我们描述了对年轻成年小鼠的耳长提肌（LAL）反复给予毒蕈碱信号通路抑制剂的操作步骤，以及随后对完整肌肉标本中神经肌肉接头（NMJs）进行免疫染色的方法。LAL肌在揭示药物对神经肌肉接头的体内药理作用方面具有独特优势。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
啮齿类动物的后肢肌肉，如腓肠肌和胫骨前肌，常被用于 体内 哺乳动物神经肌肉接头（NMJ）形成与维持所必需的信号通路的药理学研究。然而，经皮下或肌肉注射给药后，药物在这些肌肉中的渗透往往不完全或不均匀，许多神经肌肉接头可能未受到药物影响。尽管使用微型泵等装置进行系统性给药可改善药物作用的空间和时间分布，但该方法具有侵入性，可能引发混杂的炎症反应和/或直接造成肌肉损伤。此外，对后肢肌肉中神经肌肉接头进行完整分析具有挑战性，因其需要耗时的连续切片和广泛的免疫染色。
小鼠LAL是一块位于颈部背侧浅层的薄而扁平的肌肉。它是一种快缩肌，功能是移动耳廓。该肌肉分为头侧和尾侧两部分，起源于颅骨中线，并向外侧延伸至每侧耳廓的软骨部分。肌肉由面神经的一个分支支配，该分支在出茎乳孔后向尾侧走行。我们及其他研究者发现，LAL是一个方便的实验模型，适用于短期和长期研究 体内 药物对神经肌肉接头（NMJs）和肌肉的影响。首先，其表浅的位置便于在轻度麻醉下进行多次局部给药。其次，其较薄的结构（仅含2-3层肌纤维）使得几乎整个肌肉内的所有神经肌肉接头均可被观察和分析。第三，该肌肉可连同其神经完整地分离，且其神经支配模式明确，便于开展额外的电生理学分析。 体外9,5最后，也是最重要的一点，施加的体积要小（˜50μl) 可轻松覆盖整个肌肉表面，使所有神经肌肉接头（NMJs）均匀且持续地暴露于药物，从而避免采用全身性给药方法1,8.
方案
1. 毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）拮抗剂的皮下给药
- 在无菌条件下，将药物溶于无菌生理盐水中，于1.5 mL离心管中配制适当剂量的mAChR拮抗剂（参见表格）。所使用的拮抗剂包括：atropine、Methoctramine、4-DAMP、AFDX-116、AFDX-384、MT 7。
- 用1 cc胰岛素注射器吸取50 μL溶液，并为每只小鼠使用单独的注射器。同时为对照组每只小鼠准备仅含生理盐水的注射器。将注射器置于冰上，待用。
- 使用氯胺酮-赛拉嗪混合物（氯胺酮120 mg/kg，赛拉嗪8 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过捏足趾观察无反应来确认麻醉深度是否合适。
- 在适当镇静后，剃除覆盖头部前部至颈部后部区域的毛发，并用70%乙醇擦拭清除残留毛发。
- 将小鼠置于体视显微镜下，将针头平行于LAL肌插入，同时轻轻上提注射器针头（图1A,B）。此操作可确保针头进入表层结缔组织，而不会直接损伤LAL肌本身。插入针头，使其尖端覆盖LAL肌的尾侧部分。
- 在缓慢撤出注射器的同时，开始缓慢地将溶液注射至右侧LAL肌上方；总注射时间应约为1分钟。若注射正确，溶液应在表层皮肤形成一个直径约1 cm的“隆起”，并至少维持1小时。均匀注射的溶液应覆盖右侧LAL肌的整个头侧和尾侧区域。
- 每12小时重复一次该操作，持续1至7天。在其他研究中，我们采用相同方案每12小时注射一次生长因子，最长持续21天。每日两次麻醉给药的小鼠未观察到异常反应。
2. LAL 肌肉的解剖
- 使用过量戊巴比妥钠（390 mg/kg）处死小鼠。通过胸腔切开术后评估心搏是否停止，以确认死亡。
- 将小鼠背侧朝上固定于解剖皿中，每只前爪各用一枚大头针固定，并在鼻部穿一枚大头针。
- 仅切开皮肤进行第一道切口，使用小型弹簧剪刀从左耳附近区域沿左侧头最长肌（LAL）向左肩胛骨区域剪开。
- 小心去除该区域的皮肤，但避免过于靠近右耳，因为此处是右侧头最长肌（LAL）的附着点之一。
- 在头部表面中线位置，找到左右侧头最长肌（LAL）交汇处中央的条带状脂肪组织。使用小型弹簧剪刀，从左侧头最长肌近端边缘开始，向右（朝向左耳方向）距离脂肪组织约1 cm处剪至肩部（图1C）。
- 完成切口后，用小型镊子轻轻掀开右侧头最长肌，暴露其腹侧面。在用镊子小心提起右侧头最长肌的同时，修剪其周围的结缔组织和筋膜（图1C）。
- 在耳基部围绕右侧头最长肌的尾端进行切割，并继续向右耳头端方向剪开，保持右侧头最长肌翻转状态（图1C）。此步骤宁可保留较多周围组织，以避免损伤头最长肌本身。若肌肉开始干燥，可用移液器滴加1×PBS覆盖肌肉。
- 将分离出的右侧头最长肌置于含有1×PBS的30 mm Sylgard培养皿中，背侧朝上。用小型昆虫针将肌肉四角固定。
- 使用小型镊子和弹簧剪刀，清除右侧头最长肌背侧和腹侧表面的结缔组织。翻转肌肉并重新固定，以便清理腹侧表面。同一30 mm培养皿中可放置2–3块肌肉。
3. LAL神经肌肉接头的三重免疫染色：第1天
- 开始免疫染色前，准备好所有所需试剂：1X PBS、含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（即2% BSA/PBS）、含0.1M甘氨酸的2% BSA/PBS溶液、含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS溶液，以及含4%多聚甲醛（PFA）的1X PBS溶液。将甲醇预先冷却至-20°C冰箱中。
