本文描述了一种利用与旋转盘显微镜耦合的光镊对活体病原体进行单独选择、操控和成像的方法。光镊可对生物体实现空间和时间上的精确控制，并将其定位在宿主细胞附近。荧光显微镜则能够在对细胞干扰最小的情况下，捕捉动态的细胞间相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
动态活细胞成像技术可直接可视化免疫系统细胞间实时相互作用1, 2；然而，吞噬细胞与微生物之间缺乏空间和时间上的精确控制，使得对宿主免疫应答初始阶段的聚焦观察变得困难。传统上，诸如吞噬作用3等细胞间接触事件通常通过混合两种细胞类型，随后持续扫描视野，以期偶然捕获处于合适相互作用阶段的细胞间接触。由于此类事件具有随机性，该方法极为繁琐，且难以通过此途径观察到细胞间接触的早期或短暂事件。该方法依赖于寻找即将发生接触的细胞对，并持续观察直至其完成接触或未发生接触。为克服这些局限，我们采用光镊技术作为一种非侵入性、非破坏性但快速且有效的方法，用于在培养环境中精确操控细胞位置。
光阱或光镊在生物研究中正被越来越多地用于捕获和三维操控细胞及其他微米级颗粒4。辐射压于1970年首次被观察到并应用于光镊系统5, 6，并于1987年首次用于操控生物样本7。自那时起，光镊已发展成为一种用于探究多种生物现象的技术8-13。
我们描述了一种方法14 通过将光镊与旋转盘共聚焦显微镜结合，并集成温度和湿度控制，可在生理环境中对病原体实现精细的空间和时间操控，从而促进其与宿主细胞的相互作用，具体操作由实验人员设定。活体病原体如 白色念珠菌 和 Aspergillus fumigatus，可能在免疫功能低下个体中引起潜在致命的侵袭性感染15, 16 (例如 艾滋病、化疗及器官移植患者），使用非破坏性激光强度进行光镊捕获，并移动至巨噬细胞附近，以便巨噬细胞吞噬病原体。高分辨率的透射光及基于荧光的动态影像证实了在活细胞中观察吞噬作用早期事件的能力。为展示该技术在免疫学中的广泛适用性，还对原代T细胞进行了光镊捕获与操控，使其与包被抗CD3的微球形成免疫突触。 体内，并获得了突触形成的延时成像。通过提供一种对活体病原体相对于免疫细胞进行精细空间控制的方法，可在对细胞干扰最小的情况下，利用荧光显微镜捕捉细胞间的相互作用，从而深入揭示先天免疫与适应性免疫的早期应答过程。
方案
1. 光学捕获病原体的培养条件
- 在含有SBD（沙氏葡萄糖琼脂）的固体培养基上，于30°C培养A. fumigatus（B-5233/RGD12-8）3天。
- 在含有100 μg/mL氨苄青霉素的YPD（酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖）液体培养基中，于30°C摇床培养箱中过夜培养C. albicans（SC5314）。
2. 荧光标记病原体的制备
- 收集所需数量的病原体，并转移至1.5 mL离心管中。
- 向离心管中加入300 μL磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 将混合物超声处理30秒。
- 以4000 rpm离心1分钟。
- 吸除上清液，保留沉淀物不受扰动。
- 重复步骤（2.4）和（2.5）两次。
- 用500 μL PBS重悬沉淀。
3. 用荧光染料标记病原体
- 将1 mg目标染料（例如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647）溶解于100 μL二甲基甲酰胺（DMF）中（浓度为10 mg/mL）。
- 向含有已洗涤病原体的反应管中加入3 μL染料混合物。
- 在37°C下旋转或振荡样品1小时。
- 用PBS洗涤样品....
