本文介绍了一种用于检测特定植物基因组蛋白修饰的可靠且实用的方法。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）与实时定量PCR技术，能够检测在多种生理过程中发挥功能的特定基因上的组蛋白修饰。
本文内容
摘要
摘要
染色质结构对真核生物基因表达的调控具有重要意义。在此过程中，染色质重塑、DNA甲基化以及组蛋白H3和H4氨基末端尾部的共价修饰发挥着关键作用1-2。H3和H4组蛋白的修饰包括赖氨酸和精氨酸的甲基化、赖氨酸的乙酰化以及丝氨酸残基的磷酸化1-2。这些修饰与基因的激活、抑制或处于一种“启动”状态相关，后者可在感知到适当信号（如微生物相关分子模式、光、激素等）后支持基因表达更快速、更强烈地被激活3-7。
本文介绍一种在选定植物基因上可靠且灵敏地检测特定染色质修饰的方法。该技术基于使用甲醛对（修饰的）组蛋白与DNA进行交联8,9，随后提取染色质并进行超声处理，利用针对特定修饰的抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）9,10，解交联组蛋白-DNA复合物，最后通过基因特异性的实时定量PCR进行检测。该方法已被证实可用于检测与玉米中C4光合作用相关的特定组蛋白修饰5,11，以及拟南芥中系统性免疫相关的组蛋白修饰3。
方案
1. 植物材料的交联
- 在50 mL塑料管中采集1-2 g拟南芥叶片（莲座直径6至10 cm），并加入交联缓冲液至40 mL。
- 确保叶片完全浸没于缓冲液中，例如在液面处塞入一块定制的滤膜海绵。然后将管子放入真空干燥器中。
- 抽真空浸润10分钟。每管加入2.5 mL 2 M甘氨酸以终止交联反应，并轻轻倒置管子使甘氨酸均匀分布。
- 再次抽真空浸润5分钟，随后倒掉液体，并用筛网收集叶片。
- 将叶片在1 L烧杯中用去离子水清洗两次，然后用纸巾彻底吸干水分。
- 将叶片转移至新的塑料管中，液氮速冻后于-80°C保存，直至进行染色质分离。
2. 染色质的分离
- 将叶片与预冷至液氮温度的研钵和研杵一起研磨，直至使用。
- 将粉末转移至一个50 mL塑料管中，并加入30 mL提取缓冲液#1悬浮。
- 在4°C下，于 overhead 摇床上孵育15分钟。
- 用四层Miracloth滤布将悬浮液过滤至一个新的50 mL塑料管中。
- 在4°C下，以2,800 × g离心20分钟。
- 弃去上清液，用毛笔将沉淀物悬浮于1 mL提取缓冲液#2中。先加入少量缓冲液#2，用毛笔将沉淀悬浮，再加入剩余缓冲液。
- 将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中，在4°C下以12,000 × g离心10分钟。
- 同时，准备含有1.5 mL提取缓冲液#3的2 mL微量离心管。
- 弃去上一步离心后的上清液（步骤2.7），将沉淀物用毛笔悬浮于300 μL提取缓冲液#3中。先加入少量缓冲液#3，用毛笔悬浮沉淀，再加入剩余缓冲液。
- 小心地将步骤2.9中悬浮的沉淀物加至步骤2.8中已准备好的1.5 mL提取缓冲液#3上方。确保两相不混合。在4°C下以16,000 × g离心1小时。
- 弃去上清液，用毛笔将染色质沉淀物悬浮于300 μL超声破碎缓冲液中。
- 使用超声探头或超声水浴对染色质进行超声处理，使DNA片段化至约400 bp。超声过程中需确保染色质温度不超过约30 °C，以保护热敏感的交联结构。超声时间需根据实验确定，因不同超声设备间差异显著。以下提供两种不同设备的参考设置：
使用Bandelin品牌的超声探头进行超声处理时，将染色质置于0.6 mL离心管中，以25%功率、周期=50的设置进行5次超声，每次20个脉冲。每次超声后需对样品进行冷却。th 在冰浴中爆裂。
使用 Diagenode Bioruptor 超声波破碎仪进行超声处理时，将水和冰加入超声波浴槽中，于1.5 mL离心管中以“高”档设置超声处理10次，每次30秒。每次超声30秒后，将样品冷却30秒。
- 在4°C条件下，以16,000g离心超声处理后的样品5分钟，以沉淀未溶解的物质。上清液可直接用于免疫沉淀。或者，样品可用液氮速冻，并在-80°C保存，直至后续使用。
3. 免疫沉淀
- 准备含有 40μL 蛋白A琼脂糖和 1.8mL 抗体结合缓冲液的 2-mL 微量离心管。加入 200μL 染色质样品（步骤 2.13）。
- 在振荡器上 4°C 孵育 1 小时。
- 弃去蛋白A琼脂糖珠，取上清液用于免疫沉淀。
- 取出 40μL 等分试样以测定染色质浓度（“输入”样品）。
- 向 400μL 超声处理后的染色质悬浮液中加入 30μL 蛋白A琼脂糖以及下表“特定试剂与设备”中指定量的修饰特异性抗体。
- 在 4°C 振荡器上孵育 2.5 小时或过夜。
- 在 440 × g 条件下离心 2 分钟，沉淀珠子。
- 依次用 900μL 各种洗涤缓冲液（见下表列表）洗涤珠子沉淀。每种缓冲液均需在 4°C 振荡器上孵育 10 分钟，然后在 440 × g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液，再加入下一种缓冲液。
