本文描述了一种用于在背根挤压损伤后监测初级感觉轴突的体内成像方案。该方法利用宽场荧光显微镜和thy1-YFP转基因小鼠，可对周围神经系统中长达4 cm的轴突再生过程以及轴突与中枢神经系统界面的相互作用进行重复成像。
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本文内容
摘要
摘要
脊髓根损伤导致初级感觉轴突无法再生进入脊髓，从而引起慢性疼痛和永久性感觉丧失。背根（DR）轴突向脊髓内的再生在背根进入区（DREZ）受阻，该区域是中枢神经系统（CNS）与周围神经系统（PNS）之间的交界部位。目前对阻止DREZ处轴突再生的分子与细胞事件的理解尚不完整，部分原因在于与神经损伤相关的复杂变化主要依赖于死后组织分析推断得出。诸如轴突再生等动态细胞过程，最适合通过能够对每只活体动物进行多次观察并捕捉实时事件的技术来研究。我们对神经元进行连续监测的能力 体内 由于光学技术和小鼠转基因技术的革命性创新，该领域已显著进步。多种thy1-GFP转基因小鼠品系可使特定类型的神经元通过遗传标记表达不同的荧光颜色，从而实现对单个神经元的成像 体内1这些小鼠已被广泛用于 体内 肌肉成像2-4 和脑5-7，为静态分析无法揭示的生理机制提供了新的见解。对活体脊髓中神经元的成像研究才刚刚起步。Lichtman 及其同事首次通过宽场显微镜追踪损伤的背柱（DC）轴突，证明了该方法的可行性8,9多光子 体内 已实现对深部定位的DC轴突、小胶质细胞和血管的成像10近年来，我们率先将 体内 利用宽场显微镜成像技术，结合thy1-YFP小鼠的H系，监测背根（DR）轴突的再生情况。这些研究使我们提出了一种关于背根轴突为何无法在脊髓内再生的新假说11.
在thy1-YFP小鼠的H系中，YFP阳性轴突位于较浅层，便于同时监测多根轴突。我们发现，在腰段脊髓中成像到达背根进入区（DREZ）的背根（DR）轴突的效果优于颈段脊髓。在本报告中，我们介绍了多种经验证有效的策略，以确保对再生的背根轴突进行成功且可重复的长期成像。这些策略包括避免反复插管和呼吸中断的方法，减轻与手术相关的应激和瘢痕形成，以及在无光毒性条件下以高分辨率获取稳定图像的技术。
方案
1. 显微镜设置与成像准备
- 我们的成像系统由一台Leica MZ16荧光体视显微镜组成，配备快速快门和由Metamorph软件控制的冷却CCD相机。
- 准备一个温控加热垫，并将输出温度调节至32.5°C，以在手术期间及术后维持动物体温。
- 提前将无菌林格氏液或人工脑脊液（ACSF）加热至32.5°C，用于手术过程中对脊髓的灌注。
- 通过腹腔注射给予动物赛拉嗪（8 mg/kg）和氯胺酮（120 mg/kg）混合麻醉剂进行麻醉。
- 使用小型动物电推剪剃除背部上部毛发，并用棉签在剃毛区域涂抹少量脱毛乳液。数分钟后，用浸有70%乙醇的纱布擦去已涂抹的乳液。
2. 椎板切除术及L5背根的手术暴露
- 将动物置于加热垫（32.5°C）上，并用浸有70%乙醇的棉签对皮肤进行消毒。
- 在体视显微镜明场照明下，沿背部中线做一长度为2至3厘米的皮肤切口。必要时，使用棉签止血。
- 牵开脊柱肌肉以暴露下方的腰椎椎体。
- 使用小型咬骨钳，通过右侧半椎板切除术暴露L3-S1脊髓节段。通过切除位于髋骨髂嵴水平（L5背根神经节位置）的L5椎体右侧背侧部分，并向头侧延伸至L2椎体（最后一根肋骨后方第2个椎体），形成一个暴露腰段和骶段脊髓4至6个节段的部分椎板切除区域。用温热的无菌林格氏液灌注术区。
- 将动物置于支撑垫（卷起的脱脂棉纱布）上，以使脊柱保持平直。使用牵开钩扩大暴露区域。
- 此时（腹腔注射麻醉剂约30分钟后），应皮下注射等效剂量的50%作为补充，以维持动物的完全麻醉状态。或者，在持续超过1小时的成像过程中，可使用气体麻醉（0.5 L/min氧气中含2-4%异氟烷）进行重复麻醉。
3. 脊神经后根切断术/背根压榨
- 切换至荧光激发模式，以观察标记有 YFP 的 (+) 轴突。
- 使用皮下注射针（26 号）针尖，在覆盖 L5 背根（DR）的硬膜上做一个小切口。反复用任氏液灌流，并用棉签轻轻清理。
- 确定需挤压的部位，将精细镊子（Dumont #5）的一侧轻轻插入硬膜下。
