活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

摘要

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。

摘要

近年来，科学家们日益认识到，基于微生物群体实验所获得的平均数据并不能代表单个细胞的行为、状态或表型。由于这一新认识，单细胞研究的数量在持续增加（近期综述见^1,2,3）。然而，目前应用的许多单细胞技术尚无法实现对某一特定单个细胞随时间推移的发育过程和行为进行连续监测（例如流式细胞术或常规显微镜技术）。

本文详细描述了一种在多项近期研究中使用过的显微镜方法^{4, 5, 6, 7}，该方法可用于长期追踪并记录枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）单个细菌细胞在多代生长与分裂过程中的（荧光）信号。通过分析所获得的延时影像，可追溯源自同一共同祖先的细胞群体中单个细胞的发育历史，进而构建谱系发生树。这种延时荧光显微镜技术不仅可用于研究单个细胞的生长、分裂和分化过程，还可用于分析细胞历史及其谱系对特定细胞行为的影响。此外，延时显微镜特别适用于观察细菌细胞周期中基因表达动态变化及蛋白质的定位情况。本方法详细说明了如何制备细菌样品以及如何构建显微镜载玻片，以支持单个细胞生长形成微菌落。简而言之，将单个细胞接种于含有琼脂糖的固体培养基表面，在温度可控的环境培养室内，利用荧光显微镜观察其生长与分裂过程。在设定的时间间隔内采集图像，随后使用开源软件 ImageJ 进行图像分析。

方案

1. 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）培养物的制备

1. 从-80°C保存的菌种中接种细胞至10 ml延时显微镜（TLM）培养基（62 mM K₂HPO₄、44 mM KH₂PO₄、15 mM (NH₄)₂SO₄、6.5 mM柠檬酸钠、0.8 mM MgSO₄、0.02%酪蛋白氨基酸、27.8 mM葡萄糖、0.1 mM L-色氨酸，使用KOH溶液将pH调至7），必要时添加抗生素。
2. 将细胞在摇瓶中过夜培养（30°C，225 rpm）。
3. 次日早晨，将细胞用预热的化学成分明确培养基（CDM）（62 mM K₂HPO₄、44 mM KH₂PO₄、15 mM (NH₄)₂SO₄、6.5 mM柠檬酸钠、0.8 mM MgSO₄、2.2 mM葡萄糖、2.1 mM L-谷氨酸、6 μM L-色氨酸、7.5 μM MnCl₂、0.15 ×金属混合液（配制50× MT混合液储备液（参考文献⁸），其成分为：0.2 M MgCl₂、70 mM CaCl₂、5 mM MnCl₂、0.1 mM ZnCl₂、0.2 mM盐酸硫胺素、2 mM HCl、0.5 mM FeCl₃（最后加入））按1:10稀释，不加抗生素。
4. 将B. subtilis细胞培养至对数中期（30°C，225 rpm）。通常需要约四小时。重要的是，在细胞达到对数中期前一小时准备琼脂糖载玻片（见第2节）。
5. 测定菌液在600 nm处的吸光度（A₆₀₀），并用CDM将细胞稀释至A₆₀₀约为0.035。该光密度可确保在显微镜载玻片上点样的单个细胞具有适当的间距，适用于延时显微镜观察。

