通过实验操控体型大小以估算形态缩放关系 果蝇

摘要

形态比例关系可捕捉并描述生物体的形状。本文介绍一种方法，用于测量完全变态昆虫在自然体型范围内形态比例关系的变化。通过简单的饮食调控，我们扩大了性状尺寸的分布范围，从而能够准确描述形状与尺寸之间的协变关系。

摘要

身体各部分的缩放比例是动物形态学的一个核心特征^1-7。在同一种物种内，形态特征必须与身体保持正确的比例，才能保证生物体的正常功能；通常个体越大，其身体各部分也越大，个体越小则身体各部分也越小，从而在不同成体体型范围内维持整体身体形状的一致性。由于对正确比例的要求，同种内的个体通常在相对性状大小上表现出较低的变异。相反，不同物种之间的相对性状大小可能存在显著差异，这是产生形态多样性的主要机制之一。一个多世纪以来的比较研究已经确立了这些种内和种间的模式规律^3,4。

描述这种变异最常用的方法可能是利用异速生长方程 y=bxα 来计算两个形态性状大小之间的比例关系，其中 x 和 y 分别代表两个性状的大小，例如器官大小与体形大小^8,9该方程描述了组内（例如物种、种群）两个性状在大小变化时的缩放关系。对该方程取对数变换可得到一个简单的线性方程：log(y) = log(b) + αlog(x)。同一物种不同个体间各性状大小的双对数图通常呈现线性缩放关系，其截距为 log(b)，斜率为 α，后者称为“异速生长系数”。^9,10不同类群间的形态差异通过特定性状对的异速生长关系截距或斜率的差异来描述。因此，异速生长方程参数（b 和 α）的变化能够简洁地描述在生物类群内及类群间器官大小与体形大小关系中所反映的形态变异（参见 ^11,12).

并非所有性状都与其他性状或体型呈线性关系（例如^13,14）。因此，当数据涵盖性状大小的完整范围时，形态学上的比例关系才最具信息量。本文描述了如何通过简单的饮食实验操控来产生昆虫的完整体型范围。这使得可以估算任意一对性状之间的完整比例关系，从而全面描述形态如何随体型变化，并实现不同生物类群间比例关系参数的稳健比较。尽管我们以果蝇（Drosophila）为重点，但该方法应几乎适用于任何完全变态昆虫。

方案

1. 饲养及调控饮食以产生体型和翅大小的变异

原理与概述。 缩放关系的表达最终取决于产生器官和个体最终大小变异的发育调控过程。这些过程在完全变态（即全变态）昆虫（如 D. melanogaster）中的研究最为深入，其器官在类似蛆的幼虫体内以未分化的“成虫盘”形式生长^11,15-17。在果蝇（Drosophila）中，器官和个体的最终大小由幼虫阶段的生长过程调控；幼虫在经历一龄和二龄幼虫期后，于三龄幼虫初期达到羽化所需的最小可存活体重（MVW_E）¹⁸。在达到MVW_E之前若遭遇饥饿，将无法完成成虫羽化。然而，若在达到MVW_E后才遭受饥饿，仍可发育为可存活的成虫，尽管体型极小。这是因为发育过程中营养减少会降低最终的个体和器官大小，这一现象不仅存在于果蝇中，也几乎普遍存在于所有动物中^19-21。通过在达到MVW_E之后、化蛹之前调控食物供应，可诱导出极为显著的体型表型可塑性，其变异程度远超其他变异来源（例如个体间的遗传差异）。

1. 从待表型分析的果蝇群体中收集卵，每50枚分为一组，置于含有10 mL标准果蝇培养基的小瓶中。由于产卵持续进行，需每隔24小时收集一次卵，连续三天，共获得三个不同年龄的组群。
2. 当最年长组群达到游走期或刚开始化蛹时，开始进行饮食干预。此时，最年长组群已远超过最小可存活体重（MVW_E），最年轻组群则非常接近MVW_E，而中间组群则处于两者之间。因此，在此时间点撤除食物后，最年长组群将发育为体型非常大的成虫，最年轻组群将发育为体型非常小的成虫，中间组群则发育为中等体型的成虫。为将幼虫从培养瓶中取出，向所有小瓶中加入约5 mL的40%蔗糖溶液。随后将培养基置于摇床上，以中等速度振荡15–20分钟，以充分释放幼虫。
3. 用细毛笔（00号）将漂浮在蔗糖溶液中的幼虫取出，转移至含有湿润棉塞的小瓶中，使其正常化蛹。或者，也可将幼虫置于含有非消化性食物添加剂（如甲基纤维素²²）的环境中。