- 低盐洗涤缓冲液
- 高盐洗涤缓冲液
- LiCl 洗涤缓冲液
- TE 洗涤缓冲液
- 最后一次洗涤后，彻底去除残留的缓冲液。
4. 组蛋白与DNA的去交联及沉淀DNA的纯化
- 向琼脂糖沉淀和第3.4步中保留的40μl“输入”样品中各加入100μL去交联缓冲液，在涡旋振荡器上混匀5分钟，离心样品后于65°C孵育过夜。
- 使用商品化的DNA纯化试剂盒或PCR产物纯化试剂盒纯化DNA。
- 通常取最终洗脱液1:5稀释后的5μl即可用于常规的位点特异性实时定量RT-PCR（RT-qPCR）分析。
5. 缓冲液配方表
| 交联缓冲液 | |
| 丁酸钠 | 10mM |
| 蔗糖 | 400mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-巯基乙醇 | 5mM |
| 甲醛 | 3% (v/v) |
| 提取缓冲液 #1 | |
| 丁酸钠 | 10mM |
| 蔗糖 | 400mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-巯基乙醇 | 5mM |
| Complete蛋白酶抑制剂 | 1x |
| 提取缓冲液 #2 | |
| 丁酸钠 | 10mM |
| 蔗糖 | 250mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-巯基乙醇 | 5mM |
| MgCl2 | 10mM |
| Triton X-100 | 1% (w/v) |
| Complete蛋白酶抑制剂 | 1x |
| 提取缓冲液 #3 | |
| Sodium butyrate | 10mM |
| Sucrose | 1.7M |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 10mM |
| β-Mercaptoethanol | 5mM |
| MgCl2 | 2mM |
| Triton X-100 | 0.15% (w/v) |
| Complete Protease Inhibitor | 1x |
| 超声缓冲液 | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 25mM |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 5mM |
| SDS | 0.5% (w/v) |
| Complete蛋白酶抑制剂 | 1x |
| 抗体结合缓冲液 | |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 50mM |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 1mM |
| NaCl | 150mM |
| Triton X-100 | 0.1% (w/v) |
| 低盐洗涤缓冲液 | |
| NaCl | 150mM |
| SDS | 0.1% (w/v) |
| Triton X-100 | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 2mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| 高盐洗涤缓冲液 | |
| NaCl | 500mM |
| SDS | 0.1% (w/v) |
| Triton X-100 | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 2mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| LiCl 洗涤缓冲液 | |
| 氯化锂 | 250mM |
| Nonidet-P40 | 1% (v/v) |
| 脱氧胆酸钠 | 1% (w/v) |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 1mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 20mM |
| TE 洗涤缓冲液 | |
| EDTA-NaOH, pH 8.0 | 10mM |
| Tris-HCl, pH 8.0 | 1mM |
| 解交联缓冲液 | |
| Tris-HCl, pH 6.8 | 62.5mM |
| NaCl | 200mM |
| SDS | 2% (w/v) |
| DTT | 10mM |
6. 代表性结果：
表达 拟南芥 PR2 编码具有抗菌活性的β-1,3-葡聚糖酶的防御基因12，由苯并噻二唑（BTH）诱导，BTH 是植物激素水杨酸的一种合成类似物3. 图1 表明激活 PR2 表达与组蛋白H3和H4上赖氨酸残基乙酰化水平的升高相关 PR2 启动子。由于核小体密度在基因激活过程中降低13组蛋白乙酰化水平通过组蛋白3不变区域抗体的信号进行归一化处理。
