探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

摘要

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。

摘要

在大多数真核细胞中，细胞核是体积最大的细胞器，其刚性通常比周围的细胞骨架高2到10倍；因此，在生理和病理条件下，细胞核的物理特性对细胞整体的生物力学行为具有显著影响。例如，在迁移的中性粒细胞和侵袭性癌细胞中，细胞核的刚性可能在血管外渗或穿越组织内狭窄空间时构成主要障碍¹。另一方面，处于机械活跃组织（如肌肉）中的细胞其细胞核需要足够的结构支撑，以承受反复的机械应力。重要的是，细胞核与细胞结构紧密整合；它在物理上与周围的细胞骨架相连，这对于细胞内细胞核的移动和定位至关重要，例如在极性细胞、神经肌肉接头处的突触核或迁移中的细胞中²。毫不奇怪的是，最近研究表明，核膜蛋白（如核纤层蛋白lamin和nesprin）的突变会引发多种人类疾病，这些蛋白在决定核刚性和核-细胞骨架耦联中起关键作用，相关疾病包括Emery-Dreifuss肌营养不良症、肢带型肌营养不良症和扩张型心肌病³。为了研究多种核膜蛋白的生物物理功能以及特定突变的影响，我们已开发出实验方法，用于研究在整体或局部机械扰动下单个活细胞中细胞核的物理特性。通过精确施加基底应变并测量由此引起的细胞核形变，可以获得有关细胞核可变形性的重要信息，并实现不同突变体或缺乏特定核膜蛋白的细胞系之间的定量比较。使用微针施加局部细胞骨架应变可作为该检测方法的补充，能够提供有关细胞核与细胞骨架之间细胞内力传递的额外信息。在完整活细胞中研究核力学可保留正常的细胞内结构，并避免使用分离细胞核时可能出现的人工假象。此外，基底应变施加为肌肉或其他组织中细胞所经历的生理应力（例如，暴露于血管应变下的血管平滑肌细胞）提供了良好的模型。最后，尽管这些工具主要被开发用于研究核力学，它们也可用于探究细胞骨架蛋白的功能及机械转导信号通路。

方案

1. 底物应变施加

归一化核应变的测量包括制备带有透明弹性硅胶膜作为细胞培养表面的应变培养皿，将细胞接种到培养皿上，以及在施加（单轴或双轴）应变之前、期间和之后获取细胞的图像。

硅胶膜培养皿的制备与细胞贴附

1. 每个应变培养皿由一个定制的无底塑料皿（直径为3英寸）和一个用于固定硅胶膜的塑料O型圈组成，硅胶膜作为细胞培养的基底。制备应变培养皿时，将一块4英寸×4英寸的硅胶膜夹在O型圈与培养皿之间。小心剪去多余的膜，用去离子水冲洗，并对应变培养皿进行高压灭菌。
2. 在用细胞外基质分子（如纤连蛋白）包被硅胶膜之前，先在膜底部中心位置（外侧）标记一个参考点。该标记有助于在应变实验过程中识别相同的细胞。（可选：若施加单轴应变，可在参考点周围粘贴两条平行的透明胶带，以限制膜在一个方向上的形变。）
3. 为提供最佳的细胞贴附效果，使用10 ml PBS稀释的3 μg/ml纤连蛋白或其他合适的细胞外基质蛋白包被硅胶膜。用倒置的10 cm聚苯乙烯培养皿覆盖应变培养皿，并在4°C下孵育过夜。
4. 次日，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗膜一次，以去除多余的蛋白。向培养皿中加入10 ml生长培养基（含高糖的杜氏改良伊格尔培养基，补充10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素），备用。
5. 将小鼠胚胎成纤维细胞用0.05%胰蛋白酶消化后，以约30%的汇合度接种到包被好的硅胶膜培养皿中，在正常培养条件下孵育24–48小时。