2. 体型估计

原理与概述。先前的研究表明，胸部长度作为整体体型的替代指标并不理想²²。因此，我们采用蛹的体型作为衡量个体体型的指标。最大体型在化蛹前停止摄食时即已确定。因此，蛹的体型与成虫体型之间存在高度相关性²³。

1. 将蛹腹面朝上放置在玻璃载玻片上，并使用连接体视显微镜的数码相机进行成像。每张图像被采集后，分配一个唯一的识别编号，并通过数码相机与计算机之间的实时连接传输至计算机。
2. 成像后的蛹被转移至单独的2 ml离心管中，每个离心管内含1 ml果蝇培养基，并用对应个体的唯一编号标记，管壁打孔以通气，实现气体交换。
3. 蛹的大小通过蛹轮廓的像素数量来估算。也可使用其他尺寸测量指标。

3. 性状（翅）大小的估算

原理与概述。为了成像翅膀，我们使用一种“翅膀抓取装置”²⁴，该装置可将一只活体、麻醉后的果蝇的翅膀从其身体垂直拉出并固定。将翅膀夹在两片玻璃之间，使其能够以二维结构进行成像。

1. 用 CO₂ 轻微麻醉果蝇，并将其置于体视显微镜下的翅夹装置中，该显微镜配备有连接至计算机的数字相机。
2. 对翅进行成像，并以该个体的唯一编码保存图像。
3. 翅的大小可通过包绕边缘固定标志点的最小凸多边形来估算，或通过翅轮廓的像素计数来测定。

4. 标度关系估计

1. 数据合并来自不同队列，但按性别分组并进行对数转换。
2. 利用 II 型（即简化主轴）回归对体型数据拟合尺度关系（见参考文献¹²中的综述），并估计每组的参数。

5. 代表性结果：

我们的饮食调控将产生一系列不同的体型大小（图1）和性状大小（图2）。将对数转换后的性状相互作图，可以揭示特定生物类群内性状间的协变模式，并允许对类群拟合异速生长关系（图3）。提取描述形态随体型变化规律的异速生长关系参数，可实现不同类群间形态与体型协变方式的比较。

图 1. 通过在个体达到 MVW_E 后调控饮食所获得的极端大小分布的蛹。左侧显示实际蛹的图像，右侧为其对应的轮廓图，用于测量蛹的大小。比例尺为 1 mm。

图 2. 在个体达到MVW_E后，通过饮食调控产生极端体型分布的翅。左侧显示实际翅图像，右侧为其对应的轮廓图，用于翅大小的测量。比例尺为1 mm。

图3. 按性别划分的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）翅与体型大小的缩放关系。对每种性别的个体进行对数转换的数据展示：幼虫期充分喂养（深色圆圈）、饥饿一天（灰色圆圈）或两天（空心圆圈）。每种性别的 II 型回归线已标出。在各年龄组之间，平均翅面积分别下降约 0.1 mm（约 7%）和约 0.2 mm（约 8%），从而扩大了所观察表型的总体范围。回归分析显示，雌性在此缩放关系中略呈低速异速生长（斜率为 0.96），而雄性则略呈高速异速生长（斜率 1.06）。

讨论

形态比例关系在进化生物学中已近一个世纪以来一直是深入研究的课题。近年来，生长与比例调控的直接机制在发育、生理学和遗传学领域变得愈发重要（例如，参见文献^12,15,23-25的综述）。我们的方法能够估算在整个性状和体型大小范围内形态比例关系。这一点可能非常重要，因为性状大小与体型之间可能并非呈线性比例关系（例如，参见文献^13,14）。然而，如果动物仅在理想的实验室条件下饲养，这种非线性关系可能并不明显。

尽管我们的实验方案最初是为估算黑腹果蝇（Drosophila）中翅与体形大小的缩放关系而设计的，但通过针对特定性状的适当修改，也可用于估算果蝇中任何形态性状的缩放关系。类似地，饮食调控方法或许还可用于在其他完全变态昆虫中产生完整的性状和体形大小范围；此类应用只需明确个体发育过程中何时达到最小 viable 体重（MVW_E），并在该时间点实施相应的调控操作即可。