介绍了一种在神经管形成期间直接对小鼠胚胎进行药理学操作的方法，该方法可绕过母体代谢。通过改变给药时间点和药理学试剂，该技术可适用于研究神经管形成的不同方面。
本文内容
摘要
摘要
遗传小鼠模型是研究哺乳动物神经管闭合的重要工具（Gray & Ross, 2009；Ross, 2010）。然而，对小鼠胚胎的研究 在子宫内 受限于无法在排除母体代谢对目标试剂影响的情况下，直接对胚胎进行药理学操控。无论是使用小分子化合物、重组蛋白还是siRNA，通过饮食或注射将这些物质递送至母体后，这些不稳定的化合物会受到机体多种防御机制的影响，可能无法到达胚胎。全胚胎培养体系中的研究可用于区分母体因素与胚胎自身内在因素对发育的影响。
在此，我们介绍一种使用高度富集培养基在滚筒培养箱中培养小鼠胚胎的方法，该方法可在解剖后维持正常的神经管闭合（Crockett，1990）。胚胎一旦进入培养状态，即可利用常规方法进行操作 体外 若胚胎仍处于未孵化状态，则无法实现这些技术 在子宫内胚胎同胞可在不同时间点收集，以研究神经管形成的不同方面，时间范围从E7-7.5（神经板形成期，即神经管形成开始之前）至E9.5-10（头褶闭合及尾端神经孔闭合完成时，Kaufman, 1992）。在本方案中，我们展示了在最适合研究颅部神经管形成的时间点解剖胚胎的方法。胚胎将在E8.5（约10-12体节）进行解剖，此时神经管闭合已启动，但胚胎尚未发生转动，颅部神经褶尚未闭合；随后将胚胎维持在体外培养至E10（26-28体节），此时颅部神经管形成应已全部完成。
方案
1. 培养基的制备——所有试剂均列于表1中
- 在37°C下解冻雄性大鼠血清。
- 在55°C下加热灭活大鼠血清30分钟
- 在室温下以10K离心大鼠血清5分钟
- 移除上清液，并与无酚红DMEM高糖培养基按50:50比例混合
- 使用0.45 µm注射器滤器对培养基进行灭菌
- 应至少为每个胚胎准备1 ml培养基
2. 从怀孕母鼠中分离子宫
- 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序，首先对怀孕母鼠进行麻醉，然后通过颈椎脱位处死
- 用70%乙醇对腹部进行消毒
- 用大号镊子在乳头线上方的腹中线处夹起一小段皮肤，并用大剪刀在镊子下方剪开腹腔。注意不要损伤任何内部结构
- 用剪刀从初始切口向小鼠两侧横向剪开，使整个腹部完全暴露
- 肠道和多余的脂肪组织常会遮挡子宫，应将其移开，以便观察到两侧子宫顶部和卵巢
- 在卵巢下方夹住子宫顶部，用剪刀从一侧子宫末端向另一侧卵巢方向剪开，将子宫与脂肪组织分离
- 用镊子将子宫取出，放入盛有生理盐水的培养皿中
3. 从子宫中取出胚胎
- 用生理盐水冲洗子宫，以去除多余的血液，并修剪掉外部多余的脂肪组织
- 将子宫转移至盛有室温 Tyrode 生理盐水的洁净培养皿中，以改善观察视野
- 在体视显微镜下，使用小型剪刀或必要时用精细（#5）镊子，小心地将子宫逐个分离，剥开每个胚胎
- 将精细镊子插入子宫壁与蜕膜之间的间隙，轻轻掀开子宫壁，注意避免刺破胚胎
4. 胚胎蜕膜的去除
- 将蜕膜调整方向，使颜色较深的部分（胎盘）朝向远离操作者的一侧
- 用镊子沿蜕膜深色部分与浅色部分之间的分界线做切口，注意不要切割过深
- 完全分离胎盘与卵黄囊顶部，注意避免撕裂外胎盘锥体（EPC）。此时应可在卵黄囊上观察到Reichert膜
- 继续小心去除整个蜕膜（浅色部分），注意不要刺破卵黄囊
- 轻轻夹住并从EPC上剥离去除Reichert膜。若EPC受损或与卵黄囊分离，胚胎在E8.5至E9.5期间将无法正常翻转
- 去除Reichert膜后，胚胎应可通过卵黄囊清晰可见，可通过计数体节进行胚胎分期
5. 建立培养系统
- 用剪刀剪去塑料移液管的一端，以增大开口直径，使胚胎能够通过移液操作而不损伤卵黄囊
- 向洁净的滚瓶中加入每胚胎1 ml的培养基。根据所用滚瓶类型的不同，每个瓶中最多可装载3-6个胚胎
- 使用剪裁过的移液管将胚胎转移至含培养基的滚瓶中，尽量减少携带的Tyrode's液，以免稀释培养基