底物应变实验

6. 为实验设置显微镜。实验在倒置显微镜上进行，配备适用于荧光显微镜、相差或微分干涉（DIC）的数字相机，使用60倍物镜及相应的图像采集软件（例如IPLab或Metamorph）。正置显微镜不适用于本应用。应变装置由一个可安装在显微镜载物台上的底板组成，底板上设有中央圆柱形压头，用于对硅胶膜中央区域施加应变；另包括一个可沿四根导向针上下滑动的移动板，用于承载应变培养皿，以及一块5磅重的砝码板用于施加载荷。
7. 为观察细胞核，将培养皿中的细胞在37°C下与1 μg/mL Hoechst 33342孵育15分钟。吸除培养基后，加入15 mL不含酚红的生长培养基（不含酚红的高糖DMEM培养基，含25 mM Hepes，并添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）。将应变培养皿旋入培养皿支架板中。在硅胶膜底部边缘均匀涂抹润滑脂（Braycote 804真空润滑脂），以确保膜在中央压头表面可顺畅滑动，注意保持膜中央区域清洁无脂。
8. 将底板放置于显微镜载物台上，小心将培养皿支架板安装到底板上。确保在初始静止位置时，应变培养皿的硅胶膜松散地贴合在中央压头上。
9. 首先聚焦于硅胶膜底部，找到中央的黑色参考点。该点将作为所有图像采集的起始位置，并有助于在拉伸过程中及之后定位相同的细胞。我们使用自行编写的自动成像程序来记录细胞位置并在实验过程中重新定位这些细胞，但也可手动完成。
10. 从参考点出发，调整焦距以观察细胞及硅胶膜顶部。选择铺展良好且细胞核位于中央的细胞，采集其相位差图像和Hoechst染色的荧光图像。相位差图像应聚焦于细胞轮廓和硅胶膜，而荧光图像应聚焦于细胞核的中央层面。
11. 在采集5至15个细胞的图像后，将载物台移回中央参考点。缓慢将砝码施加到应变培养皿上，从而在培养皿中央区域产生均匀的应变。最大施加的基底应变由垂直对准针（导向针）上的尼龙限位垫片限定。
12. 聚焦于硅胶膜底部并再次定位参考点。从该点出发，重新定位相同细胞，并在完全应变状态下再次采集细胞和细胞核的相位差与荧光图像，尽量使焦平面与初始图像一致。此过程不应超过10分钟，以避免细胞对受力基底产生主动重塑和适应。
13. 在完成所有对应图像采集后，将显微镜载物台移回起始位置。小心从支架板上取下砝码，使硅胶膜松弛复原。如有必要，可轻轻向上推动应变培养皿，使其恢复至初始位置，然后按照上述应变图像的采集方法，获取应变后细胞的相位差和荧光图像。

分析

14. 通过分析施加应变前后及期间的细胞图像和荧光标记的细胞核图像，计算归一化的细胞核应变。在本实验室中，我们使用自行编写的 MATLAB 脚本进行分析，但也有多种其他可选方案。该分析分为三个步骤。
15. 首先，为计算施加的基底应变，需在膜上手动匹配 3 至 6 个控制点在应变前、完全应变和应变后图像中的位置。MATLAB 程序随后通过比较应变前与完全应变图像中对应控制点的位置，计算施加的膜应变，并同时计算应变前与应变后图像之间的残余应变。此外，这些控制点还用于图像配准，有助于识别受损或脱离的细胞（见图 1）。
16. 第二步，使用另一个独立的 MATLAB 程序手动选择细胞核，该程序通过匹配应变前、完全应变和应变后荧光图像中对应的细胞核大小或核内标记物，计算每个单独细胞核的细胞核应变。为校正不同实验之间施加膜应变的微小差异，我们将结果表示为归一化细胞核应变，即每个细胞核的诱导细胞核应变与施加膜应变的比值。相关 MATLAB 脚本可根据请求从 Lammerding 实验室获取。
17. 最后，对每个细胞核进行验证，排除在施加应变过程中发生脱离或损伤的细胞的数据（见图 1）。

