方法文章

DNA甲基化：亚硫酸氢盐修饰与分析

109.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3170

⸱

2011年10月21日

 ,  ,  , 
1Epigenetics Group, Cancer Research Program, Garvan Institute of Medical Research, 2St Vincent's Clinical School, University of NSW

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

DNA甲基化分析的金标准是亚硫酸氢盐转化DNA的基因组测序。该方法利用了在酸性条件下，胞嘧啶对亚硫酸氢盐脱氨作用的敏感性高于5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的特性。在对目标基因组DNA进行PCR扩增后，可区分未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。

摘要

表观遗传学描述的是独立于DNA序列之外的、可遗传的基因功能改变。表观遗传基因调控的分子基础十分复杂，但本质上涉及对DNA本身或与DNA结合的蛋白质所进行的修饰。在哺乳动物基因组中，最主要的DNA表观遗传修饰是胞嘧啶核苷酸的甲基化（5-MeC）。DNA甲基化为基因表达机制提供了指令，指示基因应在何时、何地表达。哺乳动物中DNA甲基化的主要靶序列为5'-CpG-3'二核苷酸（图1）。CpG二核苷酸在基因组中并非均匀分布，而是集中在基因组重复序列区域以及通常与基因启动子相关的CpG“岛”区域（图1）。DNA甲基化模式在发育早期即已建立，在组织特异性分化过程中受到调控，并在包括癌症在内的多种疾病状态下发生紊乱。为了理解DNA甲基化的生物学作用及其在人类疾病中的角色，需要具备精确、高效且可重复的方法来检测和定量单个5-MeC。

该亚硫酸氢盐转化方案是DNA甲基化分析的“金标准”，可实现单核苷酸分辨率下DNA甲基化的鉴定与定量。亚硫酸氢钠介导的胞嘧啶脱氨反应包含三个步骤（图2）。（1）磺化：亚硫酸氢盐加成至胞嘧啶的5-6双键；（2）水解脱氨：生成的胞嘧啶-亚硫酸氢盐加合物发生水解脱氨反应，形成尿嘧啶-亚硫酸氢盐加合物；（3）碱性脱磺化：通过碱处理去除磺酸基团，生成尿嘧啶。亚硫酸氢盐优先对单链DNA中的胞嘧啶进行脱氨生成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶（5-MeC）则对亚硫酸氢盐介导的脱氨反应具有抗性。在PCR扩增过程中，尿嘧啶被扩增为胸腺嘧啶，而5-MeC残基仍保留为胞嘧啶，因此在测序时可通过胞嘧啶“C”与胸腺嘧啶“T”残基的存在与否，区分甲基化的CpG位点与非甲基化的CpG位点。

通过亚硫酸氢盐转化对DNA进行修饰是一种已建立成熟的实验方案，可用于多种DNA甲基化分析方法。自从Frommer et al.1 和 Clark et al.2 首次证实利用亚硫酸氢盐转化法可检测5-MeC以来，基于基因组DNA亚硫酸氢盐转化的方法已成为获取DNA甲基化数据的主要手段。根据所需甲基化分析的特异性和分辨率不同，可采用不同的PCR后续分析方法。其中，克隆与测序仍是目前最容易获得且能够提供整个DNA分子单核苷酸分辨率甲基化信息的方法。

方案

亚硫酸氢盐转化实验方案

以下描述了2 μg基因组DNA转化的标准方案。也可成功地对更少或更多的基因组DNA（100 pg-200 μg）进行亚硫酸氢盐处理。这些反应条件可实现几乎所有目标DNA序列的完全转化（99.5-99.7%）3。

1. DNA 制备

通过将基因组 DNA 与亚硫酸氢盐 DNA 裂解缓冲液（2 μg tRNA、280 ng/μl 蛋白酶 K、1% SDS）在 37°C 下孵育 1 小时（总体积为 18 μl）来制备样品。注意：这对于实现最大程度的亚硫酸氢盐转化至关重要，特别是对于从临床样本中提取的 DNA，因为这些样本中的 DNA 可能仍与蛋白质结合。

2. DNA 变性

  1. 在20 μl体积中，通过加入2 μl新配制的3M NaOH，使2 μg DNA变性，终浓度为0.3M。
  2. 将样品在水浴中37°C孵育15分钟，随后在加热块中90°C孵育2分钟。立即置于冰上5分钟。
  3. 在4°C下以10,000 g离心10秒，确保DNA沉至管底。