- 将橡胶塞（bung）安装到玻璃滚瓶的顶部
- 将滚瓶插入滚筒培养装置中，使橡胶塞与滚筒之间形成紧密密封
- 当所有滚瓶均已安装完毕，并且滚筒中所有空位均用橡胶塞密封后，启动滚筒装置
- 打开CO2和O2气瓶，调节压力至约2 psi，使出口阀门每秒释放一个气泡。对于E8.5-E10阶段的胚胎，应使用20% O2和5% CO2
- 确保培养箱温度设定为37°C，并盖上或关闭培养箱，使胚胎免受光照
- 应定期检查胚胎，通过体节的增加、胚胎翻转的进展以及神经管闭合的程度来评估其发育情况
- 培养2-3小时后，可向培养基中添加药理学抑制剂或其他处理试剂
- 实验设计应包括对照组，例如溶剂对照或研究试剂的无活性类似物
6. 全胚胎培养后发育的评估
- 关闭气体，停止滚筒，从培养箱中取出瓶子
- 将胚胎转移回培养皿中的Tyrode溶液或PBS中，以便在体视显微镜下进行评估
- 卵黄囊应呈气球状，应可见心跳，心率应>120次/分钟，且应可见血液循环
- 如有必要，在去除卵黄囊前对胚胎进行拍照记录
- 通过在胚胎-卵黄囊连接处（EPC）附近剪开一个小口，将卵黄囊和羊膜翻转至胚胎头部和臀部上方，从而去除卵黄囊
- 可切断脐带以分离卵黄囊与胚胎，如有需要，卵黄囊可用于胚胎基因分型
- 检查胚胎的体节数量及神经管缺陷，例如颅褶开放、面部闭合不全和/或尾端神经孔开放。可根据Theiler分期标准（基于多种形态发生变化）对胚胎进行分期（http://www.emouseatlas.org/emap/home.html）。同样，记录胚胎发育的摄影资料非常有用
7. 注意事项
- 高质量的解剖至关重要，因为卵黄囊上的任何划伤或撕裂都会阻碍胚胎正常翻转并抑制其正常发育。在去除Reichert膜（RM）的过程中，也可能损伤胚胎前体细胞（EPC）；如果EPC与卵黄囊发生部分分离，胚胎将无法正常发育。然而，若RM去除不完全，可能导致胚胎相互粘连，或者RM细胞在培养过程中过度生长并限制卵黄囊扩张，这两种情况均会阻碍正常发育。
- 锋利且洁净的镊子是成功解剖的关键，因为钝或弯曲的镊子会显著增加操作难度。器械上的蛋白质残留会导致组织损伤。
- 洁净且无菌的玻璃瓶同样至关重要，以防止胚胎粘附瓶壁而受损。实验开始前，应使用肥皂和水彻底刷洗瓶子，用dH2O冲洗，并在每个瓶中加入少量水后微波加热至水沸腾。随后用70%乙醇冲洗瓶子，并静置风干。
- 操作应尽可能迅速，因为胚胎越早转移至培养基并恢复至37°C，其存活率越高。
- 在将任何胚胎转移至滚瓶前，先完成整窝胚胎的解剖，以确保所有胚胎在室温下暴露的时间相同，避免造成胚胎发育差异。
- 维持无菌环境以防止细菌污染。我们的培养实验未使用抗生素，但许多实验室会在培养基中添加抗生素以抑制细菌生长。实验结束时培养基应与实验开始时一样澄清。若培养基变得浑浊或出现可见沉淀，则很可能已发生污染，影响了培养体系。
- 气体交换效率低下也可能延缓胚胎发育，因此务必使用可靠的调节装置，确保气体持续供应。
- 胚胎在体外（ex vivo）培养中的发育速度大约比体内慢50%，因此必须通过计数体节来确认胚胎已达到实验所需的适当发育阶段。
8. 代表性结果：
图1展示了胚胎在滚瓶培养前后的形态。在解剖时，胚胎应处于未翻转状态（图1A,D），此时尾部位于头部褶皱之后。经过36小时的培养后，胚胎应已完成翻转过程，呈现C形弯曲的胎儿体位，尾部位于头部前方（图1B,C,E,F）。使用RhoA激酶抑制剂（Y-27632）进行药理学干预——该抑制剂是已知的神经管形成过程中汇拢延伸（convergent extension）的抑制剂（Ybot-Gonzalez, 2007）——会导致胚胎沿头尾轴缩短（图1E,F），并抑制头部神经褶的闭合。我们的数据显示，随着Y-27632剂量的增加，头部褶皱闭合逐渐受损（图2A），同时体轴缩短（图2B），这与RhoA下游信号通路在头部神经管形成及汇拢延伸过程中的作用一致。