2. 微针操作实验

培养皿、贴壁细胞和微针的制备

1. 将35 mm玻璃底细胞培养皿与低浓度纤连蛋白（0.5 μg/ml）在Hank's平衡盐溶液（HBSS）或其他合适的细胞外基质蛋白中于37°C孵育2小时。用HBSS洗涤培养皿两次，并在进行下一步前向培养皿中加入2 ml生长培养基。
2. 用0.05%胰蛋白酶消化小鼠胚胎成纤维细胞，并将其以7.5 × 10⁴ 个细胞/ml的密度接种于2 ml生长培养基中，接种至经纤连蛋白包被的玻璃底培养皿中。将细胞放回培养箱中过夜培养。应针对其他细胞类型优化细胞接种数量，以获得单个、贴壁且未融合的细胞。
3. 使用商用移液器拉制仪（例如Sutter Instrument Company）将由硼硅酸盐毛细管制成的微针拉制至尖端直径约为1至3 μm。

微针操作实验

4. 第二天，在37°C培养箱中，将细胞与MitoTracker线粒体染料（600 μM；Invitrogen）和Hoechst 33342核染料（1 μg/mL）加入生长培养基中共同孵育30分钟。
5. 在室温下用HBSS洗涤细胞一次，持续5分钟，然后向细胞中加入不含酚红的生长培养基用于成像。
6. 使用倒置显微镜配备60倍物镜（0.70 N.A.，Plan-Achromat）和数字电荷耦合器件相机，获取未插入微针时单个细胞的相差图像一张，Hoechst 33342染料的荧光图像一张，以及线粒体染料的荧光图像一张。
7. 使用微操作器（例如InjectMan NI 2，Eppendorf），小心地将微针插入细胞质中，位置距离核周固定距离（通常为5 μm），并拍摄一张相差图像、一张Hoechst 33342染料的荧光图像和一张线粒体染料的荧光图像。对于本应用，建议通过计算机（例如Windows Hyperterminal）控制微操作器，以实现一致的微操作流程。
8. 以1 μm/sec的速度将微针向细胞边缘移动特定距离（通常为10或20 μm），同时每10秒同步采集一次荧光和相差图像。当微针向细胞边缘移动特定距离时，根据所选参数，在操作过程中将对应采集2-3帧图像。
9. 最后，在微针从细胞骨架移除后，再额外采集若干图像。

分析

10. 使用定制编写的 MATLAB 脚本计算位移图，该脚本基于对细胞核和细胞质中荧光标记特征的追踪。（MATLAB 脚本可应要求从 Lammerding 实验室获取）。该程序在连续图像帧中采用归一化互相关算法，分析小图像区域（大小约为 10 μm × 10 μm，间隔 5 μm）。对于每个区域中心，计算其在 x 和 y 方向上的位移，即原始位置与新识别位置之间的偏移量，并以位移矢量形式显示，同时以数值形式存储。根据位移图，可计算预定义区域内的平均位移。请注意，细胞骨架的位移基于细胞骨架标记物的荧光通道（例如 MitoTracker 线粒体染料），而细胞核的位移则基于 Hoechst 33342 信号对应的荧光通道。在我们的应用中，通常检测以下区域：(i) 应变施加部位的细胞骨架应变，即微针插入部位；(ii) 细胞核内靠近应变施加部位的核应变区域；(iii) 远离应变施加部位的细胞核区域内的核应变；以及 (iv) 穿过细胞核的细胞质区域中的细胞骨架应变。此外，还可以直接从相差图像或 Hoechst 33342 荧光图像序列中测量细胞核的伸长。在这种情况下，施加的核应变通过将核伸长量（ΔL = L – L₀）除以初始长度 L₀ 来计算，其中 L 是应变施加结束时细胞核的最终长度，L₀ 是细胞核的初始长度。对于具有完整核-细胞骨架耦联的细胞，细胞核会朝向应变施加部位伸长。相反，在核-细胞骨架耦联受损的细胞中，即细胞骨架与细胞核之间力的传递效率降低，细胞核在应变施加方向上的伸长将显著减少。因此，细胞核在细胞骨架应变作用下形变减小，表明细胞核与细胞骨架之间存在（部分）去耦联。

