本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。
本文内容
摘要
摘要
近年来，科学家们日益认识到，基于微生物群体实验所获得的平均数据并不能代表单个细胞的行为、状态或表型。由于这一新认识，单细胞研究的数量在持续增加（近期综述见1,2,3）。然而，目前应用的许多单细胞技术尚无法实现对某一特定单个细胞随时间推移的发育过程和行为进行连续监测（例如流式细胞术或常规显微镜技术）。
本文详细描述了一种在多项近期研究中使用过的显微镜方法4, 5, 6, 7，该方法可用于长期追踪并记录枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）单个细菌细胞在多代生长与分裂过程中的（荧光）信号。通过分析所获得的延时影像，可追溯源自同一共同祖先的细胞群体中单个细胞的发育历史，进而构建谱系发生树。这种延时荧光显微镜技术不仅可用于研究单个细胞的生长、分裂和分化过程，还可用于分析细胞历史及其谱系对特定细胞行为的影响。此外，延时显微镜特别适用于观察细菌细胞周期中基因表达动态变化及蛋白质的定位情况。本方法详细说明了如何制备细菌样品以及如何构建显微镜载玻片，以支持单个细胞生长形成微菌落。简而言之，将单个细胞接种于含有琼脂糖的固体培养基表面，在温度可控的环境培养室内，利用荧光显微镜观察其生长与分裂过程。在设定的时间间隔内采集图像，随后使用开源软件 ImageJ 进行图像分析。
方案
1. 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）培养物的制备
- 必要时，从 -80°C 保存的菌种中接种细胞至 10 ml 时间延时显微镜（TLM）培养基（62 mM K2HPO4、44 mM KH2PO4、15 mM (NH4)2SO4、6.5 mM 柠檬酸钠、0.8 mM MgSO4、0.02% 酪蛋白氨基酸、27.8 mM 葡萄糖、0.1 mM L-色氨酸，使用 KOH 溶液将 pH 调至 7）中。
- 在摇瓶中培养细胞过夜（30°C，225 rpm）。
- 次日早晨，将细胞用预热的化学成分明确培养基（CDM）（62 mM K2HPO4、44 mM KH2PO4、15 mM (NH4)2SO4、6.5 mM 柠檬酸钠、0.8 mM MgSO4、2.2 mM 葡萄糖、2.1 mM L-谷氨酸、6 μM L-色氨酸、7.5 μM MnCl2、0.15 × 金属混合液（配制 50× MT 混合液储备液（参考文献8），其组成为：0.2 M MgCl2、70 mM CaCl2、5 mM MnCl2、0.1 mM ZnCl2、0.2 mM 硫胺素盐酸盐、2 mM HCl、0.5 mM FeCl3（最后加入）））按 1:10 比例稀释，不加抗生素。
- 将 B. subtilis 细胞培养至对数中期（30°C，225 rpm）。通常需要约四小时。重要的是，在细胞达到对数中期前一小时准备琼脂糖载玻片（见第 2 节）。
- 测定菌液在 600 nm 处的吸光度（A600），并用 CDM 将细胞稀释至 A600 约为 0.035。该光密度值可确保在显微镜载玻片上点样时获得间距合适的单个细胞，适用于时间延时显微镜观察。
2. 显微镜样品的制备（另见图2）
细胞达到对数生长中期前一小时，按如下步骤准备显微镜载玻片：
- 用70%乙醇和水清洁两张显微镜玻片（例如 Knittel Glass，7.6 × 2.6 cm）。
- 取一个基因框（ABgene；1.7 × 2.8 cm），小心地从基因框上撕下其中一侧的塑料保护膜，注意不要使另一侧的塑料盖膜松动或脱落。
- 将基因框固定在一张玻片的中央，先从一侧开始接触，再用指甲引导基因框其余部分贴附到位。在将基因框粘附到玻片时，应避免产生气泡。