图1. 胚胎培养及使用药理学抑制剂Y-27632的操作情况。（A,D）E8.5阶段解剖获得的胚胎，处于全胚胎培养之前。（B,E）经过36小时滚筒培养后E10阶段的胚胎，卵黄囊仍保持完整。（C,F）已去除卵黄囊，以显示成功翻转及神经管闭合。经Rho激酶抑制剂Y-27632处理的胚胎（E,F）未能正常进行汇聚延伸，表现出体轴缩短。
图 2. RhoA 激酶抑制剂对头部神经管闭合和体轴伸长的影响。（A）比较在不同浓度 Y-27632 培养条件下，能够成功闭合头部神经褶的胚胎百分比（%NTC = 神经管闭合率）。（B）随着 Y-27632 浓度增加，耳泡与前肢之间的距离显著缩短（p<.05）。
讨论
在胚胎发育过程中，将母体及宫内因素与胚胎自身内在因素区分开的能力，是研究胚胎发生各个阶段的重要工具。本文通过在体外（ex utero）分析RhoA激酶小分子抑制剂对颅部神经管形成的影响，排除了母体代谢药物所带来的变量干扰。该药理学干预对颅部神经管形成及汇聚延伸过程具有显著影响。不同遗传背景的小鼠突变体对该化合物的敏感性可在此体系中进行比较。本文所述方法也可应用于发育过程中其他分子通路的研究，从而利用多种试剂直接调控胚胎中的细胞功能。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢A. Hadjantonakis实验室（斯隆-凯特琳研究所）和L. Niswander实验室（科罗拉多大学丹佛分校）在解剖与培养技术方面提供的有益建议。本研究工作得到了针对JDG的NRSA NS059562基金以及与L. Niswander和J. Nadeau（系统生物学研究所）合作获得的MER的RO1NS05897基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖用体视显微镜 | Leica Microsystems | M165 | |
| 精密培养箱 | BTC Engineering | BTC 001 | |
| 旋转瓶培养装置 | BTC Engineering | BTC 003 | |
| 旋转装置用玻璃瓶 | BTC Engineering | BTC 005 | |
| 硅橡胶塞 | BTC Engineering | BTC 007 | |
| 硅橡胶瓶塞 | BTC Engineering | BTC 008 | |
| 气体鼓泡入口 | BTC Engineering | BTC 012 | |
| 气体鼓泡入口捕集器 | BTC Engineering | BTC 013 | |
| 气体鼓泡出口 | BTC Engineering | BTC 014 | |
| 气体钢瓶 | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| 气体减压阀 | Tech Air | ||
| 雄性大鼠血清 | Harlan Laboratories | 4520 | |
| 不含酚红的DMEM培养基 | Invitrogen | 31053 | |
| 10 mL注射器 | BD Biosciences | 309604 | |
| 注射器滤器 | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| 大型解剖剪刀（钝头） | VWR international | 82027-594 | |
| 超精细邦氏剪刀 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Tyrode’s 盐溶液 | 参见Cockroft 1990年的描述 | ||
| 10 cm一次性培养皿 | BD Biosciences | 351029 |
参考文献
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
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