2. 显微镜样品的制备（另见图2）

在细胞达到对数生长中期前一小时，按如下步骤准备显微镜载玻片：

1. 用70%乙醇和水清洗两张显微镜载玻片（例如 Knittel Glass，7.6 × 2.6 cm）。
2. 取一个基因框（ABgene；1.7 × 2.8 cm），小心移除基因框一侧的塑料保护膜，注意不要使另一侧的塑料盖板松动或脱落。
3. 将基因框固定在一张载玻片的中央位置：先使基因框的一侧与载玻片接触，再用指甲引导其余部分平稳贴合。在粘附过程中应避免产生气泡。
4. 使用微波炉将150 mg（1.5%）高分辨率低熔点琼脂糖（Sigma）溶解于10 ml CDM中。琼脂糖必须完全溶解，以获得延时显微成像实验所需的最低背景干扰。如有需要，可在此时向琼脂糖-CDM混合液中添加诱导剂或其他化合物。
5. 将500 μl温热的琼脂糖-CDM溶液加入基因框中央，确保整个区域（包括边缘）均被充分覆盖。
   接下来的步骤（2.6–2.10）需迅速完成，以防止琼脂糖-CDM过度干燥。
6. 将第二张载玻片覆盖在已加入琼脂糖-CDM的基因框上，尽量避免产生气泡。将夹心结构的玻片水平放置于4°C冰箱中静置45分钟，使琼脂糖-CDM充分凝固。
7. 小心地滑开上层载玻片。使用剃刀刀片在基因框内切割出约5 mm宽的琼脂糖条带，用于细胞培养。每张载玻片最多可设置三条条带，条带之间应保留约4 mm的间隔，这些空隙可提供枯草芽孢杆菌（B. subtilis）生长所必需的空气。若需同时观察四种不同菌株，可制备两条条带并各切成两半，形成四个小方块。清除所有残留的固体培养基。
8. 小心移除基因框上最后一层塑料保护膜，暴露其具有粘性的表面。
9. 将单细胞样品（来自步骤1.5）接种至固体培养基上，注意移液枪头不得接触培养基表面。每个完整条带使用2.5 μl，每个小方块使用1 μl。始终从琼脂糖垫顶部开始加样，并通过上下翻转载玻片使液体在指定生长区域内均匀扩散。当液滴边缘呈现波纹状，且翻转载玻片时液体不再流动，即表示样品已准备就绪。
10. 从一侧向另一侧将洁净的显微镜盖玻片（24 × 50 mm）覆盖在基因框上（避免产生气泡）。用指甲沿基因框边缘对盖玻片施加压力，确保其完全贴合。若在细胞尚未充分干燥时即加盖盖玻片，实验过程中细胞容易重叠生长；但也不可等待过久，否则琼脂糖会过于干燥。
11. 将载玻片在30°C条件下预热1小时。若直接将载玻片放入显微镜已预热的环境舱（见步骤3.1），温度波动可能导致实验初期出现自动对焦问题。

3. 时间序列荧光显微镜观察（另见图3和视频1）

1. 提前预热环境培养箱（我们通常在实验开始前至少2小时进行预热），以防止实验开始后出现自动对焦问题。所需时间取决于所使用的环境培养箱、加热系统以及显微镜的类型。
2. 根据实验设置选择合适的物镜、滤光片和二向色镜。对于长时间实验，务必在光源与样品之间安装紫外滤光片。此外，如有可能，使用中性密度滤光片阻挡部分激发光，以尽量减少光照暴露。

以下设备（由英国 DeltaVision 公司提供）用于 de Jong et al. 2010⁵ 中发表的延时显微镜实验：IX71 显微镜（Olympus）、CoolSNAP HQ2 相机（Princeton Instruments）、300 W 氙灯光源、60 倍明场物镜（1.25 NA）、GFP 滤光片组（Chroma，激发光波长 470/40 nm，发射光波长 525/50 nm）、mCherry 滤光片组（Chroma，激发光波长 572/35 nm，发射光波长 632/60 nm）。自动对焦通过透射光完成，并使用 DeltaVision 的 Softworx 软件中内置的自动对焦程序。需要注意的是，目前已有其他多种适用的自动对焦系统，例如 Zeiss Definite Focus、Nikon Perfect Focus System 和 Leica Adaptive Focus Control。

3. 根据您的实验设置编写实验程序。建议在正式实验前，先确定特定构建体所需的光照量，以及针对其他延时显微镜或细菌的自动对焦设置。较短的曝光时间和较低的激发光强度可最大程度减少荧光漂白和光毒性。使用透射光进行自动对焦程序。

以下设置用于 de Jong et al. 2010⁵ 中发表的时间推移显微镜实验：以 8 或 12 分钟为间隔拍摄图像序列，明场图像使用 10% APLLC 白光 LED 光源，曝光时间为 0.05 s；GFP 检测使用 10% 氙灯光源，曝光时间为 0.5 s；mCherry 检测使用 32% 氙灯光源，曝光时间为 0.8 s。原始数据使用 softWoRx 3.6.0（Applied Precision）软件存储。自动对焦程序设定步长为 0.06 μm，总范围为 1.2 μm。