- 使用微波炉将150 mg（1.5%）高分辨率低熔点琼脂糖（Sigma）溶解于10 ml CDM中。琼脂糖必须完全溶解，以获得延时显微成像实验所需的最低背景。如有需要，此时可在琼脂糖-CDM中添加诱导剂或其他化合物。
- 将500 μl温热的琼脂糖-CDM加入基因框中央，确保整个区域（包括边缘）均被完全覆盖。
以下步骤（2.6 - 2.10）需迅速完成，以防止琼脂糖-CDM过度干燥。 - 将第二张玻片盖在已填充琼脂糖-CDM的基因框上，尽量避免产生气泡。将夹心结构的玻片水平放置于4°C冰箱中45分钟，使琼脂糖-CDM充分凝固。
- 小心地滑开上层玻片。使用刀片在基因框内切割出约5 mm宽的琼脂糖条带，用于细胞培养。每张玻片最多可使用三条条带，条带之间应保留约4 mm的间隔，这些间隙可提供枯草芽孢杆菌（B. subtilis）生长所必需的空气。若需同时观察四种不同菌株，可制作两条条带并各切成两半，形成四个小方块。清除所有残留的固体培养基。
- 小心移除基因框上最后一层塑料保护膜，暴露其粘性面。
- 将单细胞（来自步骤1.5）接种至固体培养基上，注意移液枪头不得接触培养基表面。整条条带使用2.5 μl，小方块使用1 μl。始终从琼脂糖垫顶部开始加样，并通过上下翻转玻片使液体在指定生长区域均匀扩散。当液体边缘出现波纹状且翻转玻片时液体不再流动时，表明样品已准备就绪。
- 从一侧向另一侧将洁净的显微镜盖玻片（24 × 50 mm）覆盖在基因框上（避免产生气泡）。用指甲沿基因框边缘对盖玻片施加压力，确保其完全贴合。若在细胞尚未充分干燥时即加盖盖玻片，实验过程中细胞容易重叠生长；但也不可等待过久，否则琼脂糖会过于干燥。
- 将玻片在30°C下预热1小时。若直接将玻片放入显微镜已预热的环境培养室（见步骤3.1），温度波动可能导致实验初期出现自动对焦问题。
3. 时间序列荧光显微镜观察（另见图3和视频1）
- 提前预热环境培养箱（本实验室建议至少在实验开始前2小时启动），以避免实验开始后出现自动对焦问题。所需预热时间取决于所使用的环境培养箱、加热系统及显微镜型号。
- 根据实验设置选择合适的物镜、滤光片和二向色镜。对于长时间实验，务必在光源与样品之间安装紫外滤光片。此外，若条件允许，使用中性密度滤光片部分阻断激发光，以最大限度减少光暴露。
以下设备（由 DeltaVision，英国提供）用于 de Jong 等 2010 年发表的延时显微成像实验5：IX71 显微镜（Olympus）、CoolSNAP HQ2 相机（Princeton Instruments）、300 W 氙灯光源、60 倍明场物镜（1.25 NA）、GFP 滤光片组（Chroma，激发光 470/40 nm，发射光 525/50 nm）、mCherry 滤光片组（Chroma，激发光 572/35 nm，发射光 632/60 nm）。自动对焦通过透射光完成，并使用 Deltavision Softworx 软件中内置的自动对焦程序实现。需要注意的是，目前已有多种其他适用的自动对焦系统，例如 Zeiss Definite Focus、Nikon Perfect Focus System 和 Leica Adaptive Focus Control。
- 根据实验设置编写实验程序。建议在正式实验前，预先确定特定构建体所需的光照强度，以及其他延时显微镜或细菌的自动对焦设置。较短的曝光时间和较低的激发光强度可最大限度地减少荧光淬灭和光毒性。使用透射光进行自动对焦程序。
