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方法文章

使用光镊技术进行活细胞动态成像研究宿主-病原体相互作用

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DOI：

10.3791/3123

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2011年7月28日

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The Ohio State University, 3Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Dept. of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University

本文内容

摘要

本文描述了一种利用与旋转盘显微镜耦合的光镊对活体病原体进行单独选择、操控和成像的方法。光镊可对生物体实现空间和时间上的精确控制，并将其定位在宿主细胞附近。荧光显微镜则能够在对细胞干扰最小的情况下，捕捉动态的细胞间相互作用。

摘要

动态活细胞成像技术可直接可视化免疫系统细胞间实时相互作用1, 2；然而，吞噬细胞与微生物之间缺乏空间和时间上的精确控制，使得对宿主免疫应答初始阶段的聚焦观察变得困难。传统上，诸如吞噬作用3等细胞间接触事件通常通过混合两种细胞类型，随后持续扫描视野，以期偶然捕获处于合适相互作用阶段的细胞间接触。由于此类事件具有随机性，该方法极为繁琐，且难以通过此途径观察到细胞间接触的早期或短暂事件。该方法依赖于寻找即将发生接触的细胞对，并持续观察直至其完成接触或未发生接触。为克服这些局限，我们采用光镊技术作为一种非侵入性、非破坏性但快速且有效的方法，用于在培养环境中精确操控细胞位置。

光阱或光镊在生物研究中正被越来越多地用于捕获和三维操控细胞及其他微米级颗粒4。辐射压于1970年首次被观察到并应用于光镊系统5, 6，并于1987年首次用于操控生物样本7。自那时起，光镊已发展成为一种用于探究多种生物现象的技术8-13。

我们描述了一种方法14 通过将光镊与旋转盘共聚焦显微镜结合，并集成温度和湿度控制，可在生理环境中对病原体实现精细的空间和时间操控，从而促进其与宿主细胞的相互作用，具体操作由实验人员设定。活体病原体如 白色念珠菌 和 Aspergillus fumigatus，可能在免疫功能低下个体中引起潜在致命的侵袭性感染15, 16 (例如 艾滋病、化疗及器官移植患者），使用非破坏性激光强度进行光镊捕获，并移动至巨噬细胞附近，以便巨噬细胞吞噬病原体。高分辨率的透射光及基于荧光的动态影像证实了在活细胞中观察吞噬作用早期事件的能力。为展示该技术在免疫学中的广泛适用性，还对原代T细胞进行了光镊捕获与操控，使其与包被抗CD3的微球形成免疫突触。 体内，并获得了突触形成的延时成像。通过提供一种对活体病原体相对于免疫细胞进行精细空间控制的方法，可在对细胞干扰最小的情况下，利用荧光显微镜捕捉细胞间的相互作用，从而深入揭示先天免疫与适应性免疫的早期应答过程。

方案

1. 光学捕获病原体的培养条件

  1. 在含有SBD（沙氏葡萄糖琼脂）的固体培养基上，于30°C培养A. fumigatus（B-5233/RGD12-8）3天。
  2. 在含有100 μg/mL氨苄青霉素的YPD（酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖）液体培养基中，于30°C摇床培养箱中过夜培养C. albicans（SC5314）。

2. 荧光标记病原体的制备

  1. 收集所需数量的病原体，并转移至1.5 mL离心管中。
  2. 向离心管中加入300 μL磷酸盐缓冲液（PBS）。
  3. 将混合物超声处理30秒。
  4. 以4000 rpm离心1分钟。
  5. 吸除上清液，保留沉淀物不受扰动。
  6. 重复步骤（2.4）和（2.5）两次。
  7. 用500 μL PBS重悬沉淀。

3. 用荧光染料标记病原体

  1. 将1 mg目标染料（例如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647）溶解于100 μL二甲基甲酰胺（DMF）中（浓度为10 mg/mL）。
  2. 向含有已洗涤病原体的反应管中加入3 μL染料混合物。
  3. 在37°C下旋转或振荡样品1小时。
  4. 用PBS洗涤样品3次，每次以4000 rpm离心1分钟。
  5. 重悬于300 μL PBS中。