- 在此过程中，将LAL肌肉固定在培养皿中，保持背侧朝上。弃去1X PBS溶液，加入足量4% PFA以覆盖肌肉组织。将培养皿置于摇床上，以2或3档速度振荡20分钟。除非另有说明，后续步骤均需将培养皿置于摇床上进行。
- 弃去4% PFA溶液，用1X PBS清洗肌肉组织3次，每次10分钟。
- 弃去最后一次PBS清洗液，加入含0.1M甘氨酸的2% BSA/PBS溶液，孵育30分钟。
- 弃去0.1M甘氨酸溶液，加入含有罗丹明标记的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）的1X PBS溶液，稀释比例为1:200，孵育15分钟。
- 弃去α-银环蛇毒素溶液，用1X PBS清洗肌肉组织3次，每次10分钟。
- 加入预冷的甲醇以通透组织，并将培养皿放入-20°C冰箱中精确孵育5分钟，此步骤无需振荡。
- 移除甲醇，用1X PBS清洗3次，每次10分钟。弃去最后一次清洗液，用含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS溶液在室温下封闭组织1小时。清洗和封闭步骤均在室温下进行。
- 将肌肉组织在4°C条件下，于封闭液中稀释的一抗混合液中孵育过夜，并持续振荡（参见表格）。
4. LAL神经肌肉接头的三重免疫染色：第2天
- 用 1× PBS 在室温下清洗肌肉组织 3 次，每次 10 分钟。
- 在封闭液中加入二抗混合物，室温孵育 1 小时（参见表格）。从本步骤开始，必须将肌肉组织避光处理，以防止 Alexa-Fluor 647 荧光发生光漂白。
- 用 1× PBS 清洗肌肉组织 3 次，每次 10 分钟。
- 在 1× PBS 中清除残留的结缔组织，修剪 LAL 肌肉的侧缘，并将肌肉腹面朝上置于载玻片上，使用玻璃盖玻片和封片介质进行封片。用透明指甲油固定盖玻片。
- 将载玻片避光保存于 -20°C，直至准备进行分析。
5. LAL 神经肌肉接头的共聚焦成像
- 使用配备 Leica Plan Apo 63X 油镜（1.4NA）的 Leica TCS 4D 共聚焦显微镜获取高分辨率共聚焦图像。
- 荧光素和Alexa 647信号分别使用488 nm（氩离子激光，488 nm，20 mW）和633 nm（氦氖激光，633 nm，10 mW）激光线同时扫描。随后，罗丹明信号使用561 nm（DPSS激光，561 nm，20 mW）激光线进行扫描。光学切片在 0.3 μm 时间间隔，z平面的图像数量在60至80之间变化。针孔调整为艾里斑1（Airy 1，107.97 μm）。图像格式为1024 × 1024（X，Y），缩放倍数为1，扫描速度为400 Hz时，所得图像尺寸为 234.32 μm x 234.32 μm 像素大小为 229.05 nm × 229.05 nm。
- 然后使用 Leica TCS-NT 采集软件将 z 系列图像重建为最大强度投影图像。
- 使用 Adobe Photoshop 调整多面板图像的亮度和对比度。
- 对于典型的LAL肌肉，应能够分析约75-100 正面 神经肌肉接头。突触稳定性由多种特征决定，例如突触前、突触周围和突触后结构（即神经、施万细胞和肌肉）的空间排列，以及突触面积（即突触大小）的测量值。
代表性结果：
在成年哺乳动物的神经肌肉接头（NMJ）处，单个运动轴突发出细小的分支，在单根肌纤维上形成高度分化的神经末梢结构（图2；绿色），并与烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的突触后簇精确相对（图2；红色）。在突触周围，终末施万细胞紧密包裹着突触前神经末梢的所有分支（图2；蓝色）。这种三元结构的功能和结构完整性在每日应用亚型特异性毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）抑制剂后受到严重破坏。在本例中（图3），4-DAMP 是一种对 M1、M3、M4 和 M5 mAChR 亚型具有高亲和力的 mAChR 拮抗剂，可导致肌肉表面多个 NMJ 处的神经末梢选择性消失（图3B, C）。此外，终末施万细胞表现出异常的静息状态8，表现为 S100 标记明亮但无突起延伸（图3B", 3C"）。在突触后侧，肌纤维形态正常，且未见 nAChR 的丢失（图3B', 3C'）。
图1. LAL 肌肉的解剖位置与结构。图中显示了头侧（rLAL）、尾侧（cLAL）、LAL 神经（LALn）及其相应的终板带的位置（A，插图）。图B展示了注射操作过程中针头相对于LAL肌肉的位置与方向。图C展示了分离操作的切口位置。
图2. 神经肌肉接头（NMJ）的三元结构。小鼠神经肌肉接头的高倍共聚焦图像。单根轴突形成精细的终末分支（A），其表面被终末施万细胞及其突起紧密包绕（A'，星号指示终末施万细胞胞体）。在肌纤维的突触后区域，烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）簇与神经终末分支及终末施万细胞的位置精确对应。
