，总时长约1个月。

可根据不同基因修改此方案，因为最佳实验流程取决于多种因素，例如 mRNA 稳定性、组织定位、蛋白质存续时间，或在再生后阻止多次饲喂周期的表型发展。可通过筛选表型外显率（若表型明显）或采用 qPCR 方法检测靶向 mRNA 水平，并与阴性对照组进行比较，以评估基因敲低水平。

4. 代表性结果：

躯干片段再生实验具有高度稳健性，所有涡虫均应以正常的前后轴（“头至尾”）极性完成再生。这一现象最早可在切割后五天进行评分，此时前端的眼点已开始出现（星号标记，图1A）。然而，缺失结构的完全形态学重建通常在一周后完成。通过吡喹酮（PZQ）对躯干片段再生进行药理学干预，可高效诱导双头表型（图1B）（EC₅₀=87 (±) 11% 双极性片段，70μM PZQ 处理48小时²⁰）。双极性表型在单个再生周期内即可形成。若此类实验中效果较低，可能与药物溶解度和/或储存条件有关，或使用了对PZQ无响应的其他扁形动物物种。对于穿透率较低的药物，常采用前部化指数（anteriorization index）对非完全双极性的中间表型进行评分²²。阳性对照构建体RNAi所导致的表型如图1所示：对Dugesia japonica six-1（Dj-six-1）进行RNAi可导致无眼表型²³（图1C）；对Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2)进行RNAi可导致避光反应丧失²⁴（图1D）；对Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1)进行RNAi可导致躯干片段形成双头表型^{16-19, 21}（图1E）。这些表型可通过以下简单RNAi方案实现：Dj-six-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx)，其中F代表喂食周期，x代表再生周期。

图1： 躯干片段再生实验。A 左，涡虫图像（上方）及示意图（中），显示被切除的躯干片段位置。右，躯干片段再生的时间进程，显示在指定时间点（天）再生片段的形态变化。B 经吡喹酮（PZQ）处理后产生的双头涡虫图像。C 通过 Dj-six-1 RNA干扰（RNAi）产生的无眼涡虫。D 与可移动的对照组涡虫（绿色染色）相比，不能移动的 Dj-PC2 RNAi 涡虫（红色染色）丧失了避光反应。E 通过 Dj-βcatenin-1 RNAi 产生的双极性涡虫。在 B-E 中，RNAi 涡虫的原始前端均朝向左侧。

图 2： 典型 RNAi 实验方案的喂食与切割周期序列，包含多次喂食（F）和再生周期（x），该方案对敲低D. japonica中的多个基因有效。针对个别基因可能需要对该方案进行调整以获得最佳效果，例如减少（括号内）或增加喂食和再生周期的次数。

讨论

本文所述方案详细介绍了研究和调控涡虫再生的实验方法 日本三角涡虫它们操作简便，无需特殊设备，因此可在实验室或教室中轻松开展。这些检测既可单独进行，也可组合使用（用于药物功效的化学遗传筛选）。 体内可在候选基因水平进行，也可适用于无偏倚的高通量筛选⁸无论是为了深入研究涡虫本身引人入胜的生物学特性，还是为了评估 体内 哺乳动物同源基因在组织再生研究的替代模型中的功能，这些方法应能激发来自不同领域研究人员的兴趣。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
泉水	Kandiyohi。Premium Waters 公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州	n/a	其他类型的泉水效果也很好。请先在细胞活力检测中进行试验。
1 × 缓冲 Montjuï氯化物盐溶液：NaCl (1.6 mM)、CaCl₂ (1 mM)、MgSO₄ (1 mM)、MgCl₂ (0.1 mM)、KCl (0.1 mM)、NaHCO₃ (1.2 mM)、HEPES (1.5 mM)。24℃时pH为7.4°C.	多家供应商	n/a	再生实验中用于药物处理的人工水，以确保pH缓冲。5/8霍尔特弗雷特液’s 溶液是一种替代方案。
2xYT 肉汤	Fisher Scientific	BP2467-500	培养基 = 31 g/L，经高压灭菌。
培养皿（100×25 mm）	Fisher Scientific	08-757-11	再生周期中线虫的饲养
方形培养皿（100×100×15 mm）	Fisher Scientific	08-757-11A	加水后冷冻，制成用作线虫切割平台的冰盘
塑料管：Ziploc Twist ’n 容量（16盎司）。	各种	n/a	用于RNAi实验组的便捷防水容器
鸡肝	商业杂货	n/a	由于避免使用抗生素，倾向于选择有机产品。
手持式搅拌器	任何供应商	n/a	用于制作鸡肝泥
1毫米金属网筛	任何供应商	n/a	用于过滤鸡肝泥
牛红细胞	Lampire Biological Laboratories	7240807	100% 洗涤并混匀的红细胞悬液
圆形滤纸	Whatman，GE Healthcare	1003 055
移液管	Fisher Scientific	13-711-41
无菌外科手术刀片	多家供应商	n/a
±吡喹酮	Sigma-Aldrich	P4668	将粉末分装后避光保存于4℃°C. 干燥。
Dj-six-1		GenBank AJ557022.1	RNAi 阳性对照用于 “无眼” 表型23
Dj-βcatenin-1		GenBank AB181913.1	RNAi 阳性对照用于双头表型17
Dj-PC2			RNAi阳性对照用于消除避光表型24