3. 代表性结果：

施加底物应变

我们获取了杂合子和纯合子核纤层蛋白A/C缺陷型（Lmna^+/– 和 Lmna^–/–）以及野生型（Lmna^+/+）小鼠的胚胎成纤维细胞在施加应变前、施加过程中及施加后的图像，并随后计算了每个细胞的归一化核应变。分析后，对细胞核进行有效性验证，并将施加应变过程中发生损伤或回缩的细胞从分析中剔除。图1A展示了三个有效细胞的细胞核，而图1B展示了应从分析中排除的细胞。归一化核应变数据来自至少三次独立实验（每次实验包含约5–10个细胞核的测量值），并通过统计学分析与其他细胞组或处理组进行比较。归一化核应变增加表明细胞核刚性降低，这在核膜蛋白核纤层蛋白A/C表达减少的细胞中可见（图2）。

微针操作实验

在微针操控实验中，我们对局部细胞骨架应变施加过程中细胞核和细胞骨架的位移进行了成像。受损或脱落的细胞将被排除在分析之外。分析时，我们测量单个贴壁细胞中细胞核和细胞骨架向受力位点移动的幅度。例如，在图3中，我们追踪了施加细胞骨架应变前后线粒体（细胞骨架标记物）的位移，并将这些位移以矢量形式绘出。每个矢量代表从原始位置到新确定位置之间的位移变化量。图像强度较低或纹理特征不足的区域（例如细胞外区域）将被排除在分析之外。随后，在距离应变施加位点逐渐增加的选定区域中量化细胞骨架和细胞核的位移（图4，对应于插图中彩色方框的区域）。在具有完整核-细胞骨架连接的小鼠胚胎成纤维细胞中，力可贯穿整个细胞传递，导致细胞核和细胞骨架的形变随着远离应变施加位点而逐渐减弱（图4）。相比之下，核-细胞骨架连接受损（或细胞骨架结构异常）的成纤维细胞仅在施加位点附近表现出局部位移，如图4所示，而在更远区域几乎无明显形变。在微针插入位点（橙色方框），对照组成纤维细胞（仅表达mCherry）与核-细胞骨架连接受损的成纤维细胞（DN KASH）所施加的细胞骨架应变程度相当。然而，在其他区域（蓝色、黄色和红色方框）诱导产生的细胞核和细胞骨架位移在核-细胞骨架连接受损的成纤维细胞（DN KASH）中显著小于对照细胞（仅表达mCherry）（图4）。因此，在远离应变施加位点的位置上，细胞骨架和细胞核位移的减少表明细胞骨架与细胞核之间的力传递受到了干扰。

重要的是，我们还通过微针操控转染了GFP-或mCherry-标记肌动蛋白以及GFP-波形蛋白并用Mitotracker Green或Red荧光标记线粒体的小鼠胚胎成纤维细胞，验证了线粒体可作为合适的细胞骨架标记物。细胞骨架的位移图分别独立地根据线粒体与肌动蛋白或波形蛋白细胞骨架的荧光信号进行计算。针对距离应变施加位置由近及远的四个不同细胞骨架区域，分别计算其平均绝对位移。通过线粒体与肌动蛋白或波形蛋白所测数据之间的线性回归分析，分别计算斜率和R²值。对于肌动蛋白，斜率为0.99，R²值为0.986；对于波形蛋白，斜率为1.04，R²值为0.971，证实线粒体的位移可作为细胞骨架形变的可靠指标。

图1. 对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）施加基底应变。在施加20%单轴应变之前、期间和之后，利用相差显微镜和荧光显微镜对分布在硅胶膜上两个不同区域的小鼠胚胎成纤维细胞进行成像。（A）为一次成功实验的示例，显示细胞核完整，细胞在应变作用下未发生损伤或脱落；（B）为在应变施加过程中发生回缩/部分脱落的细胞示例；图（B）所示细胞的结果不纳入分析。在（B）中，左侧细胞表现出细胞骨架损伤和细胞核塌陷的迹象（箭头所示），而右侧细胞在应变施加过程中部分脱离并发生回缩，这可能是施加应变过大的表现。为便于比较，在（A）和（B）中，将未拉伸状态下某一个细胞膜的边界以红色标出，并叠加至同一细胞在应变施加期间和之后的图像上；在（A）中，未拉伸状态下的细胞核边界以绿色标出，并叠加至同一细胞核在应变施加期间和之后的图像上。