4. 将制备好的载玻片（第2节）放入显微镜预热的环境培养室中，在30°C下监测单个细胞生长形成微菌落单层。

具体提示：

• 选择位于琼脂垫中央的单个细胞。琼脂垫边缘更容易干燥。使用显微镜软件记录细胞的 X、Y、Z 位置。
• 在 X、Y 和 Z 方向上大幅移动载物台可能会扰动琼脂糖，从而影响自动对焦程序对细胞的识别。通常情况下，为了尽量减少 X、Y、Z 方向的移动，即使载玻片上含有多个菌株，每个实验也最多只选择 10 个位置。
• 选定第一个细胞后，仅通过软件调节 Z 轴对焦。此后，除非显微镜的“Z 调焦旋钮”具备数字编码功能，否则不要手动调节显微镜本体上的 Z 轴对焦。确保每次自动对焦完成后，软件均保存新的 X、Y、Z 位置。
• 在开始实验前，检查自动对焦设置是否适用于当前实验。与明场或微分干涉差（DIC）显微镜相比，使用相差显微镜可能因对比度更高而改善自动对焦效果。然而，相差物镜中的相差环会降低其收集荧光信号的灵敏度（约降低 10%）。因此，对于荧光信号较弱的样品，更适合使用无相差环的物镜。
• 在实验运行稳定前，每隔半小时检查一次所选细胞是否仍处于焦点。若此时发现细胞失焦，需手动调整。由于温度变化或样品干燥不充分，在实验最初几小时内可能需要进行此类调整。此外，视野中细胞数量越多，对比度越高，自动对焦效果越好。

5. 实验结束后，根据需要将视频的不同通道分离，并保存为单独的文件（例如相差、GFP、mCherry）；某些采集软件会将所有通道存储于同一个堆叠文件中。用于发表时，可通过二维去卷积（2D deconvolution）对图像进行增强处理，该方法在蛋白质定位研究中尤为有用。可使用显微镜配套软件或商业软件（如 Huygens，www.svi.nl）进行图像去卷积。
6. 使用 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）（请使用未经处理的原始图像文件）以及 Microsoft Excel 或 Sigma Plot 进行数据分析。例如，在 ImageJ 中可将图像堆叠保存为“.avi”格式的视频文件。下文将详细描述如何随时间测量单个细胞的荧光强度。

4. 使用 ImageJ 分析启动子活性动态数据

我们注意到，还有其他一些优秀的软件包专门用于分析延时显微镜图像，例如 BHV 软件^{9, 4}、Schnitzcell¹⁰、PSICIC¹¹ 和 Microbe-Tracker¹²，但本文重点介绍免费提供的 ImageJ 软件包。

1. 下载 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/），并根据需要安装用于打开您（堆叠）文件的正确插件。例如，使用 deltavision 显微镜记录的视频只能通过 deltavision opener 插件在 ImageJ 中打开。将 DV 插件复制到 ImageJ 的插件文件夹中，然后启动程序。在“编辑/选项/内存与线程”（edit/option/memory&threads）中将内存容量设置为 1250 MB，以便能够处理较大的文件，例如延时成像视频所生成的文件。
2. 为了分析单个细胞的细胞历史，打开一个微菌落的原始相差视频，并滚动至视频中感兴趣的最后一帧。在菜单中选择“分段线”（segmented lines）选择工具。
3. 在背景区域画一条线，然后按“CTRL”+“T”，这将打开感兴趣区域（ROI）管理器。（相应的背景荧光值可用于手动减去背景——见下文；或者使用 ImageJ 内置的背景减除功能。）接着在目标细胞内画一条线，并将该 ROI 添加至 ROI 管理器。由于本案例研究中检测的是启动子-GFP 融合蛋白，而 GFP 在细胞质中均匀分布，因此在整个细胞长度范围内，每个像素的荧光值应大致相同。将视频回退一帧，在同一目标细胞中选择新的 ROI，保存该第三个 ROI，并重复此操作，直至保存了视频第一帧中对应的 ROI。
   请注意，细胞分裂后子代细胞的荧光强度可能差异较大。可选用膜染料与细胞表达的荧光蛋白共同标记（例如红色膜染料 FM^® 5-95（Invitrogen）与 GFP 的组合），以可视化隔膜形成过程。此时应使用相应的荧光通道而非相差视频来追踪细胞随时间的变化。或者，为确保准确性，可在细胞的一半区域内选择 ROI。
4. 在 ROI 管理器中点击“保存”（save）。如果文件扩展名为“.roi”，则列表中仅选中的单个 ROI 将被保存；如果扩展名为“.zip”，则整个 ROI 集合将被保存（此方式为必需）。
5. 关闭相差视频，打开原始荧光视频（例如 GFP 通道）。在 ROI 管理器中点击“显示全部”（show all）和“测量”（measure），将弹出一个新窗口（结果窗口）。将结果复制到 Excel 表格中，并从每个单细胞的平均荧光值中减去培养基的背景荧光值。所得净荧光值可对时间作图，以展示目标细胞在时间进程中的启动子活性。
6. 或者，也可在特定时间点分析微菌落中所有细胞的荧光强度。为此，按照上述方法在某一帧中选择并保存背景及每个单细胞的 ROI，将荧光值复制到 Excel 中，并使用“工具”（tool）菜单下的“直方图”（histogram）功能生成直方图。
7. 为获取用于发表的单帧图像，选择感兴趣的帧，点击“图像”（image）→“复制图像”（duplicate image），然后通过“图像”→“类型”（type）→“RGB 颜色”或“8 位”将图像类型更改为“RGB”或“8 位”。将复制后的帧保存为“.tiff”格式。RGB/8 位图像可由常规绘图软件（如 CorelDraw 或 Adobe Illustrator）打开。如有需要，可在 ImageJ 中使用“图像”→“调整”（adjust）→“亮度/对比度”或“图像”→“调整”→“窗宽/窗位”对图像进行优化。