4. 从全血中分离T细胞

  1. 采集全血（新鲜）。
  2. 将血液、含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 以及 Histopaque 恢复至室温。
  3. 按每毫升全血加入 50 μL 的量添加 RosetteSep 人 CD4+ T 细胞富集 cocktail。
  4. 旋转混匀样品，并在室温下孵育 20 分钟。
  5. 用等体积的含 2% FBS 的 PBS 稀释样品，并轻柔混匀。
  6. 将稀释后的样品小心铺加在 Histopaque 液面上，尽量避免混合。
  7. 在室温下以 1200 × g 离心 20 分钟，离心时关闭刹车。
  8. 收集富集的细胞。
  9. 用含 2% FBS 的 PBS 溶液洗涤富集细胞两次。
  10. 使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞，作用 2 分钟。
  11. 加入 10 mL 含 2% FBS 的 PBS，以 1500 rpm 离心 5 分钟。
  12. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
  13. 用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基重悬细胞。

5. 将 RAW 264.7 巨噬细胞接种至培养插片

  1. 准备含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）。
  2. 将培养基、胰蛋白酶和 PBS 在 37°C 水浴中预热。
  3. 用 PBS 洗涤培养板 2 次。
  4. 每次洗涤之间吸除 PBS。
  5. 向培养板中加入 5 mL 胰蛋白酶，使其覆盖整个表面（适用于 10 cm 组织培养板）。
  6. 在 37°C 下孵育 5 分钟。
  7. 轻轻敲击培养板侧面，使细胞从板表面脱落。注意避免胰蛋白酶溅出培养板外。
  8. 向胰蛋白酶中加入 5 mL 或等量的培养基。
  9. 将混合液吸出至反应管中。
  10. 以 1000 × g 离心 3 分钟。
  11. 吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
  12. 用 10 mL 培养基重悬细胞沉淀。
  13. 向腔室载玻片的每个腔室中加入 400 μL 培养基。
  14. 向每个腔室中加入 5 μL 细胞悬液。
  15. 在含 5% CO2 的 37°C 培养箱中过夜培养。

6. 向样本中添加病原体

  1. 用移液器将5-10 μL标记的目标病原体（来自步骤1-3）加入腔室中。
  2. 通过反复吹打充分混匀，注意不要触碰腔室底部，以免扰动已贴壁的巨噬细胞。

7. 将样品载入旋转盘共聚焦显微镜（视频中，扫描各组件）

  1. 开启转盘共聚焦显微镜的所有组件。
  2. 调整显微镜以进行微分干涉差（DIC）成像。
  3. 从培养箱中取出腔室载玻片。
  4. 将腔室载玻片插入专用载物台。
  5. 移除腔室载玻片的顶部（DIC成像所必需）。

8. 光镊捕获的准备工作（在视频中，浏览各组件及其如何整合到显微镜中）

  1. 打开光镊的快门。
  2. 开启红外激光器。
  3. 打开激光器上的快门，使光路通向光镊系统。
  4. 使用红外卡检查并确认红外激光器前方的快门处于关闭状态。

9. 利用光镊选择和操控病原体

  1. 观察贴壁载玻片上的巨噬细胞。
  2. 寻找在巨噬细胞附近溶液中自由浮动的病原体。
  3. 移动载物台，使病原体位于光镊捕获区域附近。
  4. 打开快门并启动光镊捕获。
  5. 移动样品，使巨噬细胞与被固定捕获的病原体接触。
  6. 使用转盘共聚焦显微镜进行成像，可选择微分干涉差（DIC）、荧光或两者结合模式。通常，捕获过程在DIC下进行，而实时成像则采用荧光模式。

10. 代表性结果：

为了在空间和时间上完全控制病原体和微珠 体内 和 体外 环境，我们设计了一种定制的捕获装置，并将其集成到转盘共聚焦显微镜上（示意图见图1）。激光器在满功率下输出350 mW的功率，经过光学捕获装置中各种光学元件耦合后，使用功率计测量在TIRF物镜处的光功率约为80 mW，用于在样品室中形成光镊。

为了在样品室中相对于被捕获的物体定位另一个物体，需在使用捕获激光固定该物体的同时移动载物台。移动载物台的速度足够缓慢，以确保被捕获粒子所受的拖拽力不超过最大捕获力。

