使用可变数目串联重复序列（VNTR）- 片段长度分析（FLA）对Mycobacterium leprae菌株进行DNA指纹图谱分析

摘要

由Mycobacterium leprae引起的麻风病在许多地区仍呈地方性流行。为了了解麻风病的传播方式和传播途径，确定患者感染的是哪种M. leprae菌株至关重要。可变数目串联重复序列（VNTR）分型即为此类方法之一。

摘要

由于麻风病的致病因子 Mycobacterium leprae无法在实验室中培养，因此研究其传播方式尤为困难。细菌的唯一来源是麻风病患者，以及实验感染的犰狳和裸鼠。因此，现代流行病学中常用的许多研究方法均不适用于麻风病的研究。尽管世界卫生组织（WHO）已实施了广泛的全球药物治疗计划¹，麻风病仍在许多国家呈地方性流行，每年约有25万例新发病例²。M. leprae的全基因组已被测序^3,4，并已鉴定出多个含有两个或以上碱基对重复片段的位点（称为微卫星和小卫星）⁵。临床分离的M. leprae菌株在多个此类位点上的串联重复片段数目（短串联重复序列，STR）可能存在差异^5,6,7。可变数目串联重复序列（VNTR）⁵分析已被用于区分不同麻风杆菌菌株。某些位点似乎比其他位点更稳定，重复次数变异较小，而另一些位点则变化较快，有时甚至在同一患者体内也会发生变化。尽管某些VNTR的变异性引发了关于其是否适用于菌株分型的争议^7,8,9，但新近的数据表明，分析多个在稳定性上具有差异的位点，可作为有价值的流行病学工具。多位点VNTR分析（MLVA）¹⁰已被用于研究包括中国^11,12、马拉维⁸、菲律宾^10,13和巴西¹⁴在内的多个国家的麻风病进化与传播。MLVA包含多个步骤：首先，从临床活检组织或皮肤刮片（SSS）中提取细菌DNA及宿主组织DNA¹⁰；然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标位点。每次反应使用针对4-5个不同位点的荧光标记引物，共四次反应可扩增18个位点¹⁰。PCR产物可经琼脂糖凝胶电泳检测，以确认目标DNA片段的存在，随后进行毛细管电泳荧光片段长度分析（FLA）。已知各重复位点拷贝数的犰狳传代细菌DNA被用作阳性对照。随后使用Peak Scanner软件分析FLA色谱图，并将片段长度转换为VNTR拷贝数（等位基因）。最后，分析VNTR单倍型的模式，结合患者的临床资料，可用于追踪菌株类型的分布情况。

方案

本视频文章旨在为刚开始从事此类研究的研究人员提供工作流程、数据格式及数据分析方法的概览（图1）。内容包括对已发表文献中所述技术、简化实验方案及实用操作技巧的演示。^5,10

常规工作流程与实验室设施：

此类研究应至少设有三个独立的工作区域。实验室应具备：1）一个用于引物制备（包括稀释、分装和混合）的PCR前操作区，配备PCR超净工作台（洁净空气箱或隔离工作区）；2）一个独立的生物安全柜，用于DNA的处理及向PCR反应体系中添加DNA；3）一个PCR后操作区，用于凝胶的制备与上样，以及为荧光扫描分析（FLA）准备样品。引物和DNA样品应分别存放在不同的冰箱和冷冻柜中。引物污染是此类实验室工作中最常见且最难解决的主要问题之一。用于引物和PCR反应体系的移液器严禁用于DNA操作。应在PCR前、PCR和PCR后操作区分别配备专用的移液器。通常情况下，一名研究人员使用标准实验室设备可在12至24小时内处理12至18个样品。

开始每个工作阶段之前：

• 穿戴实验服和手套。在处理生物样本、引物、DNA 和溴化乙锭时均应佩戴手套。频繁更换手套。
• 在 PCR 柜、生物安全柜或洁净工作区域中操作。
• 使用新的实验台纸或垫子。
• 设置适用于液体和移液器吸头的废弃物容器。
• 使用 70% 乙醇擦拭 PCR 柜内部和移液器。
• 在进行 PCR 体系构建前，将移液器和工作区域暴露于紫外灯下照射 15 分钟。（紫外线可使表面的 DNA 污染物发生交联。）
• 对于含有 DNA、引物和 PCR 试剂的材料，务必使用防气溶胶移液器吸头。
• 在打开任何含有液体的离心管、排管或板之前，先进行离心，以防止气溶胶逸出及因操作引起的交叉污染。

