可视登革病毒通过的Alexa Fluor标签

Summary

利用荧光的发展和成像技术，简单的方法，设计可视化早期病毒与细胞之间的相互作用的病毒，登革热的Alexa Fluor标签的进步。

Abstract

感染的结果，在病毒与细胞之间的相互作用的早期事件，可以有深远的影响。确定这种相互作用的影响因素可能会导致改善对疾病发病机理的认识，从而影响疫苗或治疗方案设计。因此，发展的方法来探测这种互动将是有益的的。在荧光团的发展^1-3和成像技术^，4最新进展，可以被利用来提高我们现有的知识对登革热的发病机制，从而铺平了道路，以减少每年发生登革热感染数以百万计的。

笼罩登革热病毒有一个外部的脚手架90包膜糖蛋白（e）保护核衣壳外壳的二聚体，其中包含一个正链RNA基因^组的5组成。病毒表面上的相同的蛋白质亚基，从而可以与胺反应染料标记，并通过免疫荧光显微镜观察。在这里，我们提出了一个标签的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯染料直接溶解，取得了高度可行的病毒后，标签中的碳酸氢钠缓冲登革热病毒的简单方法。没有标准化程序的活病毒和现有的制造商的协议，对蛋白质的标签，通常需要染料在二甲基亚砜重组标签。二甲基亚砜的存在，即使在微量，可以阻止生产的病毒感染，也能诱导细胞的细胞毒^作用 6 。排除使用在本议定书中的二甲基亚砜，从而降低了这种可能性。的Alexa Fluor染料具有优异的耐光性和低于常见的染料，如荧光素^和罗丹明2，pH敏感，使他们的病毒对细胞的吸收和内体运输研究的理想。的Alexa Fluor染料的共轭不影响病毒特异性抗体，并在宿主细胞^内 7公认的受体的识别标记的登革热病毒。这种方法可以在病毒学研究中的有用的应用程序。

Protocol

1。登革热病毒的Alexa Fluor标签

1. 标记反应之前，净化与蔗糖垫层登革热病毒，并准备必要的试剂和设备，在协议中表示。
2. 准备新鲜0.2M碳酸氢钠缓冲液，pH值8.5（标签缓冲区），1.5M羟胺缓冲液，pH 8.3（停试剂），之前的标签和过滤0.2μm的注射器过滤器消毒。
3. 淡化约3X10 ⁸斑形成单位（PFU）登革热病毒的纯化标签在2毫升管的缓冲1毫升。这可缩放比例为一批病毒标签。
4. 重组冻干的Alexa Fluor 594标记缓冲液立即标记反应前的琥珀酰亚胺酯（AF594）到1mm。根据人的需要，可以使用的Alexa Fluor染料系列荧光。尽量减少暴露在光线下这一步起。
5. 枪头轻轻的搅拌，添加1MM AF594染料100μL稀释病毒。
6. 在室温下孵育标签在黑暗中反应1小时组合。由每15分钟的温和的倒置混合。
7. 在台式离心机旋转管简单，枪头轻轻的搅拌，添加停止试剂100μL反应混合物。
8. 在室温下孵育在黑暗中增加一小时。由每15分钟的温和的倒置混合。

2。净化的Alexa Fluor标记的登革热病毒

1. 与此同时，平衡与选择的缓冲区纯化柱。在这个实验中，PD - 10柱25毫升HNE缓冲区（5MM HEPES，150mm的氯化钠，EDTA的0.1MM），pH值7.4，在使用前平衡。

Discussion

虽然本报告中使用AF594染料，荧光团的Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯系列广泛提供类似的标签化学。这可能会延长超越成像标签的应用。作为替代估计可兴奋和流式细胞仪机检测荧光团的标签程度的共聚焦显微镜，流式细胞仪可用于。

的Alexa Fluor染料小分子的反应，与游离氨基酸组，主要是精氨酸和赖氨酸^9，一般向外面临的蛋白质残留。在我们的实验室，100μm的登革热病毒的Alexa Fluor 594染料的共轭成像提供足够的亮度与病毒滴度的损失降到最低。不同亮度，可实现不同浓度的染料。然而，染料浓度的增加可以减少病毒的^生存能力 7,10 。一个可能的限制是在受体结合，由于封锁的荧光团访问干扰。因此，根据实际应用，标签的最佳水平来确定，以确保标签和功能abrogation10的程度之间的平衡。千万注意，浓度也被包装后的反应性影响的Alexa Fluor琥珀^酰亚胺酯8。

与这里介绍的Alexa Fluor染料登革热病毒的直接标记不要求任何额外的标签步骤，以可视化的病毒，.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
碳酸氢钠	Sigma - Aldrich公司	S6297
胲	Sigma - Aldrich公司	159417
氢氧化钠	默克公司	106498
AF594琥珀酰亚胺酯	分子探针，Invitrogen公司	A20004
PD - 10柱	GE医疗集团	17-0851-01
HEPES	Sigma - Aldrich公司	H6147
氯化钠	Sigma - Aldrich公司	S3014
EDTA	Sigma - Aldrich公司	E9884
M - 199	Invitrogen公司	11150
胎牛血清	Hyclone公司	SH30070.03
4孔板	NUNC	176740
盖玻片	Einst	0111520
显微镜幻灯片	赛欧品牌	7105
3H5杂交瘤细胞	ATCC	HB46
10X PBS	第一基地	BUF - 2040 - 10X1L
皂素	Sigma - Aldrich公司	S4521
牛血清白蛋白	Sigma - Aldrich公司	A7906
氯化镁	Sigma - Aldrich公司	M2670
氯化钙	Sigma - Aldrich公司	C3306
Paraformaldehye	Sigma - Aldrich公司	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma - Aldrich公司	D27802
台式离心机	Eppendorf公司	5424
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 710