5. 使用 ImageJ 制作用于发表的视频

1. 在 ImageJ 中按照上述方法打开原始相差图像及对应的荧光视频文件。选择矩形选区工具（1^st 在左侧）在第一帧中绘制一个矩形选区（ROI），确保在整个视频过程中该选区始终包含正在发育的微菌落。选择“图像”-“裁剪”，并将此较小版本的视频另存为新名称。在荧光视频中通过ROI管理器选择相同的ROI，并按前述步骤进行操作。
2. 要将视频水平或垂直合并，请选择“plugin” - “stack combiner”。如需添加时间戳，可通过“plugin” - “time stamper”实现。将合并后的图像序列分别保存为“.dv”或“.tiff”格式一次，以及“.avi”或QuickTime视频格式一次。

替代方案的调整与优化 肺炎链球菌 （图4和视频2）：

6. 准备 S. pneumoniae 培养物

1. 培养 S. pneumoniae 细胞（有荚膜菌株 D39） ¹³或无荚膜R6菌株 ¹⁴ 在C+Y培养基中作为静置培养物 ¹⁵ 37℃°C，直至 A 处的 OD 达到指定值_{600 nm} 约为0.4时停止。以14000 rpm离心2分钟，将细胞沉淀重悬于适量含14.5%甘油（v/v）的新鲜C+Y培养基中，使菌液A_{600 nm} 恰好为 0.4。分装细胞并置于 -80 保存°用于后续使用。
2. 对于延时显微成像，取一份先前培养的 S. pneumoniae 细胞。用来自-80℃的细胞以1:100的比例接种4 ml新鲜C+Y培养基°C等分试样。将细胞培养至对数中期，OD值达到A_{600 nm} 0.1 - 0.2。通常情况下，使用来自-80的细胞时，大约需要2小时°C 部分。

7. 显微镜样品的制备

1. 按照上述方法制备显微镜载玻片，用于 B. subtilis，但需确保琼脂糖中含有复合 C+Y 培养基。由于 S. pneumoniae 为微需氧菌，琼脂糖条带之间的空气间隙应比 B. subtilis 更小（两侧各约 1 mm 的间隙）。
2. 在 600 nm 波长下测定菌液的吸光度（A₆₀₀），用 C+Y 培养基将处于对数生长期的 S. pneumoniae 细胞稀释至 A₆₀₀ 约为 0.05，并使用此稀释液加载琼脂糖载玻片。

8. 活细胞相差显微镜延时成像

调整显微镜设置以观察S. pneumoniae：使用相差显微镜，因为S. pneumoniae在明场显微镜下难以识别。后续步骤按照B. subtilis的操作流程进行（执行步骤2.9至3.7）。S. pneumoniae可在30°C或37°C下培养（在37°C下生长更快）。

9. 代表性结果：

如果细菌生长形成一个完全位于实验结束时视野范围内的微菌落单层，则时间序列荧光实验已成功完成（见图5A-C）。如果细胞相互重叠生长，不仅无法准确追溯其谱系历史，而且重叠细胞的荧光强度也无法被正确测量。当点样后的细胞未充分干燥（步骤2.9）或培养基成分需要调整以减缓生长速度时，细胞容易发生重叠生长。如果微菌落生长至视野之外，则无法确定单个菌落内部的荧光信号分布。造成“微菌落移动”的原因可能包括点样细胞干燥不充分（步骤2.9），或软件未设置为在发育过程中追踪微菌落。此外，必须确保培养基中不存在局部增强的荧光区域，因为这会干扰来自细胞的荧光信号（见图5D-F）。背景相关问题可能来源于培养基成分、气泡或未完全溶解的琼脂糖团块。为说明这一点，我们在图5F中展示了使用红色荧光染料的激发/发射滤光片拍摄该特定载玻片时的背景信号。可见存在明亮的自发荧光点，可能影响成像效果。为避免此类荧光点，放置盖玻片时应确保琼脂糖完全溶解且无气泡残留。