以下设置用于 de Jong et al. 20105 中发表的时间推移显微镜实验：以 8 或 12 分钟为间隔拍摄图像序列，明场图像使用 10% APLLC 白光 LED 光源，曝光时间为 0.05 秒；GFP 检测使用 10% 氙灯光源，曝光时间为 0.5 秒；mCherry 检测使用 32% 氙灯光源，曝光时间为 0.8 秒。原始数据使用 softWoRx 3.6.0（Applied Precision）软件存储。自动对焦程序设定步长为 0.06 μm，总范围为 1.2 μm。
- 将制备好的载玻片（第2节）放入显微镜预热的环境培养室中，在30°C下监测单个细胞向外生长形成微克隆单层的过程。
具体提示：
- 选择位于琼脂垫中央的单个细胞，因为琼脂垫边缘更容易干燥。使用显微镜软件记录所选细胞的 X、Y、Z 位置。
- 在 X、Y 和 Z 方向上大幅移动载物台可能会扰动琼脂糖，从而影响自动对焦程序对细胞的识别。通常情况下，为了尽量减少 X、Y、Z 方向的移动，即使载玻片上含有多个菌株，每次实验也最多只选择 10 个位置。
- 选定第一个细胞后，仅通过软件调节 Z 轴对焦。此后，除非显微镜的“Z 调焦旋钮”具备数字编码功能，否则不要手动调节显微镜本体上的 Z 轴旋钮。确保每次自动对焦完成后，软件均保存新的 X、Y、Z 位置。
- 在开始实验前，检查自动对焦设置是否适合当前实验。与明场或微分干涉差（DIC）显微镜相比，使用相差显微镜可能因对比度更高而改善自动对焦效果。然而，相差物镜中的相差环会降低其收集荧光信号的灵敏度（约降低 10%）。因此，对于荧光信号较弱的样品，更适合使用无相差环的物镜。
- 在实验运行稳定前，每隔半小时检查一次所选细胞是否仍处于焦点中。若此时发现细胞失焦，需进行手动调整。由于温度变化或样品干燥不充分，在实验初期数小时内可能需要此类调整。此外，视野中细胞数量越多，对比度越高，自动对焦的效果越好。
- 实验结束后，如有需要，将视频的不同通道分离开，并分别保存为独立文件（例如相差、GFP、mCherry）。某些采集软件会将所有通道保存在一个叠加的文件中。用于发表时，可通过二维去卷积（2D deconvolution）对图像进行增强处理，这对蛋白质定位研究尤为有用。可使用显微镜配套软件或商业软件（如 Huygens，www.svi.nl）对图像进行去卷积处理。
- 使用 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）（请使用未经处理的原始图像文件）和 Microsoft Excel 或 Sigma Plot 分析数据。在 ImageJ 中，图像堆栈可另存为“.avi”格式的视频文件。下文将详细描述如何随时间测量单个细胞的荧光强度。
4. 使用 ImageJ 分析启动子活性动态数据
我们注意到，目前还有其他优秀的软件包专门用于分析延时显微镜图像，例如 BHV 软件9, 4、Schnitzcell10、PSICIC11 和 Microbe-Tracker12，但本文重点介绍免费提供的 ImageJ 软件包。
- 下载 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）以及（如有必要）用于打开您（堆叠）文件的正确插件。例如，使用deltavision显微镜录制的视频只能通过deltavision opener插件在ImageJ中打开。将DV插件复制到ImageJ的插件文件夹中，然后启动程序。在编辑/选项/内存中调整内存容量&将线程数设置为1250，这使得能够处理更大的文件，例如从延时成像视频中获得的文件。
- 为评估单个细胞的细胞历史，打开一个微菌落的原始相差显微图像视频，并滚动至视频中感兴趣的最后一帧。在菜单中选择“分割线”选择按钮。