图3. 使用4-DAMP（一种mAChR拮抗剂）处理的LAL肌肉。经溶剂或4-DAMP处理的LAL肌肉的低倍和高倍共聚焦图像。与溶剂处理的肌肉（A-A'''）相比，4-DAMP处理的肌肉中许多神经肌肉接头缺乏神经末梢（B-B'''，C-C'''）。图2B中的方框区域在图2C中被放大。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍的方法可用于研究亚型特异性毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）信号通路在哺乳动物神经肌肉接头（NMJ）稳定性与维持中的先前未被认识的作用。该方法还可用于检测神经营养因子和药理学试剂的效果。例如，我们的实验室发现，睫状神经营养因子（CNTF）可诱导成年小鼠LAL神经末梢几乎全部发生出芽1。这一结果与先前关于CNTF处理后后肢肌肉的研究形成对比，后者报道在臀肌约13-33%以及外侧腓肠肌9%的接头处仅出现中等程度的出芽现象3。我们认为这种差异是由于LAL神经末梢对CNTF的暴露比后肢肌肉更均匀且持续时间更长所致。事实上，当我们采用相同的处理方案将CNTF应用于外侧腓肠肌和胫前肌时——该方案在LAL的几乎所有NMJ中均诱导了广泛的出芽——我们仅观察到少量NMJ出现微弱的出芽现象，且主要集中在注射部位附近。显然，后肢NMJ对CNTF的暴露是有限且不均匀的，这一点也在先前的一项研究中被指出2。另一方面，将CNTF注射至皮下结缔组织与LAL筋膜之间时（而非皮下注射至后肢肌肉内），会形成局部的皮下肿胀，该肿胀在血管重吸收前至少持续一小时。值得注意的是，即使将CNTF或mAChR拮...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由肌营养不良协会和美国国立卫生研究院（NS062320）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | 剂量：120mg/kg |
| 赛拉嗪 | Lloyd, Inc. | LA33806 | 剂量：8mg/kg |
| 阿托品 | Sigma-Aldrich | A0132 | （>98% 纯度）；剂量：0.2mg/kg — 20mg/kg |
| 阿托品 | Voigt Global Distribution | AT105 | 药用级 |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | 剂量：100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | 剂量：2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | T353-500 | 先用去离子蒸馏水配制10%溶液（10g/100mL），再用1× PBS配成4%溶液，并调节pH至7.4 |
| 戊巴比妥钠 | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | 剂量：390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | 部件编号 #184 | 按照试剂盒说明书操作，可根据需要使用不同尺寸的培养皿（30mm、60mm、100mm） |
| 0.1M 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G-7126 | 将0.185g加入25mL的2% BSA/PBS中 |
| 2% 牛血清白蛋白（2% BSA） | Sigma-Aldrich | A3059-100g | 将2g BSA溶解于100mL 1× PBS中 |
| 含0.2% Triton X-100的2% BSA/PBS（封闭缓冲液） | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | 将0.2mL Triton X-100加入100mL 2% BSA/PBS中 |
| α-银环蛇毒素 | Invitrogen | T1175 | 使用浓度为1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | 使用浓度为1:1000 |
| SV2 | 发育研究杂交瘤库 | SV2-上清液 | 使用浓度为1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | 使用浓度为1:400 |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG1 | Roche Group | 03117731001 | 使用浓度为1:200；若背景较高，可尝试1:400 |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | A21244 | 使用浓度为1:200 |
| Vectashield荧光封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | 此封片剂不会硬化，需用透明指甲油固定盖玻片。 |
| 小型弹簧剪 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| 解剖镊 | Fine Science Tools | 11295-51 |
参考文献
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
