利用荧光染料开发和成像技术的进步，我们设计了一种简单的Alexa Fluor标记登革病毒的方法，以观察病毒与细胞之间的早期相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
病毒与细胞相互作用的早期事件可能对感染结局产生深远影响。确定影响这种相互作用的因素，有助于更深入地理解疾病的发病机制，从而影响疫苗或治疗方案的设计。因此，开发用于探究这种相互作用的方法将具有重要意义。近年来荧光染料的开发1-3和成像技术的进步4可被加以利用，以增进我们对登革热发病机制的认识，进而为减少每年发生的数百万例登革热感染铺平道路。
登革热病毒具有包膜，其外部支架由90个包膜糖蛋白（E）二聚体组成，用于保护含有单股正链RNA基因组的核衣壳壳层5。因此，病毒表面相同的蛋白亚基可用胺反应性染料进行标记，并通过免疫荧光显微镜观察。本文介绍一种简便的标记方法，即将Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯染料直接溶解于碳酸氢钠缓冲液中，用于登革热病毒的标记，标记后病毒仍保持高度活性。目前尚无针对活病毒标记的标准化操作流程，现有染料生产商提供的蛋白标记方案通常要求将染料重悬于二甲基亚砜中。然而，即使微量的二甲基亚砜也可能抑制病毒的有效感染，并诱导细胞毒性6。本方案避免使用二甲基亚砜，从而降低了上述风险。与荧光素和罗丹明等常用染料相比，Alexa Fluor染料具有更高的光稳定性和更低的pH敏感性2，因此非常适合用于研究病毒的细胞摄取及内涵体运输过程。Alexa Fluor染料的偶联并不影响病毒特异性抗体及其在宿主细胞中假定受体对标记后登革热病毒的识别7。该方法在病毒学研究中具有广泛的应用价值。
方案
1. 登革病毒的Alexa Fluor标记
- 在标记反应前，使用蔗糖垫纯化登革病毒，并按照方案准备所需的试剂和设备。
- 在标记前即刻配制新鲜的 0.2 M 碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5，标记缓冲液）和 1.5 M 盐酸羟胺缓冲液（pH 8.3，终止试剂），并使用 0.2 μm 注射器滤器过滤除菌。
- 在 2 ml 离心管中，将约 3×108 斑块形成单位（pfu）的纯化登革病毒溶于 1 ml 标记缓冲液中。可根据需要按比例放大以进行批量病毒标记。
- 在标记反应前立即用标记缓冲液将冻干的 Alexa Fluor 594（AF594）琥珀酰亚胺酯重悬至 1 mM。根据需要也可选用 Alexa Fluor 染料系列中的其他荧光染料。从该步骤开始应尽量避免光照。
- 在轻轻用移液枪头搅拌的同时，向稀释后的病毒中加入 100 μl 的 1 mM AF594 染料溶液。
- 将标记反应混合物在室温下避光孵育 1 小时，每 15 分钟轻柔颠倒混匀一次。
- 将离心管在台式离心机中短暂离心，然后在轻轻搅拌的同时向反应混合物中加入 100 μl 终止试剂。
- 继续在室温下避光孵育 1 小时，每 15 分钟轻柔颠倒混匀一次。
2. 纯化Alexa Fluor标记的登革病毒
- 在此期间，用选定的缓冲液平衡纯化柱。本实验中，使用 25 ml HNE 缓冲液（5 mM Hepes、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA），pH 7.4，对 PD-10 柱进行平衡，然后使用。
- 将标记的病毒加至柱顶部，当标记病毒进入基质后，开始收集流穿液。待所有标记病毒进入基质后，用 HNE 缓冲液充满柱子。弃去前 2.5 ml 流穿液，收集接下来的 2 ml 标记病毒组分。
- 将纯化的 AF594 标记登革病毒分装，并于 -80°C 避光保存。
- 解冻一份样品，并在使用标记病毒批次前，通过空斑实验测定其滴度。
- 在感染前一天，将 Vero 细胞以每孔 5×104 的密度接种于含盖玻片的 4 孔板中，细胞使用 M-199 生长培养基培养。
- 移除孔内培养上清，加入 100μl 标记病毒（根据需要以 M-199 维持培养基稀释），感染复数为 1，在 37°C 下感染 10 分钟。
- 移除接种物，用 1×PBS 洗涤盖玻片两次。
- 用 3% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟。
- 用 1×PBS 洗涤盖玻片 3 次。
- 使用含 0.1% 皂苷和 5% BSA 的 1×PBS 渗透液处理细胞 30 分钟以实现细胞通透。
- 在避光湿润环境中，加入未稀释的 3H5 单克隆抗体杂交瘤培养物经离心澄清后的上清液，孵育 1 小时。
- 用洗涤缓冲液（含 1 mM 氯化钙、1 mM 氯化镁和 0.1% 皂苷的 1×PBS）洗涤盖玻片 3 次。
- 在避光湿润环境中，加入以渗透液按 1:100 稀释的 AF488 标记抗小鼠 IgG 抗体，孵育 45 分钟。
- 用洗涤缓冲液洗涤盖玻片 3 次，再用去离子水冲洗一次。
- 用纸巾轻蘸盖玻片边缘以吸除多余水分，然后滴加 8μl 含 2.5% Dabco 的 Mowiol 4-88 封片剂，将盖玻片封于载玻片上。
- 将封片样品置于 4°C 过夜，使其充分固化，随后使用 Zeiss 共聚焦显微镜观察。应依次激发单一荧光染料，并同步切换检测器进行连续图像采集。
- 使用 Zeiss LSM Zen 软件分析 E 蛋白抗体染色与标记病毒的共定位情况，以评估标记程度。