图1： 实验概述

图 2： 显微镜样品的制备

图3：携带 P_kinB-gfp 融合基因的 B. subtilis 细胞的时间推移荧光显微镜图像。图像选自视频1。上排图像：明场，下排图像：GFP 通道。

图4： 延时相差显微镜观察 S. pneumoniae 野生型菌株R6。图像截取自视频2。

图5：可能的（延时）显微镜结果示意图。A-C 展示了使用透射光设置获取数据时需要考虑的因素。（A）产孢B. subtilis细胞微菌落单层的明场显微图像（理想结果）（B）部分细胞重叠生长的B. subtilis微菌落明场图像（非理想结果）（C）超出焦平面生长的产孢B. subtilis微菌落明场图像（非理想结果）。D-F 展示了使用落射光设置获取数据时需要考虑的因素（D）指数生长期B. subtilis细胞的相差图像，用于显示E和F中荧光信号的来源（E）D图所示细胞的GFP信号。注意背景信号在每个像素中均相似（理想结果）。同时注意曝光时间可能过长，因为一个细胞显示出信号饱和（非理想结果）（F）通过红光通道获取的D图所示细胞的信号。注意背景中存在红色荧光水平升高的区域（非理想结果）。

视频 1. 携带 P_kinB-gfp 融合基因的 B. subtilis 细胞的时间推移荧光显微镜观察。图像以每 8 分钟一次的间隔拍摄。左侧：明场图像，右侧：GFP 通道图像。点击此处观看视频。

视频 2. 延时相差显微镜观察 S. pneumoniae 野生型菌株R6。每隔10分钟拍摄一次图像。 点击此处观看视频。

讨论

与其他许多单细胞技术不同，此处所述的时间序列荧光显微镜方法可用于追踪特定细胞的谱系历史、行为特征及分裂事件。结合荧光标记的靶向启动子或蛋白质，可在细菌发育过程中实时监测特定发育通路的激活情况，以及蛋白质的定位和动态变化。

如上所述，通过根据特定细菌的需求调整培养条件，可对不同细菌种类开展研究。我们遇到的唯一限制与生长条件和样品规模有关。由于环境密闭，实验过程中无法改变培养基条件。此外，每次实验最多可有效监测四种菌株。

考虑到一些关键步骤，此处描述的单细胞分析方法可轻松应用于任何自动显微镜。以下将概述这些关键步骤，详细信息请参见正文。常规准备：实验前检查特定细菌所需的自动对焦设置是明智之举。同样，如果可能，应提前确定荧光可视化的大致最佳设置。此外，遵循预先制定的时间表有助于及时准备好所有材料（例如提前预热显微镜腔室、编程显微镜参数、在细胞达到所需生长期前一小时制备载玻片，见图1）。B. subtilis 在TLM和CDM中的培养：TLM和CDM是化学成分明确的饥饿培养基，在其中B. subtilis仅缓慢生长。根据具体菌株的不同，细胞在培养基中的培养时间可能需要延长。缓慢生长可防止细胞相互堆叠。显微镜样品的制备：必须避免基因框架、载玻片与盖玻片之间产生气泡，以防止基于琼脂糖的培养基过度干燥。培养基与盖玻片界面同样需要注意。必须让细胞充分干燥，以防止细胞游动或形成多层生长。延时荧光显微镜观察：载玻片及环境腔室的预热至关重要，可避免严重的自动对焦问题。应选择位于琼脂垫中央的细胞，因为这些细胞在实验过程中最有可能保持在视野和焦平面内（前提是样品已充分干燥）。每项实验最多设置10个位置仍可正常工作。选定第一个目标细胞后，仅使用软件调节焦距（详见正文）。在实验开始的数小时内，应每隔30分钟检查一次细胞是否仍处于焦平面内。分析：在进行大规模分析之前，必须检查培养基背景在各荧光通道中的信号值是否相近。微小灰尘颗粒、培养基成分、镜头污渍或微小的琼脂糖团块可能导致局部荧光信号升高，从而使视频难以甚至无法分析。故障排除：若观察到细胞相互堆叠生长，可能是由于盖玻片过早封固，或培养基不适合微菌落单层生长。若目标细胞持续过早死亡，而载玻片上其他细胞正常分裂，则应检查是否已正确安装紫外滤光片。此外，在长时间实验中缩短曝光时间或降低光照强度也可能有所帮助。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基因框	ABgene有限公司	AB-0578	1.7 × 2.8 厘米
高分辨率低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A4718
大片盖玻片	多家供应商		24 x 50 毫米
如需要，可使用膜染料，例如 FM 5-95	Invitrogen	T23360	其他膜染料也可使用： http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf
带有环境培养室的延时显微镜	多家供应商		在相应章节中查看我们设备的详细信息