使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

Abstract

来源： Daniele， F.， et.al TIRFM 和 pH 敏感的 GFP 探针评估 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞中的神经递质囊泡动力学：细胞成像和数据分析。J. Vis. Exp.(2015).

本视频演示了使用全内反射荧光 （TIRF） 显微镜对人神经母细胞瘤细胞进行成像，以观察荧光团标记的突触囊泡。细胞首先以落射荧光模式聚焦。然后进行调整以实现全内反射，产生选择性激发膜附近荧光团的消逝波。在 TIRF 成像之前，需要配置采集参数并设置采样频率。

Protocol

1. 细胞培养和转染

1. SH-SY5Y 细胞培养
   注：实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y （ATCC# CRL-2266） 进行。SH-SY5Y 细胞以漂浮簇和贴壁细胞的混合物形式生长。按照方案中报告的说明（细胞密度、分流率等），使生长的细胞牢固地附着在玻璃盖上，这对于全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 至关重要。<>
2. 开始之前，在层流生物安全柜下，制作适当体积的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液和培养基。
   1. 制备 50 ml 浓度为 150 mM 氯化钠 （NaCl）、24 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的 PBS。筛选解决方案。
   2. 用 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 制备 50 ml 细胞培养基，其中含有高葡萄糖、10% 热灭活胎牛血清 （FBS）、青霉素 （100 U/ml）、链霉素 （100 μg/ml）、L-谷氨酰胺 （2 mM） 和丙酮酸钠 （1 mM）。筛选解决方案。
3. 取出完全生长培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
4. 将细胞与 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA）（用于 6 cm 培养皿）在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 5 分钟，并使用移液器分离细胞。
5. 通过加入 2 ml DMEM 灭活胰蛋白酶，并通过以 300 x g 离心 5 分钟来收集细胞。
6. 去除上清液，向沉淀中加入 1 ml DMEM，并上下移液溶液以将细胞分散到单细胞悬液中。
7. 将它们在含有 3 ml 完全培养基的新 6 cm 直径培养皿中以 1：4 的比例分开。将细胞维持在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中，在 6 cm 直径的培养皿中培养。每周传代培养一次，或当它们覆盖了 80 - 90% 的表面积时。

用于成像的 SH-SY5Y 细胞电镀

1. 对于 TIRFM 实验，将平板细胞放在玻璃盖上。采用厚度为 0.17 ± 0.005 mm、折射率为 1.5255 ± 0.00015 的玻璃盖板。在开始之前，请按如下方式准备玻璃盖玻片：
   1. 用 90% 乙醇过夜 （O/N） 清洁玻璃盖。
   2. 用蒸馏水彻底冲洗（三次更换蒸馏水）。在干燥箱中干燥玻璃盖。
   3. 将盖子放在玻璃培养皿中，并在预热的 200 °C 烘箱中消毒 3 小时。
2. 转染前一天，将每个盖玻片放入 3.5 cm 培养皿中，加入 1 ml 培养基，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育。
3. 如步骤 1.1.3 - 1.1.5 中所述对细胞进行胰蛋白酶消化，将细胞沉淀悬浮在 1 ml 完全培养基中，并计数。计算添加到每个培养皿中的正确细胞悬液体积，以产生 3 x 10⁵ 个细胞/孔。该密度是最佳细胞生长和高效转染所必需的。在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 O/N。

聚乙烯亚胺 （PEI）
注：为了可视化突触囊泡动力学，使用了含有突触 pHluorin 的 pCB6 载体。突触-pHluorin 是通过绿色荧光蛋白 （GFP） 的 pH 敏感变体和囊泡膜蛋白突触蛋白 2 的框内融合产生的。该构建体已被广泛用于研究神经元内的突触小泡特性。

1. 在开始转染之前，制备 10 ml 以下溶液。将溶液最多保留 1 个月。
   1. 制备 150 mM NaCl 溶液。用 0.01 N 盐酸 （HCl） 调节至 pH 5.5。
   2. 在 150 mM NaCl 溶液中制备 10% 聚乙烯亚胺（PEI;25 kDa 线性）的 PEI 溶液。溶液的 pH 值上升到 8.8。用 0.01 N HCl 将 pH 调节至 7.8。
2. 铺板 24 小时后，去除培养基，用 1.5 mL 完全培养基刷新。将细胞保存在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中。
3. 在层流生物安全柜下，在 1.5 ml 微量离心管中，每 3.5 cm 培养皿中加入 3 μg 质粒 DNA 到 25 μl 150 mM NaCl 溶液和 100 μl PEI 溶液中。
4. 涡旋 10 秒，然后在室温 （RT） 下孵育 DNA/PEI 混合物 30 分钟。
5. 小心地将 DNA/PEI 混合物添加到含有细胞盖玻片的培养皿中，并轻轻摇动以使试剂均匀分布在培养皿中。
6. 4 小时后，更换培养基并将细胞 O/N 在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育。转染后 24 - 48 小时进行成像实验。