- 在背景处画一条线，然后按“CTRL” + “T”。这将打开感兴趣区域（ROI）管理器。（相应的背景荧光值可用于手动减去背景——见下文。或者，使用 ImageJ 内置的背景减除程序。）在目标细胞内同样画一条线，并将该 ROI 添加到 ROI 管理器中。由于本案例研究中检测的是启动子-GFP 融合蛋白，而 GFP 在细胞质中均匀分布，因此在整个细胞长度范围内，每个单像素的荧光值应大致相同。在时间轴上回退一帧，在同一目标细胞中选择一个新的 ROI。保存第三个 ROI，并继续此操作，直至保存视频第一帧中对应的 ROI。
需注意，细胞分裂后子代细胞的荧光强度可能存在显著差异。可选用一种可与细胞表达的荧光蛋白联合使用的膜染料（例如红色膜染料FM® 5-95（Invitrogen）和GFP）以观察隔膜形成。在此情况下，应使用相应的荧光通道而非相差显微图像序列来追踪细胞随时间的变化。或者，也可通过仅选择细胞一半区域的ROI来确保安全。 - 在 ROI 管理器中，点击“保存”。如果文件扩展名为“.roi”，则列表中仅选中一个 ROI，且仅保存该 ROI；如果文件扩展名为“.zip”，则将保存整个集合（必需）。
- 关闭相差显微镜视频，打开原始荧光视频（例如 GFP）。在 ROI 管理器中点击“显示全部”和“测量”，将弹出一个新窗口（结果）。将结果复制到 Excel 表格中，并从每个单细胞的平均荧光值中减去培养基的背景荧光值。所得净荧光值可对时间作图，以揭示目标细胞在时间进程中的启动子活性。
- 或者，可以在特定时间点分析微菌落中所有细胞的荧光强度。为此，需按照上述方法在某一帧图像中选择并保存背景区域以及每个单个细胞的感兴趣区域（ROI），将荧光值复制到 Excel 中，并利用“工具”菜单中的“直方图”功能生成直方图。
- 为获取用于发表的单帧图像，选择感兴趣的帧，点击“图像”-“复制图像”，然后通过选择“图像”-“类型”-“RGB 颜色”或“8 位”将图像类型更改为“RGB”或“8 位”。将复制的帧保存为“.tiff”格式。RGB/8 位图像可由常规绘图软件（如 CorelDraw 或 Adobe Illustrator）打开。如有需要，可在 ImageJ 中使用“图像”-“调整”-“亮度/对比度”或“图像”-“调整”-“窗宽/窗位”对图像进行调整。
5. 使用 ImageJ 制作用于发表的视频
- 在 ImageJ 中按照上述方法打开原始相差图像及对应的荧光视频文件。选择矩形选择工具（1st 在左侧）并在第一帧中绘制一个矩形选区（ROI），使得在整个视频过程中，发育中的微菌落始终被该选区包围。选择“图像”-“裁剪”，并将此较小版本的视频以新名称保存。在荧光视频中通过ROI管理器选择相同的ROI，并按前述方法进行后续操作。
- 若需将视频水平或垂直合并，请选择“plugin” - “stack combiner”。如需要，可通过“plugin” - “time stamper”添加时间戳。将合并后的图像序列分别保存为“.dv”或“.tiff”格式，以及“.avi”或QuickTime视频格式。
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的替代实验方案调整（图4和视频2）：
6. 准备 S. pneumoniae 培养物
- 培养 S. pneumoniae 细胞（有荚膜菌株 D39） 13，或非荚膜型R6菌株 14 在C+Y培养基中作为静置培养物 15 在 37°C 直至在A处的OD达到600 nm 约为0.4时停止。以14000 rpm离心2分钟，将细胞沉淀重悬于适量含14.5%甘油（v/v）的新鲜C+Y培养基中，使菌液A600 nm 精确为 0.4。分装细胞并储存在 -80°C 以备将来使用。
- 用于延时显微成像，取一份先前培养的样品 S. pneumoniae 细胞。用来自-的细胞以1:100的比例接种4 ml新鲜C+Y培养基80°C 分装。将细胞培养至对数中期，OD值达到A600 nm 0.1 - 0.2。通常使用来自-的细胞时，大约需要2小时80°C 等分试样