- 轻柔而稳固地闭合镊子，夹住 L5 根的内侧部分持续 10 秒，然后缓慢松开镊子。
- 用生理溶液反复冲洗，并用棉签轻轻擦拭清洁。
4. 图像采集与术后操作
- 在损伤前和损伤后立即，以低倍和高倍镜对包括压迫部位及背根进入区（DREZ）在内的整个暴露区域获取多幅图像。
- 图像可采集为单张静态图像，或在30至40毫秒曝光时间内获取10至20帧的多帧图像流；随后选择清晰对焦的图像，后期使用Photoshop制作全景拼图。
- 为减少瘢痕形成，将一片剪裁合适、紧密贴合暴露脊髓窗口的薄型合成基质膜（Biobrane）紧贴覆盖于暴露的脊髓表面，再覆盖人工硬脊膜，确保其与脊髓贴合。
- 使用无菌5-0缝线缝合肌肉层，并用伤口夹闭合正中切口。
- 皮下注射林格氏液（0.3–0.5 mL），术后每12小时皮下给予布托啡诺作为镇痛剂（0.05 mg/kg），持续2天。
- 将动物置于加热垫（34°–35° C）上直至苏醒。
5. 重复成像
- 麻醉动物，并移除伤口夹和缝合线。
- 移除人工硬脑膜和薄的合成基质膜补片，并将其保存在含有林格液的无菌管中，以备后续重复使用。
- 使用皮下针的弯头和精细镊子轻轻清除任何积聚的结缔组织瘢痕。频繁用温热的林格液进行灌注。
- 重新暴露手术区域，包括挤压部位和背根入口区（DREZ），重新定位先前成像过程中观察到的YFP+轴突，并重复第4节中描述的操作步骤。
6. 代表性结果：
我们观察到，与横断损伤后无法再生的情况不同，几乎所有YFP+轴突在挤压损伤后3天内均生长通过了损伤部位（图1）11。通常在挤压后的次日，我们观察到近端残端轴突发生逆行性退变，以及同一轴突在挤压远端出现断裂和退变，这证实轴突已受到适当损伤（例如图1；第3天和第5天）。此外还采用若干其他标准，以明确区分再生轴突与未受损伤或已恢复的轴突。这些标准包括：（1）再生轴突在挤压部位表现出YFP+轴突非荧光区域的扩大，这是由于近端和远端均发生退变所致（相比之下，若轴突存活，则因荧光细胞质重新填充挤压部位，导致无标记间隙变窄）；（2）再生轴突比存活轴突更细、荧光强度更低，且形态更呈波浪状；（3）再生的神经突起比其穿过的退变荧光碎片更细且荧光更弱；（4）与存活或免损的轴突不同，再生轴突在背根进入区（DREZ）处停止延伸；（5）与存活或免损的轴突不同，再生轴突不表现出兰氏结。图1显示了挤压后立即观察到的四条表浅YFP+轴突（A1；彩色箭头所示）。挤压后3天，这四条轴突均延伸出一条单一神经突，穿过挤压部位（A2）。挤压后5天，神经突保持稳定，这些或其它近端轴突未见进一步生长（A3）。
穿过挤压损伤部位的再生神经突沿变性轴突形成的更粗且荧光更强的碎片（即神经内膜管）延伸，并在损伤后第4天即可到达背根进入区（DREZ）（约3 mm/2天）11每隔两到三天对这些轴突及其末端进行一次重复成像，持续两周（图2），结果表明，这些轴突既未向前生长，也未发生回缩，而是保持静止不动。唯一可观察到的变化是部分轴突末端和轴突干出现肿胀。因此，这些观察结果出人意料地揭示了再生轴突在背根进入区（DREZ）处迅速且持续性的固定状态。
图 1：对 L5 背根 YFP+ 轴突在背根 crush 损伤部位连续成像 5 天。L5 背根的内侧部分被 crush（红色箭头所示），并在损伤后第 0、3 和 5 天进行成像。右侧图 (A1-A3) 为损伤区域的放大图像。
图2： L5神经根 crush 后20天内，轴突到达DREZ区域的重复成像结果。第4天，三条轴突（彩色箭头所示）到达DREZ区域。这些轴突的尖端在后续的成像时间点——第7、9、13、15和20天——保持在同一位置，且形态相似。通过比较轴突尖端相对于其他轴突尖端及参照标记（星号）的位置变化，来判断成像间隔期间轴突的运动情况。
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讨论
