本文描述了一种用于在背根挤压损伤后监测初级感觉轴突的体内成像方案。该方法利用宽场荧光显微镜和thy1-YFP转基因小鼠，可对周围神经系统中长达4 cm的轴突再生过程以及轴突与中枢神经系统界面的相互作用进行重复成像。
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摘要
摘要
脊髓根损伤导致初级感觉轴突无法再生进入脊髓，从而引起慢性疼痛和永久性感觉丧失。背根（DR）轴突向脊髓内的再生在背根进入区（DREZ）受阻，该区域是中枢神经系统（CNS）与周围神经系统（PNS）之间的交界部位。目前对阻止DREZ处轴突再生的分子与细胞事件的理解尚不完整，部分原因在于与神经损伤相关的复杂变化主要依赖于死后组织分析推断得出。诸如轴突再生等动态细胞过程，最适合通过能够对每只活体动物进行多次观察并捕捉实时事件的技术来研究。我们对神经元进行连续监测的能力 体内 由于光学技术和小鼠转基因技术的革命性创新，该领域已显著进步。多种thy1-GFP转基因小鼠品系可使特定类型的神经元通过遗传标记表达不同的荧光颜色，从而实现对单个神经元的成像 体内1这些小鼠已被广泛用于 体内 肌肉成像2-4 和脑5-7，为静态分析无法揭示的生理机制提供了新的见解。对活体脊髓中神经元的成像研究才刚刚起步。Lichtman 及其同事首次通过宽场显微镜追踪损伤的背柱（DC）轴突，证明了该方法的可行性8,9多光子 体内 已实现对深部定位的DC轴突、小胶质细胞和血管的成像10近年来，我们率先将 体内 利用宽场显微镜成像技术，结合thy1-YFP小鼠的H系，监测背根（DR）轴突的再生情况。这些研究使我们提出了一种关于背根轴突为何无法在脊髓内再生的新假说11.
在thy1-YFP小鼠的H系中，YFP阳性轴突位于较浅层，便于同时监测多根轴突。我们发现，在腰段脊髓中成像到达背根进入区（DREZ）的背根（DR）轴突的效果优于颈段脊髓。在本报告中，我们介绍了多种经验证有效的策略，以确保对再生的背根轴突进行成功且可重复的长期成像。这些策略包括避免反复插管和呼吸中断的方法，减轻与手术相关的应激和瘢痕形成，以及在无光毒性条件下以高分辨率获取稳定图像的技术。
方案
1. 显微镜设置与成像准备
- 我们的成像系统由一台Leica MZ16荧光体视显微镜组成，配备快速快门和由Metamorph软件控制的冷却CCD相机。
- 准备一个温控加热垫，并将输出温度调节至32.5°C，以在手术期间及术后维持动物体温。
- 提前将无菌林格氏液或人工脑脊液（ACSF）加热至32.5°C，用于手术过程中对脊髓的灌注。
- 通过腹腔注射给予动物赛拉嗪（8 mg/kg）和氯胺酮（120 mg/kg）混合麻醉剂进行麻醉。
- 使用小型动物电推剪剃除背部上部毛发，并用棉签在剃毛区域涂抹少量脱毛乳液。数分钟后，用浸有70%乙醇的纱布擦去已涂抹的乳液。
2. 椎板切除术及L5背根的手术暴露
- 将动物置于加热垫（32.5°C）上，并用浸有70%乙醇的棉签对皮肤进行消毒。
- 在体视显微镜明场照明下，沿背部中线做一长度为2至3厘米的皮肤切口。必要时，使用棉签止血。
- 牵开脊柱肌肉以暴露下方的腰椎椎体。
- 使用小型咬骨钳，通过右侧半椎板切除术暴露L3-S1脊髓节段。通过切除位于髋骨髂嵴水平（L5背根神经节位置）的L5椎体右侧背侧部分，并向头侧延伸至L2椎体（最后一根肋骨后方第2个椎体），形成一个暴露腰段和骶段脊髓4至6个节段的部分椎板切除区域。用温热的无菌林格氏液灌注术区。
- 将动物置于....
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讨论
在活体小鼠中直接成像背根神经节（DR）再生尤为困难，因为需要进行广泛的背部椎板切除术，以监测大范围内的轴突生长，随后在多次成像过程中还需反复进行侵入性外科手术和麻醉操作。多种策略有助于克服这些挑战。首先，成功成像需要通过缩短麻醉时间、减少出血以及实施细致的术后护理，将小鼠死亡率（约25%）降至最低。此外，采用支持快速相机速度的设置，可在无需气管插管或干扰呼吸的情况下快速获取多幅图像，也有助于降低死亡率。防止暴露脊髓表面形成瘢痕同样至关重要。这些胶原性瘢痕在各次成像间隔期间迅速形成，并在硬脊膜表面生成一层虽薄但不透明的屏障。清除瘢痕费时费力，延长成像时间，并可能损伤血管和轴突。一种有效的去瘢痕策略是应用一层薄的基质膜，使其紧密贴附于暴露的脊髓表面，促使瘢痕在膜上积聚而非在硬脊膜上形成。由于手术操作和光毒性可能带来干扰性伪影，我们开展了大量对照实验，观察了未经重复成像或手术处理的小鼠中的轴突形态。
该方案采用宽场显微镜，设置条件允许快速相机成像且无需气管插管或干扰呼吸。我们获取浅层轴突的多张图像，随后选择因呼吸运动导致畸变最小的最佳图像。然而，该方法的空间分辨率不足，尽管能够在较大范围.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Alan Tessler 博士的评论和编辑帮助。本研究由 NIH NS062320 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| H线 thy1-YFP（2-4月龄，性别不限） | 杰克逊实验室 | 003782 | |
| 赛拉嗪（AnaSed注射液，无菌溶液） | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| 氯胺酮（氯胺酮盐酸盐注射液，USP） | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| 布托啡诺（Buprenex 注射剂）（0.05 mg/kg） | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| 小型动物毛发剪刀 | Oster 专业产品 | 76059-030 | |
| 脱毛乳液 | 教堂 & Dwight Co. | 使用婴儿油进行NAIR | |
| 纱布海绵 | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL 注射器 | BD 生物科学 | 309602 | |
| 皮下（Sub-Q）针头，26 号 | BD Biosciences | 305115 | |
| 弹簧剪和镊子 | Fine Science Tools | ||
| 2.5毫米弯型咬骨钳 | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| 乳酸林格液’s 注射剂 USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| 无菌生理盐水溶液 | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| 薄型合成基质膜（Biobrane） | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| 人工硬脑膜 | Gore Preclude MVP 硬脑膜替代物，W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 丝线缝合线 | Ethicon Inc. | K-580 | |
| 伤口夹 | 完美 - Ets Bruneau（布吕讷，法国） | A75 | |
| 荧光体视显微镜 | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD相机 | 滨松公司 | ORCA-Rx2 | |
| 温度控制器 | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph 软件 | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
参考文献
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
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