7. 显微镜样品的制备
- 按照上述方法制备显微镜载玻片 B. subtilis 但要确保琼脂糖中含有 C+Y 完全培养基。由于 S. pneumoniae 是一种微需氧菌，琼脂糖条带之间的空气 pockets 应比用于 B. subtilis （两侧各约 1 mm 的空间）
- 在600 nm处测定培养物的吸光度（A600)，将指数生长期的 S. pneumoniae 细胞稀释至约 A600 使用C+Y培养基将稀释度调整为0.05，并用此稀释液加载琼脂糖载玻片。
8. 时间序列相差显微镜观察
调整显微镜设置以观察S. pneumoniae：使用相差显微镜，因为S. pneumoniae在明场显微镜下难以识别。后续步骤按照B. subtilis的操作方法进行（执行步骤2.9–3.7）。S. pneumoniae可在30°C或37°C下培养（在37°C下生长更快）。
9. 代表性结果：
如果细菌生长形成一个微菌落单层，且在实验结束时完全位于视野范围内（见图5A-C），则时间序列荧光实验已成功完成。如果细胞相互重叠生长，不仅无法准确追溯其谱系历史，而且重叠细胞的荧光强度也无法正确测量。当点样的细胞未充分干燥（步骤2.9）或培养基成分需要调整以减缓生长速度时，细胞容易发生重叠生长。如果微菌落生长至视野之外，则无法确定单个菌落内部的荧光信号分布。造成“微菌落移动”的原因可能包括点样细胞干燥不充分（步骤2.9），或软件未设置为在发育过程中追踪微菌落。此外，必须确保培养基中不存在局部增强的荧光区域，因为这会干扰来自细胞的荧光信号（见图5D-F）。背景相关问题可能来源于培养基成分、气泡或未完全溶解的琼脂糖团块。为说明这一点，我们在图5F中展示了使用红色荧光染料的激发/发射滤光片拍摄时该载玻片的背景信号。可见存在明亮的自发荧光斑点，可能影响成像效果。为避免此类斑点，请确保琼脂糖完全溶解，并在盖玻片放置于载玻片上时无气泡产生。
图 1：实验概述
图 2：显微镜样品的制备
图3：携带 PkinB-gfp 融合基因的 B. subtilis 细胞的延时荧光显微观察。图像选自视频1。上排图像：明场，下排图像：GFP通道。
图4： 延时相差显微镜观察 S. pneumoniae 野生型菌株 R6。图像截取自视频 2。
图 5： 可能的（延时）显微成像结果示意图。A–C 展示了使用透射光设置获取数据时需考虑的因素。（A）处于孢子形成阶段的 B. subtilis 细胞微菌落单层的明场显微图像（理想结果）；（B）B. subtilis 微菌落的明场图像，其中部分细胞叠加生长（非理想结果）；（C）孢子形成阶段的 B. subtilis 微菌落生长超出焦平面范围的明场图像（非理想结果）。D–F 展示了使用落射光设置获取数据时需考虑的因素。（D）指数生长期 B. subtilis 细胞的相差图像，用于说明 E 和 F 中荧光信号的来源；（E）D 中所示细胞的 GFP 荧光信号。注意背景信号在各个像素中较为均匀（理想结果）。同时请注意曝光时间可能过长，因一个细胞显示出信号饱和（非理想结果）；（F）通过红光通道获取的 D 中所示细胞的信号。注意背景中存在红色荧光水平升高的区域（非理想结果）。
视频 1. 携带 PkinB-gfp 融合基因的 B. subtilis 细胞的时间推移荧光显微镜观察。图像以每 8 分钟一次的间隔拍摄。左侧：明场，右侧：GFP 通道。点击此处观看视频。
视频 2. 延时相差显微镜观察 S. pneumoniae 野生型菌株R6。每隔10分钟拍摄一次图像。 单击此处观看视频。
讨论
与其他许多单细胞技术不同，此处所述的时间序列荧光显微镜方法可用于追踪特定细胞的谱系历史、行为特征及分裂事件。结合荧光标记的靶向启动子或蛋白质，可在细菌发育过程中实时监测特定发育通路的激活情况，以及蛋白质的定位和动态变化。