1. M. leprae DNA 提取

含有M. leprae的临床样本来自就诊于皮肤科门诊的麻风病患者。常规诊断样本可能包括皮肤钻孔活检、刮片皮肤涂片或鼻拭子。通常，钻孔活检或刮片皮肤涂片最适合用于分子流行病学研究，因为这些样本较为洁净且含有足量的M. leprae。使用这些材料进行研究必须根据机构指南获得批准。

1. 将活检或裂隙皮肤涂片样本保存在带有螺旋盖的小瓶中，加入1 ml 70%乙醇。
2. 在可调速台式离心机中以12,000 × g离心每个样本15分钟。
3. 移除上清液并转移至微量离心管中。如有需要，可对这些样本重新离心，以便后续回收更多组织或DNA。
4. 向组织样本中加入500 μl磷酸盐缓冲液（PBS），浸泡1小时，以置换残留的乙醇保存液并使样本重新水化。
5. 在台式离心机中以12,000 × g离心样本20分钟。将PBS溶液弃入部分装有消毒液的废液容器中。
6. 按照说明书使用Qiagen DNEasy Blood and Tissue试剂盒提取细菌DNA。
7. 提取的DNA应分装至4个小瓶中。若需重复验证检测结果或未来出现新技术时，可将其中两份分装样本储存于-80°C；另取一份储存于-20°C，一份储存于4°C，以备近期使用。
8. 建议在处理组织样本的同时制备一个“提取空白对照”。该空白对照需经历上述所有相同处理步骤，但不加入组织。将提取空白对照与患者样本一同进行PCR扩增，以确保操作者的提取技术正确且试剂无DNA污染。

2. 引物制备

1. 针对具有最广泛菌株分型数据的基因座，其引物列于表1中。四个或五个引物组合用于多重PCR。每个基因座的一条引物带有5'端荧光化学标记，可在毛细管电泳片段长度分析（FLA）过程中被检测。
2. 对于每种多重PCR组合，各基因座的标记引物及其对应的反向引物分别置于不同的Eppendorf管中：正向引物置于一管，反向引物置于另一管。储备引物配制成100 μM的溶液（图2a），取部分稀释10倍，得到浓度为10 μM的溶液，稀释液使用TE缓冲液（1× Tris-EDTA，pH 8.0）。剩余的100 μM引物溶液分装后储存于-20°C，以备后续使用。
3. 将等量的各10 μM引物混合，得到每种引物终浓度为2 μM的混合液。当这些引物组合加入PCR反应体系（表3）时，每种引物的终浓度降至0.2 μM。

当将混合引物加入PCR反应体系(表3)时，每种引物的终浓度降至0.2μM。

3. 使用多重 PCR 扩增细菌 DNA

1. PCR 准备
   • 记录将要使用的样本数量，并在收集必要的耗材和其他材料之前，准备好包含所需试剂及其体积的工作表。
   • 用样本编号标记将用于 PCR 的无菌管/条带/板。请记得包括阳性和阴性对照。
2. 使用清洁溶液（如 Decon ELIMINase）擦拭热循环仪，并根据 表 2 对其进行程序设置。在清洁后以及接触引物和其他试剂前更换手套。
3. 根据 表 3 配制 PCR 总反应混合液（Mastermix），并用将要使用的引物组合和样本编号标记 PCR 管/条带/板。
4. 将 18 μl 的总反应混合液分装至每个已标记的 PCR 样本管或孔中。更换手套。
5. 使用 70% 乙醇擦拭独立的生物安全柜和移液器，以清洁和消毒工作区域及工具，然后将工作区域和移液器暴露于紫外光下 15 分钟，以交联任何可能存在的 DNA 污染物。更换手套。
6. 在洁净的生物安全柜内，向每个 PCR 管/板孔中的总反应混合液中加入 2 μl 的 DNA 模板，使总体积达到 20 μl （图 2b）。所有液体操作均应使用防气溶胶移液吸头。
7. 短暂离心 PCR 管/条带/板以混匀内容物。
8. 将样本管/条带/板放入热循环仪中，并启动 PCR 程序。
9. 程序完成后，从热循环仪中取出产物，并于 4°C 保存直至进行电泳分析。