图2. 不同MEF细胞系中归一化核应变的分析。 对具有 Lmna^–/– 和 Lmna^+/– 遗传背景的MEF细胞分别异位表达空载体或野生型lamin A进行了分析。与来自野生型同窝小鼠（Lmna^+/+）的MEF细胞相比，lamin A/C表达缺失导致核硬度降低，而重新引入野生型lamin A可完全恢复核硬度。值得注意的是，核硬度降低表现为归一化核应变值升高。误差线代表标准误差。

图3. 微针操控实验用于测量细胞内力传递。 标记了细胞核染料（蓝色）和MitoTracker线粒体染料（绿色）的成纤维细胞的相差（A, B）和荧光（C, D）图像。将微针插入细胞骨架中，位置距离细胞核已知距离（A和C），随后向细胞边缘移动（B, D）。通过使用自编写的互相关算法追踪荧光标记的细胞核和线粒体，量化细胞骨架和细胞核的位移。（E）由荧光图像序列计算得到的最终细胞骨架（绿色）形变位移图；为增强可视性，箭头长度放大了2倍。比例尺，10 μm。

图 4. 微针操作过程中细胞内力传递的分析。 在微针操作期间测量到的细胞骨架和细胞核位移，测量区域对应于彩色方框所示位置（A图插图）。橙色方框为施加应变的部位。尽管在细胞骨架（橙色方框）施加的应变相似，但在核-细胞骨架偶联受损的小鼠胚胎成纤维细胞（DN KASH）中，所诱导的细胞核和细胞骨架位移（蓝色、黄色和红色方框）显著小于对照组（仅表达 mCherry）细胞。

讨论

底物应变测定

我们及其他研究团队已成功应用应变加载技术，研究在机械应力作用下细胞核的形变，并探究特定核膜蛋白对细胞核刚性的贡献。^4-8 该技术的优势在于，可在细胞正常的细胞内环境及细胞骨架背景下探测活细胞核的力学特性，且基底应变的施加方式类似于多种组织中所存在的生理负荷，例如收缩中的肌肉或血管壁。⁹ 此外，该方法可同时对多个细胞施加应变，从而增加单次实验中可分析的细胞数量。基底应变检测的一个局限性在于其无法直接测量细胞核的刚性，而是用于确定细胞核相对于周围细胞骨架的相对刚性。对经受单轴基底应变的细胞中诱导产生的细胞核与细胞骨架应变进行详细分析表明，在野生型细胞中，细胞骨架的应变程度与所施加的基底应变相近，而更刚性的细胞核则形变显著更小。⁴ 尽管如此，仍可能需要其他检测方法（如微针操控检测）来确认不同细胞系之间观察到的细胞核形变差异并非由核-细胞骨架耦合状态或细胞骨架结构的改变所致。尽管存在这些局限性，在完整细胞中而非在分离的细胞核中测量细胞核力学特性，可最大程度地降低因渗透效应、分离过程中的损伤或其他与细胞核分离相关的改变...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤连蛋白	EMD Millipore	FC010
MitoTracker Red FM 和 Green FM	Invitrogen	M22425 和 M-7514
H–chst 33342	Invitrogen	H3570
Hank’s 平衡盐溶液	Invitrogen	14185
酚红-free，DMEM	Invitrogen	21063
胎牛血清	Aleken Biologicals	FBSS500
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
含丝硼硅酸盐玻璃	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10
光面/光面无增强硅胶片，0.005"	Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Invitrogen	14200
35 mm 玻璃底培养皿（FluoroDish）	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Braycote 804 真空润滑脂	SPI Supplies	05133A-AB