3. 亚硫酸氢盐脱氨

磺化与水解脱氨

  1. 制备 10 mM 喹啉和饱和亚硫酸氢钠（pH 5.0，7.6 g Na2S2O5 与 464 μl 10 M NaOH 溶液，加水定容至 15 ml）。通过轻轻倒置试剂/水混合物，获得饱和亚硫酸氢钠溶液。2O混合物，轻柔混匀并尽量减少通气。如有必要，用10 M NaOH调节pH，以确保偏亚硫酸盐完全溶解。 注意：由于是饱和溶液，可能会有少量团块未溶解。
  2. 添加 208 μl 饱和亚硫酸氢盐溶液的 12 μl 向变性的DNA中加入10 mM喹啉20 μl)，最终体积为 240 μl 至终浓度为2.31 M 亚硫酸氢盐/0.5 mM 醌醇，pH 5.0。轻轻混匀所有试剂，离心10秒，确保所有液滴均位于管底。
  3. 将样品覆盖 200 μl 矿物油中。将样品在 55°C 在水浴中孵育4-16小时。亚硫酸氢盐处理的时间取决于待转化DNA的量和质量。对于质量较差或已降解的DNA，孵育时间应限制在4小时内。 注意：为避免氧化，亚硫酸氢盐转化反应必须在避光条件下进行。如果无法避光，应在孵育前用铝箔包裹反应管。
  4. 在适当的孵育时间结束后，将离心管在微型离心机中短暂离心，以确保所有液体均位于管底。
  5. 通过移液枪小心地从管底吸取位于油层下方的DNA溶液，以回收经亚硫酸氢盐处理的DNA，注意不要吸入矿物油。

脱盐

  1. 通过脱盐柱去除游离的亚硫酸氢根离子，并用 50 μl 的超纯水（MQH2O）洗脱。根据基因组 DNA 的数量、质量及其制备方式，可选用不同的脱盐柱。我们常规使用 Promega Wizard Clean up 柱，因为该柱适用于在 DNA 转化前去除制备过程中使用的 SDS。

碱脱硫

  1. 亚硫酸氢盐加合物通过脱磺基反应从尿嘧啶环上移除。通过加入进行脱磺基反应 5.5 μl 加入新配制的3M NaOH溶液，使终浓度为0.3M，然后将样品在指定条件下孵育 37°C 15分钟。
  2. 短暂离心并加入 1 μl 的 tRNA（10 mg/ml）
  3. 通过添加中和溶液 33 μl 乙酸铵（NH4O Ac)，pH 7.0，至终浓度为 3M。
  4. 通过加入乙醇沉淀DNA 330 μl 加入预冷的100%乙醇，颠倒混匀。置于-20μC 孵育1小时至过夜。在14,000 × g离心 g 15 分钟 4°C. 去除所有上清液痕迹，将沉淀的DNA在空气中干燥约20分钟。
  5. 重悬DNA沉淀于 50 μl/μg 0.1 TE（10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0）或 H2O. 室温下静置约2小时。期间偶尔涡旋振荡管子以确保DNA充分溶解，随后快速离心。
  6. 立即用于PCR扩增，或保存于-20°C 根据DNA的数量和质量，可保存1至10年。

4. PCR 扩增

引物设计

  1. PCR 亚硫酸氢盐转化特异性引物的有效设计对于确保完全转化的 DNA 能够高效、无偏倚地扩增至关重要。以下指南可用于辅助引物设计。

引物设计原则

PCR引物设计指南；DNA转化与扩增中引物设计的技术规范列表。

热循环

  1. 为检测甲基化与非甲基化DNA的等比例PCR扩增，使用50:50甲基化/非甲基化完全亚硫酸氢盐转化的对照样本，在优化的PCR反应条件下，采用针对亚硫酸氢盐转化特异的引物进行扩增（图3）。对于50:50甲基化:非甲基化对照样本，使用 体外 SssI 甲基化 DNA 以及全基因组扩增（WGA）DNA 或全血 DNA。请注意，某些基因在血液中会天然发生甲基化，因此在这些情况下，最好仅使用 WGA DNA 作为“非甲基化”对照。
  2. 准备PCR扩增反应混合液 100 μl 含有等分试样 2 μl 亚硫酸氢盐转化的基因组DNA 200 μM dNTPs, 1 μM 引物，1.5 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM Tris-HCl，pH 8.3 和 0.15 μl Taq 聚合酶
  3. 在具有温度梯度功能的PCR仪中，将反应程序设置为梯度运行，± 3°C 从10个试管中引物的预测Tm值