在活体小鼠中直接成像背根神经节（DR）再生尤为困难，因为需要进行广泛的背部椎板切除术，以监测大范围内的轴突生长，随后在多次成像过程中还需反复进行侵入性外科手术和麻醉操作。多种策略有助于克服这些挑战。首先，成功成像需要通过缩短麻醉时间、减少出血以及实施细致的术后护理，将小鼠死亡率（约25%）降至最低。此外，采用支持快速相机速度的设置，可在无需气管插管或干扰呼吸的情况下快速获取多幅图像，也有助于降低死亡率。防止暴露脊髓表面形成瘢痕同样至关重要。这些胶原性瘢痕在各次成像间隔期间迅速形成，并在硬脊膜表面生成一层虽薄但不透明的屏障。清除瘢痕费时费力，延长成像时间，并可能损伤血管和轴突。一种有效的去瘢痕策略是应用一层薄的基质膜，使其紧密贴附于暴露的脊髓表面，促使瘢痕在膜上积聚而非在硬脊膜上形成。由于手术操作和光毒性可能带来干扰性伪影，我们开展了大量对照实验，观察了未经重复成像或手术处理的小鼠中的轴突形态。
该方案采用宽场显微镜，设置条件允许快速相机成像且无需气管插管或干扰呼吸。我们获取浅层轴突的多张图像，随后选择因呼吸运动导致畸变最小的最佳图像。然而，该方法的空间分辨率不足，尽管能够在较大范围...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Alan Tessler 博士的评论和编辑帮助。本研究由 NIH NS062320 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| H线 thy1-YFP（2-4月龄，性别不限） | 杰克逊实验室 | 003782 | |
| 赛拉嗪（AnaSed注射液，无菌溶液） | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| 氯胺酮（氯胺酮盐酸盐注射液，USP） | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| 布托啡诺（Buprenex 注射剂）（0.05 mg/kg） | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| 小型动物毛发剪刀 | Oster 专业产品 | 76059-030 | |
| 脱毛乳液 | 教堂 & Dwight Co. | 使用婴儿油进行NAIR | |
| 纱布海绵 | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL 注射器 | BD 生物科学 | 309602 | |
| 皮下（Sub-Q）针头，26 号 | BD Biosciences | 305115 | |
| 弹簧剪和镊子 | Fine Science Tools | ||
| 2.5毫米弯型咬骨钳 | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| 乳酸林格液’s 注射剂 USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| 无菌生理盐水溶液 | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| 薄型合成基质膜（Biobrane） | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| 人工硬脑膜 | Gore Preclude MVP 硬脑膜替代物，W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 丝线缝合线 | Ethicon Inc. | K-580 | |
| 伤口夹 | 完美 - Ets Bruneau（布吕讷，法国） | A75 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD相机 | 滨松公司 | ORCA-Rx2 | |
| 温度控制器 | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph 软件 | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
参考文献
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
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重印与许可