3. 代表性结果
图2展示了用AF594染料标记登革病毒的产量示例。通常，成功标记后，滴度下降应小于10倍。但需要注意的是，所有缓冲液必须新鲜配制，以确保标记成功；Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯在重组后应立即使用，因为它们在水溶液中会水解为无反应活性的游离酸8。
接下来，在将标记的病毒用于实验之前，需要检测其荧光强度是否足够。在Vero细胞上进行了一项简单的免疫荧光检测，通过观察标记病毒与抗E蛋白抗体染色的共定位情况，可评估标记程度。研究人员检查了多个细胞，典型的共聚焦图像如图3所示。使用LSM Zen软件对图像进行共定位分析，结果显示重叠系数在0.65至0.8之间，表明约有65%至80%的病毒颗粒被荧光染料成功标记。
图1. 登革病毒Alexa Fluor染料标记流程的总体示意图。 首先，配制相应的缓冲液并准备纯化的登革病毒。将Alexa Fluor染料溶解后，加入到标记缓冲液中稀释的登革病毒中。反应1小时后，加入终止试剂终止反应。随后，通过尺寸排阻层析柱纯化标记后的病毒，以去除游离染料。最后，通过蚀斑实验重新测定标记病毒的滴度，并检测其荧光特性。
图 2. 通过蚀斑分析法测定登革病毒在 AF594 标记前后具有感染性的病毒颗粒平均数量（pfu/ml）。 取一份 AF594 标记的登革病毒样品解冻后重新进行蚀斑分析滴定，其滴度通常较标记前下降不到 10 倍。误差线表示两个重复样本的标准偏差。
图3. Vero细胞中AF594标记与登革病毒E蛋白的共定位。 前一天在盖玻片上培养的细胞以MOI为1的AF594标记登革病毒在37°C感染10分钟。随后将细胞固定并用抗E蛋白抗体标记，检测E蛋白（绿色）与AF594标记（红色）的共定位情况。使用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜在63倍放大倍数下观察荧光信号。比例尺为10μm。黄色区域表示共定位，如插图所示。
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讨论
尽管本报告中使用了AF594染料，但Alexa Fluor琥珀酰亚胺酯系列中还有多种具有类似标记化学性质的荧光染料可供选择。这可以将标记应用扩展到成像以外的领域。对于可被流式细胞仪（FACS）激发并检测的荧光染料，可采用流式细胞术作为共聚焦显微镜的替代方法来评估标记程度。
Alexa Fluor 染料是可与游离氨基（主要为精氨酸和赖氨酸）发生反应的小分子9，通常为蛋白质的外向残基。在本实验室中，将登革病毒与100μM Alexa Fluor 594染料偶联，可在病毒滴度损失最小的情况下提供足够的荧光亮度用于成像。通过调整所用染料的浓度，可获得不同的荧光强度。然而，提高染料浓度可能会降低病毒的活性7,10一个可能的局限性是荧光染料可能阻碍受体结合，从而干扰其结合能力。因此，根据具体应用，应确定最佳标记程度，以在标记效率与功能活性丧失之间取得平衡10。请注意，Alexa Fluor 琥珀酰亚胺酯在包装后的反应性也可能影响其浓度8.
本文所述的登革病毒直接标记方法使...
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致谢
本工作由新加坡国家医学研究理事会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| 羟胺 | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| 氢氧化钠 | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 琥珀酰亚胺酯 | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 柱 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4 孔板 | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 盖玻片 | Einst | 0111520 | |
| 显微镜载玻片 | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 杂交瘤 | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| 配制 M-199 培养基：向 500 ml M-199 中加入 50 ml FBS、5 ml 丙酮酸钠和 5 ml 非必需氨基酸，经无菌滤器过滤。 | |||
| 配制 M-199 维持培养基：向 500 ml M-199 中加入 15 ml FBS、5 ml 丙酮酸钠和 5 ml 非必需氨基酸，经无菌滤器过滤。 |
参考文献
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
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- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
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