4. PCR 产物的凝胶电泳

*该方案多年来已成为标准操作，如果希望在将PCR产物送测序前对其进行确认，可选择执行此步骤。

1. 在独立的PCR后操作区域中，制备2%琼脂糖凝胶。取2.0 g琼脂糖粉末溶于100 ml 1×TBE（Tris/硼酸/EDTA）缓冲液中，置于烧瓶内，在微波炉中加热约1.5–2分钟。摇匀内容物，必要时再次加热至琼脂糖完全溶解。稍作冷却后，使用带有足够加样孔的梳子倒入模具中制胶。
2. 将PCR产物从4°C取出，离心约30秒。
3. 取2–5 μl PCR产物与0.5–1 μl的5×或6×凝胶上样缓冲液混合（上样缓冲液可从多家公司购买，也可在实验室自行配制，相关配方可在线获取）。
4. 将6 μl的样品与上样缓冲液混合物加入凝胶加样孔中，并在其中一个孔中加入DNA分子量标准（建议使用20 bp DNA ladder）。
5. 以100 V电压电泳约90分钟。
6. 将凝胶浸入溴化乙锭溶液中15–30分钟，随后再浸入超纯蒸馏水中相同时间。
7. 在紫外光照射下成像凝胶。预期在组合产物中可见对应于4–5个DNA片段的条带（图3）。
8. 根据所在机构的危险品处理政策妥善处置凝胶。溴化乙锭溶液可在适当处理前重复使用多次。

5. 准备片段长度分析（FLA）样品

1. 在洁净的 Eppendorf 管中，为每个待测样本配制主混合液，其中包含来自新分装的 12μl Hi-Di 甲酰胺溶液和 0.3μl GeneScan -500 LIZ 片段大小标准品（均来自 Applied BioSystems）。（Hi-Di 甲酰胺可在毛细管电泳前使 DNA 链发生化学变性，无需加热处理。）使用 96 孔光学级反应板，将 12.3μl 甲酰胺-LIZ 混合液分装至每个用于样本的孔中，并将该板暂置一旁。
2. 制作板图以供记录，标明每个孔中所对应的 DNA 样本（图 4a）。
3. 使用离心管/排管或 96 孔板，将 1μl PCR 产物（来自 第 3 部分）加入 59μl PCR 级水中，使 PCR 产物稀释至 1:60。可根据 FLA 数据的信号强度或凝胶条带的亮度调整稀释比例。甚至更低的 DNA 浓度也可能足够（如 1:120 或 1:180）。
4. 将 1μl 稀释后的 PCR 产物加入含有甲酰胺-LIZ 混合液的对应孔中。
5. 若 PCR 扩增也使用 96 孔板进行，则可显著提高操作速度与效率。可将三块板依次排列：第 1 块板盛放 PCR 产物，第 2 块板盛放无菌水用于 PCR 产物稀释，第 3 块板盛放甲酰胺和片段大小标记物用于片段长度分析。使用多通道移液器可快速完成 FLA 样本的制备。

通过基因分析仪进行样本分析

6. 根据制造商的说明校准遗传分析仪，以检测所使用的荧光染料。务必使用包含LIZ的染料组。
7. 补充去离子水清洗容器，并向缓冲液室中加入新的含EDTA运行缓冲液（1x）（Applied BioSystems）。
8. 在板上安装预切硅胶垫片，并将板放入指定的托盘中。按下遗传分析仪上的“Tray”按钮，使自动进样器移出。将托盘放入自动进样器中，并关闭分析仪门。
9. 创建或导入用于分析的电子表格。可导入的文件具有.plt扩展名，采用制表符分隔格式。这些文件可在Excel（Microsoft）或类似程序中进行修改。
10. 通过施加1.6 kV电压持续15秒，将样品注入毛细管（50 cm长，POP-7聚合物）。毛细管电泳在15 kV电压、60°C条件下运行1800秒。整个过程约需45分钟。
11. 运行完成后，每个样本的数据将被转换为具有.fsa扩展名的文件，并存入对应的板文件夹中（图4b）。每个数据文件大小约为100 kB，可存储在U盘上，或压缩后通过电子邮件发送。可使用合适的软件（如ABI的GeneMapper或Peak Scanner）查看数据文件。