PCR循环条件表；DNA扩增过程的温度、持续时间和循环次数。

  1. 为验证甲基化与非甲基化扩增子是否已按比例扩增，可使用具有信息性的限制性内切酶（如 Taq I（识别序列TCGA））对扩增产物进行酶切消化。该酶可切割经亚硫酸氢盐转化后序列仍为TCGA的甲基化DNA，但无法切割因甲基化状态改变而转化为TTGA的非甲基化DNA。酶切程度可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察（图3A）。或者，可在PCR反应体系中加入SYBR Green（0.2 μl，1:1000稀释），并通过实时荧光定量PCR仪进行熔解曲线分析，以评估甲基化程度（图3B）。
  2. 可能需要调整PCR反应体系中的MgCl2浓度及热循环条件，以提高PCR扩增效率，或确保甲基化与非甲基化PCR片段的扩增呈比例关系。
  3. 当PCR条件优化完成后，即可对经亚硫酸氢盐转化的样本进行PCR扩增。注意：一旦退火温度（Tm）已优化，则无需再使用温度梯度PCR。

5. 代表性结果：

图3展示了一个亚硫酸氢盐PCR扩增优化的示例。理想的PCR扩增条件应能按比例且无偏倚地扩增甲基化和非甲基化的扩增片段。图3A显示了使用含50%甲基化和非甲基化DNA混合物进行温度梯度PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。PCR扩增产物经限制性内切酶Taq I（TCGA）消化处理，该酶可切割甲基化（M）DNA，但不能切割非甲基化（U）DNA，因为亚硫酸氢盐转化会将限制性酶切位点TCGA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而改变为TTGA。若甲基化与非甲基化DNA被等比例扩增，则应观察到等量的被切割和未被切割的PCR产物。从该凝胶图中可见，实现无偏倚扩增的最佳热循环条件为56.1°C（T）。亚硫酸氢盐转化是否完全也可通过使用识别胞嘧啶特异性位点的酶（如HpaIII（CCGG））进行酶切分析。HpaIII仅在转化失败时才能进行切割，因为此时限制性酶切位点仍保持为CCGG；若转化完全，则该位点将根据DNA的甲基化状态被转化为TCGG或TTGG。图3A（H）中可见亚硫酸氢盐DNA转化完全的结果。

图3B显示了一个实时解离曲线图，该图也可用作根据不同分子解离温度判断是否存在扩增偏倚的工具。从该图可以看出，PCR从50%甲基化与50%非甲基化DNA混合样本中按比例扩增出了甲基化（M）和非甲基化（U）DNA，与完全甲基化和完全非甲基化DNA的对照扩增结果相比，其解离温度分别为82.1μC和78.9μC。

在优化热循环和反应条件后，经亚硫酸氢盐处理的样本可通过链特异性和亚硫酸氢盐特异性引物，在单次或半巢式PCR反应中进行扩增。所得PCR片段可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并可直接测序（图4A）或通过克隆后测序。克隆并测序后，可将各个分子的甲基化状态以亚硫酸氢盐图谱（图4B）的形式进行汇总，以展示甲基化状态的异质性。

可采用Sequenom EpiTYPER技术等方法进行高通量定量甲基化分析。该方法首先使用亚硫酸氢盐特异性PCR引物扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA，随后进行专有的切割反应。通过MALDI-TOF质谱对产生的片段进行定量，其特异性谱图取决于是否存在甲基化的胞嘧啶（图5A）。随后可推导出样品中甲基化比率的汇总结果，以Epigram形式（图5B）或甲基化图谱（图5C）展示。