2. 通过 TIRFM 成像进行细胞成像

1. 设置
   1. 使用图 1 中描述的设置执行 TIRF 成像。它包括一个电动倒置显微镜（图 1，插图 A）、激光源（图 1，插图 B）和 TIRF 滑块（图 1，插图 C）。通过高数值孔径 （NA 1.45 Alpha Plan-Fluar） 100X 油浸物镜达到 TIRFM 照明。
   2. 对于 TIRFM 照明，使用多线 （458/488/514 nm） 100 mW 氩离子激光器。使用单模光纤，通过 TIRF 滑块将线偏振激光引入光束路径。将 TIRF 滑块插入反射光束路径的光阑平面。
      1. 对于宽视场照明，将显微镜连接到传统的汞短弧灯 HBO 白光灯。滑块中的保偏双棱镜确保 TIRF 照明和白光同时结合。
   3. 使用安装在滤光片轮上的激发滤光片（带宽 488/10 nm）过滤激光并引入激光路径。采用高速软件控制快门，可快速控制激光照明。对于 pHluorin 分析，安装带通 525/50 nm 发射滤光片。使用 Image ProPlus 软件在制冷型 Fast CCD 相机上拍摄数字图像（512 x 512 像素）。
2. 实现 TIRF 照明（图 2）
   1. 打开激光器、计算机、相机、滤光轮和快门控制器;然后，等待 20 分钟后再开始实验，因为激光器需要预热和稳定。
   2. 在成像之前，请适当地制作以下解决方案。<>制作
   3. 50 ml 克雷布斯 （KRH） 溶液，加入 125 mM NaCl、5 mM 氯化钾 （KCl）、1.2 mM 硫酸镁 （MgSO₄）、1.2 mM 磷酸二氢钾 （KH₂PO₄）、25 mM 4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸 （HEPES）（缓冲至 pH 7.4）、2 mM 氯化钙 （CaCl₂） 和 6 mM 葡萄糖。
   4. 在 80 mM NaCl、50 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、25 mM HEPES（缓冲至 pH 7.4）、2 mM CaCl₂ 和 6 mM 葡萄糖中制备 10 ml KCl-KRH 溶液（pH 7.4）。
3. 取下装有转染细胞的玻璃盖，并将其插入适当的成像室中。组装腔室并在玻璃杯中心加入 500 μl KRH 溶液。
4. 在物镜上加油。将成像室放在显微镜的载物台上，并将物镜置于玻璃盖玻片下方。将保险盖放在样品上。
5. 在落射荧光模式下，聚焦于盖玻片（上表面）并选择放置在腔室中心的转染细胞。选择使用低于 80 毫秒的曝光时间可以清晰记录荧光信号的细胞。
6. 在软件控制下，在实时模式下切换到 TIRF 照明。
7. 要设置 TIRF 配置，请检查从样品盖上的物镜中出来的光束的位置（图 2B）。当光束位于物镜的中心时（图 2A，左），在 TIRF 样品盖的中心可以看到一个点（图 2B，左），并且细胞在落射荧光模式下成像（多个聚焦平面，高背景荧光;图 2C，左）。
8. 要达到临界角度，请沿 Y 方向移动聚焦点（向前或向后;图 2B，中）使用 TIRF 滑块上的角度调节螺钉（图 1C）。当光束以大于临界角的角度会聚在样品平面上时（图 2A，右），光斑消失，并且在样品盖的中间可以看到一条细直的聚焦线（图 2B，右）。
9. 要微调 TIRF 角度，请使用电池样品（图 2C）。观看视频中的荧光图像。在这个阶段，仍然可以看到类似落射荧光的图像。轻轻移动螺钉，直到达到 TIRF 条件：只有细胞的一个光学平面聚焦（即，与盖玻片接触的质膜）。这会产生具有高对比度的平面图像（图 2C，右）。

采样 imaging

1. 设置单通道延时实验。为了最大限度地减少光漂白，请使用低曝光时间和高增益来捕获图像。适当的曝光时间在 40 - 80 毫秒之间。以 1 - 2 Hz 采样频率采集图像。在较高频率 （10 Hz） 下采样时，囊泡动力学可能更容易理解。常规观察时间通常为 2 分钟。

Results

图 1.TIRF 显微镜设置。TIRF 显微镜系统的示意图和图像（插图）。该装置包括 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜 （A）、多线 100 mW 氩离子激光器 （B） 和 TIRF 滑块 （C）。显示激光（绿线）和白光（黄线）。使用 100 × 油浸物镜对细胞进行成像。数字图像在制冷型 RetigaSRV Fast CCD 相机上捕获。图中显示了反射器模块、发射 （488/10 nm） 和激发（波段通过 525/50 nm）滤光片、准直器 （L1） 和聚焦 （...

Materials