转染和核转染人诱导性多能干细胞

摘要

尽管基因修饰技术已取得近期进展，人类胚胎干细胞（HESCs）的转染仍是一个不稳定的过程。据我们所知，目前尚未有报道关于系统性且高效转染人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。本文中，我们描述了高效转染和核转染人类iPSCs的可靠方案。

摘要

基因改造技术在干细胞生物学研究以及人类胚胎干细胞（HESCs）潜在临床应用的探索中，持续发挥着关键作用¹。尽管已有多种基因递送方法得到改进^2-9，但转染对HESCs而言仍是一个不稳定的过程，而在人类诱导性多能干细胞（iPSCs）中，尚无转染成功的报道。在本视频中，我们展示了本实验室如何常规使用携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的质粒对人类iPSCs进行转染和核转染。人类iPSCs以无饲养层条件培养并维持，以避免饲养细胞被转染，并在转染后高效筛选出稳定的转基因iPSC克隆。在核转染过程中，人类iPSCs首先用ROCK抑制剂预处理¹¹，经胰蛋白酶消化形成小细胞团块，随后进行核转染，并接种于饲养细胞条件培养基中的饲养层上，以提高细胞复苏效率。转染后6小时即可获得表达外源基因的人类iPSCs。抗生素筛选在24小时后开始，稳定的转基因细胞系通常在1周内出现。本实验方案稳定且可重复，适用于人类iPSC系，且不会改变这些细胞的多能性。

方案

本方案首先介绍将人iPSCs适应于无饲养层培养的方法，随后介绍使用GeneJuice（EMD）转染人iPSCs以及利用AMAXA核转染仪对人iPSCs进行核转染的实验步骤。

注意：以下操作均在无菌超净工作台中进行。所有培养基和溶液在使用前均需平衡至37°C或室温，除非另有说明。

1. 在无饲养层系统中建立人诱导多能干细胞

先前在饲养细胞上维持培养的人iPSCs可在传代后转移至Geltrex包被的培养皿中，并在无饲养细胞条件下继续培养两代，随后进行无饲养层转染。

1. 在4°C下过夜解冻Geltrex。为制备Geltrex包被，将解冻后的Geltrex用冷DMEM按1:50稀释。轻柔混匀溶液。

注意：Geltrex 与 Matrigel 类似，是一种从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤细胞中纯化的基底膜基质的可溶性形式。此外，Matrigel 也可用作细胞外基质，以建立无饲养层的人诱导多能干细胞（iPSC）培养体系。

2. 用Geltrex溶液覆盖培养孔的整个表面（35 mm孔使用1 ml）。在37°C培养箱中孵育1小时以完成Geltrex包被。
3. 传代人iPSC时，每孔加入1 ml的accutase，于37°C孵育1分钟，直至大多数细胞开始脱落。

传代人iPSC时，每孔加入1 ml的Accutase，于37°C孵育1分钟，直至大多数细胞开始脱落。

4. 向细胞中加入10-15粒玻璃珠，轻轻晃动培养板。加入2 ml KnockOut DMEM/F12培养基，轻轻吹打混匀。将细胞悬液转移至10 ml离心管中。
5. 在室温下以800 rpm离心3分钟。
6. 吸除上清液，保留完整的人类iPSC细胞沉淀。轻轻弹击离心管使细胞沉淀重新分散。
7. 移除包被孔中的Geltrex。
8. 用适当体积的STEMPRO培养基轻柔重悬人类iPSC细胞沉淀，根据增殖速率将其分配至饲养层的各孔中。人类iPSC细胞传代时可采用1:2至1:6的分种比例。
9. 小心放入5% CO₂培养箱中，轻柔晃动培养板以确保细胞在各孔中均匀分布。
10. 每天换液，直至细胞准备再次传代（当细胞融合度达到80%时）。
11. 以1:2的分种比例将人类iPSC细胞传代至新的Geltrex包被孔中（重复步骤1.3至1.9）。转染前，应在Geltrex包被孔上形成大小适中的克隆并均匀分布。

