探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

摘要

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。

摘要

在大多数真核细胞中，细胞核是体积最大的细胞器，其刚性通常比周围的细胞骨架高2到10倍；因此，在生理和病理条件下，细胞核的物理特性对细胞整体的生物力学行为具有显著影响。例如，在迁移的中性粒细胞和侵袭性癌细胞中，细胞核的刚性可能在血管外渗或穿越组织内狭窄空间时构成主要障碍¹。另一方面，处于机械活跃组织（如肌肉）中的细胞其细胞核需要足够的结构支撑，以承受反复的机械应力。重要的是，细胞核与细胞结构紧密整合；它在物理上与周围的细胞骨架相连，这对于细胞内细胞核的移动和定位至关重要，例如在极性细胞、神经肌肉接头处的突触核或迁移中的细胞中²。毫不奇怪的是，最近研究表明，核膜蛋白（如核纤层蛋白lamin和nesprin）的突变会引发多种人类疾病，这些蛋白在决定核刚性和核-细胞骨架耦联中起关键作用，相关疾病包括Emery-Dreifuss肌营养不良症、肢带型肌营养不良症和扩张型心肌病³。为了研究多种核膜蛋白的生物物理功能以及特定突变的影响，我们已开发出实验方法，用于研究在整体或局部机械扰动下单个活细胞中细胞核的物理特性。通过精确施加基底应变并测量由此引起的细胞核形变，可以获得有关细胞核可变形性的重要信息，并实现不同突变体或缺乏特定核膜蛋白的细胞系之间的定量比较。使用微针施加局部细胞骨架应变可作为该检测方法的补充，能够提供有关细胞核与细胞骨架之间细胞内力传递的额外信息。在完整活细胞中研究核力学可保留正常的细胞内结构，并避免使用分离细胞核时可能出现的人工假象。此外，基底应变施加为肌肉或其他组织中细胞所经历的生理应力（例如，暴露于血管应变下的血管平滑肌细胞）提供了良好的模型。最后，尽管这些工具主要被开发用于研究核力学，它们也可用于探究细胞骨架蛋白的功能及机械转导信号通路。

方案

1. 底物应变施加

归一化核应变的测量包括制备带有透明弹性硅胶膜作为细胞培养表面的应变培养皿，将细胞接种到培养皿上，以及在施加（单轴或双轴）应变之前、期间和之后获取细胞的图像。

硅胶膜培养皿的制备与细胞贴附

1. 每个应变培养皿由一个定制的无底塑料皿（直径为3英寸）和一个用于固定硅胶膜的塑料O型圈组成，硅胶膜作为细胞培养的基底。制备应变培养皿时，将一块4英寸×4英寸的硅胶膜夹在O型圈与培养皿之间。小心剪去多余的膜，用去离子水冲洗，并对应变培养皿进行高压灭菌。
2. 在用细胞外基质分子（如纤连蛋白）包被硅胶膜之前，先在膜底部中心位置（外侧）标记一个参考点。该标记有助于在应变实验过程中识别相同的细胞。（可选：若施加单轴应变，可在参考点周围粘贴两条平行的透明胶带，以限制膜在一个方向上的形变。）
3. 为提供最佳的细胞贴附效果，使用10 ml PBS稀释的3 μg/ml纤连蛋白或其他合适的细胞外基质蛋白包被硅胶膜。用倒置的10 cm聚苯乙烯培养皿覆盖应变培养皿，并在4°C下孵育过夜。
4. 次日，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗膜一次，以去除多余的蛋白。向培养皿中加入10 ml生长培养基（含高糖的杜氏改良伊格尔培养基，补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素），备用。
5. 将小鼠胚胎成纤维细胞用0.05%胰蛋白酶消化后，以约30%的汇合度接种到包被好的硅胶膜培养皿中....

讨论

底物应变测定

我们及其他研究团队已成功应用应变加载技术，研究在机械应力作用下细胞核的形变，并探究特定核膜蛋白对细胞核刚性的贡献。^4-8 该技术的优势在于，可在细胞正常的细胞内环境及细胞骨架背景下探测活细胞核的力学特性，且基底应变的施加方式类似于多种组织中所存在的生理负荷，例如收缩中的肌肉或血管壁。⁹ 此外，该方法可同时对多个细胞施加应变，从而增加单次实验中可分析的细胞数量。基底应变检测的一个局限性在于其无法直接测量细胞核的刚性，而是用于确定细胞核相对于周围细胞骨架的相对刚性。对经受单轴基底应变的细胞中诱导产生的细胞核与细胞骨架应变进行详细分析表明，在野生型细胞中，细胞骨架的应变程度与所施加的基底应变相近，而更刚性的细胞核则形变显著更小。⁴ 尽管如此，仍可能需要其他检测方法（如微针操控检测）来确认不同细胞系之间观察到的细胞核形变差异并非由核-细胞骨架耦合状态或细胞骨架结构的改变所致。尽管存在这些局限性，在完整细胞中而非在分离的细胞核中测量细胞核力学特性，可最大程度地降低因渗透效应、分离过程中的损伤或其他与细胞核分离相关的改变.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤连蛋白	EMD Millipore	FC010
MitoTracker Red FM 和 Green FM	Invitrogen	M22425 和 M-7514
H–chst 33342	Invitrogen	H3570
Hank’s 平衡盐溶液	Invitrogen	14185
酚红-free，DMEM	Invitrogen	21063
胎牛血清	Aleken Biologicals	FBSS500
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
含丝硼硅酸盐玻璃	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10
光面/光面无增强硅胶片，0.005"	Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Invitrogen	14200
35 mm 玻璃底培养皿（FluoroDish）	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Braycote 804 真空润滑脂	SPI Supplies	05133A-AB