6. 片段长度结果分析

1. 荧光毛细管电泳的数据分析需要专用软件。如果无法获取此类软件，请访问 Applied BioSystems 网站并下载 Peak Scanner。该软件免费且运行效果良好。https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. 打开 Peak Scanner，选择“新建项目”（Start New Project），然后点击“添加文件”（Add Files）。将选定的 .fsa 数据文件（包括阳性和阴性对照）载入程序中。
3. 选择（高亮）所有已加载的文件并进行“分析”（analyze）。确保每个样本的设置为“Size Standard: GS500(-250)”以及“Analysis Method: Sizing Default-pp”，然后点击“Analyze”。
4. 检查各样本中DNA片段产生的各彩色峰的碱基对大小。
5. 记录每个峰的碱基对大小数值，并与阳性对照峰进行比较。
6. 阳性对照样本中的峰应与表4-7中列出的碱基对数目及相应的串联重复次数相符。
7. 通过与阳性对照比较，确定每个样本等位基因中包含的短串联重复片段数量。我们使用NHDP63作为参照，该菌株在各检测位点上的VNTR拷贝数已测序确定。⁴
8. 将记录的数据输入电子表格，用于比较和/或数学分析。VNTR“指纹图谱”或单倍型，是指在特定基因座上的一组等位基因组合，可作为M. leprae菌株的特征性标志。

7. 代表性结果

PCR产物的凝胶电泳有望在每对引物组合中产生对应于每个位点的一条条带（图3）。在图3中，凝胶分为两个区域：上半部分为引物组合1的PCR样本，下半部分为引物组合2的样本。每个区域均包含一个20碱基对的分子量标记，随后是来自8个患者样本的PCR产物。组合1还包括一个阴性对照和一个阳性对照（NHDP63菌株）。（组合2的对照位于另一块凝胶上。）请注意，大多数样本清晰地显示出5条条带，每条对应组合中的一个位点。在某些情况下，条带之间的距离可能过近，无法分辨为独立的位点，因而仅呈现出4条条带。

预期扩增片段大小见表1。本实验室使用M. leprae的NHDP63菌株作为阳性对照。已研究的两种重复序列片段类型包括：微卫星位点（含1-5个碱基重复）和小卫星位点（含大于5个碱基对的片段多次重复）。⁵

毛细管电泳数据文件的解读依赖于两个标准：一种称为 GeneScan -500LIZ（ABI）的内部 DNA 片段大小标记标准，以及一种扩增细菌 DNA 的外部阳性对照样本。

使用 Peak Scanner 软件查看的 FLA 色谱图如图 5a、5b 和 6所示。

Peak Scanner 提供扩增子大小（横轴，单位为碱基对）和信号强度（纵轴）的数据。（图5b） 还可获得峰面积等其他数据，但大小和峰高值最为重要。峰高低于100单位的信号通常被认为太弱，不可靠。

图6比较了阳性对照（NHDP63）和两个患者样本，显示在(GTA)9位点串联重复次数的差异。在阳性对照中，序列(GTA)重复了10次。NHDP63的VNTR及扩增子大小已通过基因测序验证。患者4的PCR扩增子比阳性对照小3 bp，表明其仅有9个重复单位；而患者6的扩增子比NHDP63大3 bp，提示存在11个(GTA)重复。患者2的细菌指数（BI）较低，几乎无或完全没有DNA的PCR扩增，因此未检测到FLA信号。

FLA 数据解读有时会因“ stuttering”（滑移）现象而变得困难。在 PCR 反应过程中，DNA 聚合酶可能产生比原始等位基因长或短一个或多个重复单位的片段。这些片段通常表现为围绕主峰、高度较低的峰，且位于“阶梯”上，即其重复片段的碱基对数目比主峰多或少正确的重复单位数。其结果是出现一组相同颜色的峰。图7展示了位点 (TA)10 的这种情况。