分别用三种不同颜色（AF488、AF568 和 AF647，分别对应图中绿色、蓝色和红色）标记白色念珠菌（C. albicans）的不同群体（典型大小约为 5 μm），以展示在同时对病原体进行光学捕获的情况下，多荧光通道成像的应用。单个白色念珠菌（C. albicans）被捕获后，按灰色箭头所示路径在其他酵母细胞簇中沿方形轨迹移动，表明即使在拥挤的环境中，操作者仍可选择并精确操控特定单个病原体的位置（图 2A）。

为了进一步说明该系统在捕获病原体不同形态方面的灵活性，光镊还能够捕获并定位带有假菌丝的C. albicans颗粒。用AF647（红色）标记的C. albicans沿白色箭头所示轨迹移动，并被放置在荧光GFP-LC3-RAW细胞旁边（图2B）。捕获时，C. albicans的酵母部分被固定，而假菌丝则拖曳在后。

我们还将Aspergillus fumigatus置于RAW小鼠巨噬细胞附近，以分析该特定细胞系与病原体之间吞噬作用的绝对时间范围（图3A）。一旦病原体与细胞接触，即关闭光镊，随后采用延时成像技术观察细胞后续事件（图3B）。此外，光镊还可用于捕获从血液中分离的原代T细胞，并将其引导至包被抗CD3抗体的微珠附近，使T细胞与微珠形成免疫突触（图4），这进一步展示了光镊直接捕获和操控免疫细胞的多功能性。

光镊示意图；激光激发、共聚焦装置、发射光分析、显微成像过程。
图1. 光镊与转盘共聚焦显微镜联用系统的整体结构与示意图。仪器布局显示了捕获光束（紫色）、明场成像照明光路（橙色）、荧光激发光束（红色）、荧光发射光（绿色）、电荷耦合器件（CCD）相机、电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机、二向色镜（D1 和 D2）、反射镜（M1 和 M2）以及透镜（L1、L2、L3、L4）。光镊-共聚焦显微镜系统的其余所有组件均在图中标注。

显微镜图像显示细胞过程；5μm比例尺，荧光标记突出动态变化。
图2. (A) 受捕获与操控的荧光图像 C. albicans. 一个被捕获的荧光标记生物体（Alexa Fluor 488 (AF488)，蓝色）位于其他荧光标记生物体的视野中 C. albicans （AF568，绿色和AF647，红色）。根据灰色箭头所示，载物台围绕被捕获的蓝色CA颗粒移动。（B）被捕获的假菌丝形态 C. albicans 紧邻表达GFP-LC3的RAW细胞。荧光标记的白色念珠菌（CA）假菌丝形态（红色，AF647）被光镊捕获并移至表达GFP-LC3的RAW巨噬细胞附近。白色箭头所示为CA微生物的移动轨迹。

RAW细胞捕获烟曲霉的显微镜分析；延时序列；真菌细胞相互作用。
图3. A. fumigatus 被吞噬性RAW细胞捕获并定位。(A) 被捕获的A. fumigatus的明场图像，白色箭头所示，沿红色箭头所示路径移动并定位。由于捕获装置将微生物轻微推离焦平面，被捕获的病原体略显失焦。A. fumigatus被移动直至紧邻目标RAW细胞。(B) RAW细胞吞噬A. fumigatus的荧光成像。被捕获的病原体被放置在RAW细胞旁后，吞噬过程被激活。在30秒时，RAW细胞膜开始发生变化并围绕颗粒形成杯状结构。在60秒时，杯状结构完全形成。从90秒到150秒，A. fumigatus被逐步吞噬，至180秒时颗粒被完全内化

显示显微注射、显微镜分析和连续时间推移成像的细胞动态示意图。
图 4. 利用光镊捕获原代T细胞，促使其与包被抗CD3抗体的微珠形成突触。 通过光镊将原代T细胞移动至包被抗CD3抗体的微珠附近时的微分干涉差（DIC）图像。随后，该细胞形成免疫突触，但在图像中不易分辨。