2. 使用 GeneJuice 转染人iPSCs

转染当天，细胞（在6孔板中培养）的融合度应约为40–50%，以达到最佳转染效率。在次日之前无需更换细胞培养基。

1. 在无菌的1.5 ml离心管中准备100 μl KO-DMEM/F12。加入27 μl GeneJuice转染试剂，充分混匀。室温孵育5分钟。
2. 加入4 μg质粒DNA，室温孵育15分钟。质粒的选择对获得最佳转染效率至关重要。我们使用由CAG启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达的质粒⁵（pCAG-eGFP）。CAG启动子是一种强启动子，在人诱导多能干细胞（iPSCs）中具有转录活性，因此可用于驱动这些细胞中外源基因的表达。据我们观察，质粒线性化似乎不影响转染效率。
3. 将GeneJuice-DNA混合物加入细胞中并轻轻摇晃培养板。以1200 rpm离心5分钟（“旋转感染”法），以增加转染混合物与孔中人iPSCs的接触。
4. 将细胞在37°C下孵育过夜。
5. 次日观察转染效率。
6. 对于稳定转染，次日更换为新鲜的STEMPRO培养基，并在24–48小时后加入适当的抗生素进行筛选。

3. 人类iPSC的核转染

在饲养层或Geltrex上培养的人iPSC可用于核转染。然而，我们强烈建议将核转染后的人iPSC重铺至小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或人包皮成纤维细胞（HFF）饲养层上，以确保较高的细胞存活率和恢复能力。为在核转染后获得更高的细胞存活率，应使用至少200万个细胞。

1. 通过将人iPSC KnockOut血清替代物（KOSR）培养基与饲养细胞共同孵育过夜，制备饲养细胞条件培养基（CM）。每24小时收集一次CM。

注意：用于制备饲养层的任何小鼠品系（如 BLK6、CF1 和 MF1）均适用于制备条件培养基（CM）。

2. 在核转染当天，用 10 μM ROCK 抑制剂预处理人 iPSC 至少 1 小时。
3. 在无菌 1.5 ml 离心管中准备 82 μl 人干细胞核转染溶液，加入 18 μl 辅助剂 1，充分混匀。将溶液在 37°C 下孵育 5 分钟。
4. 将饲养细胞条件培养基（CM）和 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 预热至 37°C。在生物安全柜内，预先标记一个无菌 15 ml 锥形离心管。
5. 小心移除待进行核转染的人 iPSC 培养皿中的培养基。每孔用 2 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞，吸除 PBS。每孔加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶，37°C 孵育 3 分钟。
6. 用 1000 μl 移液枪头轻柔吹打细胞，冲洗孔底以确保所有人 iPSC 完全脱落。将细胞悬液转移至已标记的 15 ml 锥形离心管中。

注意：应严格避免将细胞消化成单细胞。细胞仅需被分离成由大约三个细胞组成的细胞小团。在后续细胞操作过程中，这些细胞小团（细胞三联体）将被进一步解离为单细胞。

7. 加入 9 ml MEF 培养基以灭活胰蛋白酶。以 800 rpm 离心 3 分钟。小心吸除上清液，保留细胞沉淀完整。
8. 用步骤 3.3 中预热的 100 μl 人干细胞核转染溶液重悬细胞。
9. 使用 1 ml 移液枪头将细胞转移至核转染杯中。
10. 向核转染杯中的细胞悬液加入 4 μg 质粒 DNA。轻轻旋转混匀细胞与 DNA。在生物安全柜台面上轻敲核转染杯两次。
11. 将核转染杯插入核转染仪的插槽中。选择程序 B-016，按下按钮 X 开始核转染。

当核转染过程完成时，将显示<>（通常仅需1-5秒）。使用其他核转染程序（A-023、A-033和U-023）从人iPSCs获得的eGFP阳性细胞比例低于10%。

12. 使用提供的塑料巴斯德吸管从电穿孔杯中取出转染后的细胞。将细胞重悬于预热的CM培养基和ROCK抑制剂中，转移至无菌的1.5 ml离心管。于37°C孵育10分钟，使细胞恢复。
13. 用1 ml移液枪头将细胞逐滴接种至饲养层上。于37°C过夜孵育细胞。
14. 次日观察转染效率。如需获得稳定表达外源基因的转基因人iPSC稳定克隆，于次日更换为含CM培养基和ROCK抑制剂的新鲜培养基，并在24–48小时后加入适当的抗生素进行筛选。