FLA 有时遇到的另一个困难是“+A”或“A加尾”现象，即 DNA 聚合酶在复制的 DNA 片段的 3' 端添加一个单碱基（通常为腺嘌呤（A））。在 FLA 图谱中，这种现象表现为位于主峰或影子峰右侧的一个峰，其大小比相邻峰大 1 个碱基对，如图 8所示。该峰不应与主峰或影子峰混淆。主峰及其 A 加尾被视为单一物种。A 加尾不会改变 VNTR 重复次数。（某些 DNA 聚合酶试剂盒专门设计用于促进 A 加尾，以减少这种干扰效应。完全促进 A 加尾通常会产生单一峰，而非成对峰。）

M. leprae 和人类 DNA 均存在于 DNA 提取物和 PCR 产物中，但除 (TA)18 外，其余引物的特异性足够高，仅扩增细菌 DNA，几乎不扩增或完全不扩增人类 DNA。(TA)18 常在 242 个碱基对处产生一个来自人类 DNA 的峰，该峰在犰狳传代的 DNA 样本中未见（图 9）。

引物的保质期通常较长，前提是将其保存在 -20°C 环境中，仅在需要时取出使用，随后在用完之前存放于 4°C。引物在 4°C 条件下可稳定保存 1 至 2 周。尽管配制用于 PCR 的引物混合物较为耗时，但仍建议仅制备即时使用的量。引物混合物若长期储存，似乎会出现一定程度的降解。

应从大体积储存液中分装TE缓冲液，分装后的 aliquot 可冷冻保存或室温保存。200–400 μl 的较大分装体积适用于稀释干燥或浓缩的引物储存液（图2a）。10–50 μl 的较小分装体积则适用于补充引物组合3和4的体积。TE缓冲液成本较低，使用后应将分装液弃去。

多重酶试剂盒价格较贵，应保存在冷冻条件（-20°C）下直至使用。PCR 准备完成后，任何未使用的多重溶液应立即放回 4°C 保存。Qiagen 小规格多重 PCR 试剂盒包含 3 管多重混合液，每管含有 0.85 ml（850 μl）溶液，足够进行约 65–70 次 PCR 反应。

通常，对于此类实验所用的材料，包括DNA样本、引物和多重扩增试剂盒溶液，应避免反复经历较大的温度变化。所有材料应在使用前保存于-20°C，使用时置于4°C直至用完。DNA的长期保存应置于-80°C。

所有含有废弃组织、引物和/或DNA的材料在不再使用时应进行高压灭菌处理并妥善处置。所有经溴化乙锭或甲酰胺处理的样品应视为有害废物，并按照机构的危险品管理政策进行处置。

表 1：NHDP63菌株的扩增子大小

表 2： VNTR PCR 的循环参数

表 3： PCR反应体系的配制

表 4： 组合1的等位基因判定结果

表 5：组合 2 的等位基因判定

表 6：组合 3 的等位基因检出结果

表 7： 组合4的等位基因检出结果

图1：VNTR-FLA 流程图

图2. (a) 组合1上引物的制备（Eppendorf管图片由...提供） www.clker.com）。(b) PCR 反应体系配置（进行 8 个 PCR 反应）（Eppendorf 管图片由 www.clker.com 提供）

图3．组合1和2 VNTR PCR产物DNA的琼脂糖凝胶电泳图

图 4. (a) FLA 96孔板布局图。 (b) FLA 数据文件：*.fsa

图5. (a) 组合1 VNTR位点的阳性对照（NHDP63）FLA色谱图。(b) Peak Scanner 对(GTA)9扩增子大小与丰度的分析结果

图6。PCR样本与位点（GTA）9的阳性对照（NHDP63）的比较

图7. (TA)10的主峰与影子峰

图8：位于主峰或stutter峰旁的+A（A尾）峰。

图9：(TA)18主峰、影子峰与人类DNA峰

图10：(A) 基于VNTR数据的M. leprae菌株区分。(B) 基于MLVA DNA指纹图谱的M. leprae菌株区分

讨论

从麻风病患者身上采集皮肤样本需要在皮肤科诊所工作的熟练临床医生或技术人员。处理这些样本的实验室工作人员必须格外注意，穿戴实验服、手套和护目镜，并在处理感染的人体或犰狳组织样本时于生物安全柜内操作。对实验台面和工具进行消毒也至关重要。在洁净、无菌的生物安全柜中工作对于避免DNA样本污染具有重要意义。