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讨论

在本研究中，我们使用光镊捕获尺寸在 3 μm - 5 μm 之间的病原体。尽管本实验室关注的病原体通常具有此类尺寸，但本文所述的光镊系统具有灵活性，可捕获多种不同尺寸的微粒。事实上，光镊已被用于捕获从单个原子到直径约 10 μm 的细胞在内的各种尺寸的微粒。此外，该光镊系统能够捕获多种形状的微粒，包括球形、椭圆形以及高度细长的微粒，这在处理生物病原体时具有重要应用价值。

通过该方法，实时研究了吞噬作用和突触形成，并分析了细胞表面的结构变化。通过将颗粒放置在细胞附近，可对活的病原体进行控制和操纵，以激活吞噬机制，研究活细胞中的免疫反应，并监测从事件绝对起始到吞噬全过程的每一个阶段。因此，可以精确测量吞噬事件及其机制的完整演化过程。我们观察了当A. fumigatus作为病原体被放置于巨噬细胞附近时，巨噬细胞对其的吞噬过程，并记录了颗粒被吞噬时细胞膜的初始变化。通过控制病原体放置的时间点，我们能够精确测定该过程的完整时间进程。该技术还被进一步应用于观察原代T细胞的突触形成。利用光镊将一个T细胞移动至包被抗CD3抗体的微球附近，即可实时观察突触的形成过程。

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致谢

本工作得到了麻省总医院内科内部基金（J.M.T.、M.K.M.、M.L.C.、J.M.V.）、美国国立生物医学成像与生物工程研究所资助号 T32EB006348（C.E.C.）、麻省总医院计算与整合生物学中心发展基金及 AI062773（R.J.H.）、资助号 AI062773、DK83756 和 DK043351（R.J.X.）、美国国家科学基金会 0643745（M.J.L.）、美国国立卫生研究院（NIH）R21CA133576（M.J.L.），以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家过敏与传染病研究所（NIAID）AI057999（J.M.V.）的支持。我们感谢 Nicholas C. Yoder 提供的有益讨论，以及 Charles Felts（RPI, Inc.）提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A. fumigatus白化菌株 B-5233/RGD12-8，由 NIH 的 K.J. Kwon-Chung 惠赠
C. albicansSSY50-B 突变株，由 MGH 的 Eleftherios Mylonakis 惠赠；SC5314 菌株，由 Whitehead 研究所的 Gerald Fink 惠赠
Alexa Fluor 488InvitrogenA20000
Alexa Fluor 647InvitrogenA20006
二甲基甲酰胺Sigma-AldrichD4551
新鲜血液由 MGH、HMS 的 R.J.W. Heath 惠赠
尼康倒置显微镜尼康仪器公司型号 Ti-E
捕获激光器 ChromaLaseBlue Sky ResearchCLAS-106-STF02-02
荧光激发激光器Coherent 公司型号 Innova 70C
捕获组件用光学面包板Thorlabs 公司MB1224, MB1218
光学隔振平台Technical Manufacturing 公司
带脚踏控制的电子快门Uniblitz购自纽约州罗切斯特市 Vincent Associates
单模光纤Oz OpticsPMJ-3S3S-1064-6
光纤定位器Thorlabs 公司PAF-X-5-C
光纤准直器Oz OpticsHPUCO-23-1064-P-25AC
望远镜用透镜Thorlabs 公司AC254-150-B焦距 150 mm
平移台 (x, y, z)Newport 公司M-461-XYZ
红外二向色镜Chroma Technology 公司ET750-sp-2p8
物镜 (100X)尼康仪器公司数值孔径 NA = 1.49，油浸，TIRF 物镜
共聚焦扫描头YokogawaCSU-XI
偏振器尼康仪器公司MEN51941
沃拉斯顿棱镜尼康仪器公司MBH76190
EM-CCD 相机滨松公司C9100-13
CCD 相机 (ORCA ER)滨松公司C4742-80-12AG
滤光轮Ludl99A353
滤光轮Sutter Instrument 公司LB10-NWE
带腔室盖玻片Lab-Tek155409
DynabeadsInvitrogen111-51D包被抗 CD3 抗体
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)Invitrogen10313
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-081
胎牛血清 (HyClone)赛默飞世尔科技公司SH30071.03

参考文献

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