4. 代表性结果：

图1. 使用 pCAG-eGFP 转染的 Riv1 人诱导多能干细胞的显微照片。（A）转染后 12 小时，在 Geltrex 上使用 GeneJuice 转染的表达 eGFP 的 Riv1 细胞。经核转染后，Riv1 人诱导多能干细胞在饲养层上接种并形成克隆，使用的程序分别为 B-016（B）和 A-023（C）。（D）通过 GeneJuice 获得的稳定表达 eGFP 的人诱导多能干细胞克隆，显示广泛性 eGFP 表达。（E）稳定转染的 Riv1 人诱导多能干细胞在拟胚体分化过程中维持组成型 eGFP 表达。

讨论

我们的实验方案能够以简单、稳健且高度可重复的技术将外源基因导入人iPSC中，且无明显毒性作用和细胞死亡。人iPSC应以较小的细胞团块（5–10个细胞）传代，并以高密度（1:2）接种于Geltrex基质上，以确保在大量小克隆中实现最佳转染效率。对于更容易发生分化和细胞死亡的人iPSC细胞系，单次核转染实验应使用更多数量的人iPSC（最多4 × 10⁶个细胞）。瞬时转染实验可在1天内产生大量表达外源基因的人iPSC。稳定转染的iPSC克隆通常在7天内出现，这些转基因克隆应在三周内准备好进行挑取。此处所述的CAG启动子可确保eGFP报告基因的广泛表达。通过这些改进，本实验方案可进一步应用于其他研究领域，包括基因过表达、条件性诱导、谱系特异性报告细胞系的建立、shRNA或siRNA介导的基因沉默、基因靶向以及同源重组。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶含 EDTA	Invitrogen	25200056
2-巯基–乙醇	Invitrogen	21985-023
3 mm 玻璃珠	Fisher Scientific	11-312A	玻璃珠应使用盐酸（HCl）浸泡过夜，再用氢氧化钠（NaOH）和蒸馏水冲洗，并在使用前通过高压灭菌进行消毒。
Accutase 细胞解离试剂	Invitrogen	A11105-01
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Invitrogen	PHG0263
DMEM（高糖）	Lonza Inc.	12-741 F
胎牛血清	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	生长因子减少型
GeneJuice 转染试剂	EMD Millipore	70967
Glutamax-I（100X）	Invitrogen	35050061	也可使用 L-谷氨酰胺（Invitrogen，25030081）替代。
人诱导多能干细胞 KOSR 培养基			500 ml 人胚胎干细胞培养基包含 390 ml KnockOut DMEM/F12、100 ml KnockOut 血清替代物、5 ml Glutamax-I（100X）、5 ml NEAA（100X）、500 μl 2-巯基–乙醇（55 mM），并补充 10 ng/ml bFGF。
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
KnockOut 血清替代物（KOSR）	Invitrogen	10828-028
小鼠胚胎成纤维细胞培养基			MEF 培养基由 90% FBS、1X NEAA、1X Glutamax-I 和 1X 丙酮酸钠组成，溶剂为 DMEM（高糖）
非必需氨基酸 NEAA（100X）	Invitrogen	11140050
人干细胞核转染溶液 1 及其补充剂	Lonza Inc.	VAPH-5012
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液	Invitrogen	10010023
丙酮酸钠（100X）	Invitrogen	11360070
STEMPRO 培养基试剂盒	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO 培养基包含 454 ml KnockOut DMEM/F12、10 ml STEMPRO 无血清生长补充剂（50X）、5 ml Glutamax-I（100X）、5 ml NEAA（100X）、36 ml BSA（牛血清白蛋白，25%）、909 μl 2-巯基–乙醇（55 mM），并补充 10 ng/ml bFGF。