由于Qiagen等公司开发的提取试剂盒，DNA提取已变得相对容易。必须仔细遵循说明书操作。所有样品在不使用时应保持低温。避免样品经历反复的剧烈温度变化。

本研究所用的DNA引物可从本文末尾参考文献列表中引用的多家公司订购。为避免污染，操作引物时应确保在无DNA的环境中进行。引物通常以干粉形式提供，需用TE缓冲液溶解并稀释至100μM浓度，然后分装为较小体积（图2a）。引物的工作液进一步稀释至10μM浓度。同样，切勿在使用或配制引物的区域或通风橱内使用DNA样品。

不使用时，PCR 产物也应保持低温保存。

3%的琼脂糖凝胶制备可获得更好的DNA条带分离效果，但电泳时间较长。若仅用于定性分析，通常2%的凝胶已足够。用于琼脂糖凝胶中DNA染色的溴化乙锭溶液是一种可通过皮肤吸收的强效基因毒素。操作该溶液及用其染色的凝胶时必须格外小心，并始终佩戴手套。处理任何DNA样品或含溴化乙锭的材料后，应彻底洗手。溴化乙锭染色液、洗涤液及凝胶应按照所在机构的规定进行处置。凝胶电泳步骤并非常规必需；一旦建立FLA方法，此步骤即可省略，因其耗时且消耗试剂。

在FLA样品制备过程中使用的甲酰胺溶液具有高毒性，应小心操作。使用后需洗手，并按照所在机构的指南进行废弃处理。

使用 Peak Scanner 软件读取荧光片段分析（FLA）结果可能具有挑战性。科罗拉多州立大学（CSU）已建立了一套基本的等位基因判读标准（串联重复次数）（表4-7）。需要注意的是，表4-7 所列范围可能并不完全涵盖所有情况。随着对其他 M. leprae 菌株的研究，可能会发现拷贝数超出表中所列范围的等位基因。其中一个特别的挑战是“影子峰”（stutter peaks）。这类峰通常表现为一系列峰簇，尤其常见于仅包含2-3个碱基对重复的短串联重复序列（STR），例如(TA)10。有时难以确定应读取哪一个峰（图7）。在该图中，阳性对照在190 bp处的峰为主峰；比主峰低、且长度比主峰大或小2、4甚至6个碱基对的峰被称为“影子峰”。A加尾（A-tailing）也可能造成判读困难，其现象在正文前文及图8中已有描述。最后，若PCR产物在样本中含量过高，峰形可能出现双峰现象。此时应以峰形的中心位置进行判读（参见图6，患者6）。

对于此类工作而言，数据管理可能是一项艰巨的任务。记录所有实验的相关信息至关重要，例如：操作或实验步骤的日期、操作人员、条带/孔板布局图、荧光分析（FLA）订单、PCR 条件与配方、凝胶及照片的拍摄日期、储存温度、DNA 模板稀释倍数、FLA 电子文件的存储位置等。良好的组织与数据管理能够节省未来查找特定信息所需的大量时间。

本文所述的实验室工作已在科罗拉多州立大学及全球其他多个地点持续开展了数年。所有收集数据的整体意义及其未来可能的应用价值正逐渐显现。图10A和10B展示了这些DNA指纹如何用于区分不同国家之间的M. leprae菌株（10A），甚至区分不同家庭之间的菌株（10B）。已有研究表明，与家庭和社区相关的病例携带的M. leprae具有相似或相同的VNTR菌株类型。人们希望，未来可能进一步揭示麻风病传播途径的机制，从而为高风险人群建立传播网络的早期检测系统，并在发生永久性神经和皮肤损伤之前启动治愈性药物治疗。