如上所述，通过根据特定细菌的需求调整培养条件，可对不同细菌种类开展研究。我们遇到的唯一限制与生长条件和样品规模有关。由于环境密闭，实验过程中无法改变培养基条件。此外，每次实验最多可有效监测四种菌株。
考虑到一些关键步骤，此处描述的单细胞分析方法可轻松应用于任何自动显微镜。以下将概述这些关键步骤，详细信息请参见正文。常规准备：实验前检查特定细菌所需的自动对焦设置是明智之举。同样，如果可能，应提前确定荧光可视化的大致最佳设置。此外，遵循预先制定的时间表有助于及时准备好所有材料（例如提前预热显微镜腔室、编程显微镜参数、在细胞达到所需生长期前一小时制备载玻片，见图1）。B. subtilis 在TLM和CDM中的培养：TLM和CDM是化学成分明确的饥饿培养基，在其中B. subtilis仅缓慢生长。根据具体菌株的不同，细胞在培养基中的培养时间可能需要延长。缓慢生长可防止细胞相互堆叠。显微镜样品的制备：必须避免基因框架、载玻片与盖玻片之间产生气泡，以防止基于琼脂糖的培养基过度干燥。培养基与盖玻片界面同样需要注意。必须让细胞充分干燥，以防止细胞游动或形成多层生长。延时荧光显微镜观察：载玻片及环境腔室的预热至关重要，可避免严重的自动对焦问题。应选择位于琼脂垫中央的细胞，因为这些细胞在实验过程中最有可能保持在视野和焦平面内（前提是样品已充分干燥）。每项实验最多设置10个位置仍可正常工作。选定第一个目标细胞后，仅使用软件调节焦距（详见正文）。在实验开始的数小时内，应每隔30分钟检查一次细胞是否仍处于焦平面内。分析：在进行大规模分析之前，必须检查培养基背景在各荧光通道中的信号值是否相近。微小灰尘颗粒、培养基成分、镜头污渍或微小的琼脂糖团块可能导致局部荧光信号升高，从而使视频难以甚至无法分析。故障排除：若观察到细胞相互堆叠生长，可能是由于盖玻片过早封固，或培养基不适合微菌落单层生长。若目标细胞持续过早死亡，而载玻片上其他细胞正常分裂，则应检查是否已正确安装紫外滤光片。此外，在长时间实验中缩短曝光时间或降低光照强度也可能有所帮助。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
JWV 课题组的研究工作得到了欧盟玛丽·居里回归基金、Sysmo2 项目资助（NWO-ALW/ERASysBio）、Horizon 项目资助（ZonMW）以及 VENI 青年学者基金（NWO-ALW）的支持。OPK 课题组的研究工作得到了多项 STW 项目资助（NWO）、SYSMO1（IGdeJ）和 SYSMO2 项目资助、ESF Eurocores SynBio 项目资助（SynMod），以及 Kluyver 工业发酵基因组学研究中心和食品与营养顶尖研究所的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基因框 | ABgene有限公司 | AB-0578 | 1.7 × 2.8 厘米 |
| 高分辨率低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| 大片盖玻片 | 多家供应商 | 24 x 50 毫米 | |
| 如需要，可使用膜染料，例如 FM 5-95 | Invitrogen | T23360 | 其他膜染料也可使用： http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf |
| 带有环境培养室的延时显微镜 | 多家供应商 | 在相应章节中查看我们设备的详细信息 |
参考文献
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