图1 BTH诱导拟南芥中PR2启动子区域的组蛋白乙酰化。植物用100μM BTH或可湿性粉剂对照处理。处理72小时后，收集叶片并分离染色质。使用特异性识别乙酰化位点的抗体进行免疫沉淀后获得的信号，经抗组蛋白H3恒定结构域抗体免疫沉淀信号归一化。沉淀的染色质通过RT-qPCR定量。数据已标准化为未用BTH处理时的组蛋白修饰水平。
讨论
该实验方案中最关键的步骤包括DNA与组蛋白的交联、叶片材料的类型和用量、材料的研磨以及染色质的超声处理。有关这些问题的更详细讨论，请参见参考文献9和10。
超声处理与交联：
超声处理过程中将染色质打断至约400 bp的片段至关重要。过度超声会破坏DNA和组蛋白，从而降解染色质；而超声不足则会留下较长的染色质片段。这些情况会影响实验的特异性，因为无法区分远离目标位点的组蛋白修饰与局部修饰。最佳的超声效率检测方法是：在超声处理前后分别收集20 μL染色质样品，解交联DNA与组蛋白，纯化DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳测定剪切后DNA的长度。电泳前应在样品中加入RNase，因为在此纯化阶段，染色质样品中仍含有大量RNA，可能干扰片段化DNA的可视化。若未剪切染色质的DNA长度超过10 kbp，而剪切后染色质的DNA在凝胶上呈现约400 bp处信号最强的弥散条带，则该样品适用于染色质免疫沉淀实验。
我们通常使用3%（v/v）甲醛对完整叶片中的染色质进行交联，但在大多数情况下，1%（v/v）甲醛可能已足够。据我们的经验，较低浓度的甲醛可缩短后续超声处理时间，并降低PCR反应中的背景信号。然而，甲醛用量不足常常导致独立重复实验之间PCR信号的可重复性较低，这可能是由于低浓度下甲醛渗透叶片不充分所致。请务必频繁更换甲醛储备液，因为该化合物会随时间推移发生聚合。甲醛溶液仅在约一个月内保持稳定，甲醇稳定化几乎无法延长其有效期。建议在建立实验条件时测试不同的甲醛浓度。
植物材料用量及研磨：
使用大量缓冲液浸润少量叶片材料非常重要，以避免叶片相互粘连。叶片粘连通常会导致甲醛浸透不充分。此外，过多的植物材料会堵塞Miracloth纱布的孔隙。研磨效率在很大程度上取决于研钵和研杵是否匹配得当。我们通常在不额外添加液氮的情况下，使用经液氮预冷的研钵和研杵研磨三次，每次50秒，直至材料被研磨成细粉。
致谢
本工作由德国科学基金会（DFG）以及德国联邦政府与州政府的卓越计划资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白A-琼脂糖 | Roche Group | 11 134 515 001 | 取决于抗体类别 |
| 蛋白G-琼脂糖 | Roche Group | 11 243 233 001 | 取决于抗体类别 |
| 抗高乙酰化H4抗体 | EMD Millipore | 06-946 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H4K5抗体 | EMD Millipore | 07-327 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H4K8抗体 | EMD Millipore | 07-328 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H4K12抗体 | EMD Millipore | 07-595 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H4K16抗体 | EMD Millipore | 07-329 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H4K18抗体 | EMD Millipore | 07-354 | 我们使用了1μL |
| 抗乙酰化H3K9抗体 | EMD Millipore | 07-352 | 我们使用了5μL |
| 抗乙酰化H3K14抗体 | EMD Millipore | 07-353 | 我们使用了1μL |
| 抗三甲基化H3K4抗体 | Diagenode | pAB-003-50 | 我们使用了5μL |
| 抗二甲基化H3K4抗体 | EMD Millipore | 07-030 | 我们使用了5μL |
| 抗单甲基化H3K4抗体 | Abcam | ab8895 | 2.5–10μL |
| 抗H3抗体 | Abcam | ab1791 | 我们使用了1μL以检测组蛋白密度 |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| 完全蛋白酶抑制剂 | Roche Group | 11836145001 |
参考文献
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