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讨论
在本研究中，我们使用光镊捕获尺寸在 3 μm - 5 μm 之间的病原体。尽管本实验室关注的病原体通常具有此类尺寸，但本文所述的光镊系统具有灵活性，可捕获多种不同尺寸的微粒。事实上，光镊已被用于捕获从单个原子到直径约 10 μm 的细胞在内的各种尺寸的微粒。此外，该光镊系统能够捕获多种形状的微粒，包括球形、椭圆形以及高度细长的微粒，这在处理生物病原体时具有重要应用价值。
通过该方法，实时研究了吞噬作用和突触形成，并分析了细胞表面的结构变化。通过将颗粒放置在细胞附近，可对活的病原体进行控制和操纵，以激活吞噬机制，研究活细胞中的免疫反应，并监测从事件绝对起始到吞噬全过程的每一个阶段。因此，可以精确测量吞噬事件及其机制的完整演化过程。我们观察了当A. fumigatus作为病原体被放置于巨噬细胞附近时，巨噬细胞对其的吞噬过程，并记录了颗粒被吞噬时细胞膜的初始变化。通过控制病原体放置的时间点，我们能够精确测定该过程的完整时间进程。该技术还被进一步应用于观察原代T细胞的突触形成。利用光镊将一个T细胞移动至包被抗CD3抗体的微球附近，即可实时观察突触的形成过程。
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致谢
本工作得到了麻省总医院内科内部基金（J.M.T.、M.K.M.、M.L.C.、J.M.V.）、美国国立生物医学成像与生物工程研究所资助号 T32EB006348（C.E.C.）、麻省总医院计算与整合生物学中心发展基金及 AI062773（R.J.H.）、资助号 AI062773、DK83756 和 DK043351（R.J.X.）、美国国家科学基金会 0643745（M.J.L.）、美国国立卫生研究院（NIH）R21CA133576（M.J.L.），以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏与传染病研究所（NIAID）AI057999（J.M.V.）的支持。我们感谢 Nicholas C. Yoder 提供的有益讨论，以及 Charles Felts（RPI, Inc.）提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A. fumigatus | 白化菌株 B-5233/RGD12-8，由 NIH 的 K.J. Kwon-Chung 惠赠 | ||
| C. albicans | SSY50-B 突变株，由 MGH 的 Eleftherios Mylonakis 惠赠；SC5314 菌株，由 Whitehead 研究所的 Gerald Fink 惠赠 | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| 二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| 新鲜血液 | 由 MGH、HMS 的 R.J.W. Heath 惠赠 | ||
| 尼康倒置显微镜 | 尼康仪器公司 | 型号 Ti-E | |
| 捕获激光器 ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| 荧光激发激光器 | Coherent 公司 | 型号 Innova 70C | |
| 捕获组件用光学面包板 | Thorlabs 公司 | MB1224, MB1218 | |
| 光学隔振平台 | Technical Manufacturing 公司 | ||
| 带脚踏控制的电子快门 | Uniblitz | 购自纽约州罗切斯特市 Vincent Associates | |
| 单模光纤 | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| 光纤定位器 | Thorlabs 公司 | PAF-X-5-C | |
| 光纤准直器 | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| 望远镜用透镜 | Thorlabs 公司 | AC254-150-B | 焦距 150 mm |
| 平移台 (x, y, z) | Newport 公司 | M-461-XYZ | |
| 红外二向色镜 | Chroma Technology 公司 | ET750-sp-2p8 | |
| 物镜 (100X) | 尼康仪器公司 | 数值孔径 NA = 1.49，油浸，TIRF 物镜 | |
| 共聚焦扫描头 | Yokogawa | CSU-XI | |
| 偏振器 | 尼康仪器公司 | MEN51941 | |
| 沃拉斯顿棱镜 | 尼康仪器公司 | MBH76190 | |
| EM-CCD 相机 | 滨松公司 | C9100-13 | |
| CCD 相机 (ORCA ER) | 滨松公司 | C4742-80-12AG | |
| 滤光轮 | Ludl | 99A353 | |
| 滤光轮 | Sutter Instrument 公司 | LB10-NWE | |
| 带腔室盖玻片 | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | 包被抗 CD3 抗体 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-081 | |
| 胎牛血清 (HyClone) | 赛默飞世尔科技公司 | SH30071.03 |
参考文献
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
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