DNA甲基化过程；示意图显示基因中的CpG岛、甲基化的胞嘧啶和非甲基化的胞嘧啶。
图1. 甲基化CpG示意图。 在正常细胞中，启动子相关的CpG岛主要处于非甲基化状态（灰色），而基因体内的CpG位点则较为稀疏且通常为甲基化状态（红色）。右侧图示放大了单个CpG位点处的DNA分子结构，并显示在胞嘧啶的5号碳原子上连接了一个CH3基团，表示甲基化。

DNA甲基化分析；亚硫酸氢盐转化方法；显示变性、PCR步骤的示意图。
图2. 化学转化示意图。 DNA甲基化分析包括四个主要阶段，如图所示：变性、亚硫酸氢盐转化、PCR扩增和分析。右侧面板展示了在亚硫酸氢盐转化过程中胞嘧啶分子发生的化学修饰。

凝胶电泳和熔解曲线分析；DNA甲基化检测；甲基化检测结果。
图3. PCR扩增条件的优化。 A. 对50%甲基化与非甲基化DNA混合物进行温度梯度PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。DNA片段分别用TaqI（T）或HpaIII（H）酶切，前者切割甲基化DNA，后者切割未发生亚硫酸氢盐转化的DNA。B. 熔解曲线分析显示，甲基化与非甲基化DNA比例相等（红线，50/50混合样本），与完全甲基化DNA（粉线，M）和完全非甲基化DNA（绿线，U）的对照扩增结果相比，其解链温度分别为82.1°C和78.9°C。

DNA甲基化测序结果；细胞系X、Y、Z中CpG位点的色谱图。
DNA甲基化模式图；甲基化与非甲基化CpG序列，可视化数据分析。
图4. 直接测序与亚硫酸氢盐测序图谱示例。 A. 来自三个不同细胞系的测序峰图，其中CpG位点以黄色高亮显示。细胞系X在全部三个CpG位点均呈现100%甲基化，而细胞系Y和Z则显示出不同程度的甲基化，表现为G/A信号重叠。B. 代表性亚硫酸氢盐测序图谱，显示通过单个克隆直接测序确定的各个CpG位点甲基化密度（红点）。

光谱分析；CpG位点鉴定；标记峰U M；甲基化研究图谱。
甲基化分析图与曲线图；显示不同细胞系CpG位点甲基化水平的epigram图。
图5. 使用Sequenom进行高通量DNA甲基化分析。 A. 采用Sequenom epiTYPER技术获得的光谱图。DNA片段的光谱特征取决于其所含DNA甲基化的程度。B. 四种不同细胞系在各个CpG位点的DNA甲基化百分比的epigram汇总图。C. 基于Sequenom Epigram生成的甲基化水平汇总曲线图。

讨论

通过重亚硫酸盐转化DNA的基因组测序进行DNA甲基化分析是一种成熟且用途广泛的方法，可实现单核苷酸分辨率下DNA甲基化的鉴定与定量。然而，重亚硫酸盐转化及其后续分析的前提是DNA已完全转化，即所有未甲基化的胞嘧啶均被脱氨为尿嘧啶，而仅甲基化的胞嘧啶保持不变。若转化不完全，则可能在分析中产生问题，因为未转化的未甲基化胞嘧啶可能被错误地解读为甲基化胞嘧啶。可在多个阶段优化重亚硫酸盐转化过程，以最大化转化率。为实现DNA的完全转化，首先必须使其成为单链状态，从而使胞嘧啶残基暴露于重亚硫酸盐离子。第一步DNA变性至关重要，若DNA未充分变性，则可能导致转化不完全。为确保DNA完全变性，必须优化反应参数，包括彻底去除所有结合蛋白、合适的盐浓度、适当的孵育温度和时间，以维持DNA处于单链构象。应使用新鲜的3M NaOH，并保证足够的孵育时间。若DNA难以变性，可通过延长孵育时间至30分钟或在变性前对DNA进行片段化等方案调整，以促进DNA变性。此外，在重亚硫酸盐转化反应过程中，单链DNA（ssDNA）可能重新退火形成双链DNA（dsDNA）。在重亚硫酸盐反应期间，周期性或持续地在较高温度（90–95°C）下进行反应，有助于维持ssDNA状态。但需注意，DNA在这些较高温度下的降解速度显著加快。此外，还可添加多种试剂（如尿素）以抑制DNA链的重新退火。

DNA 的浓度及其质量也会影响亚硫酸氢盐反应的效率以及最终的 PCR 产量。DNA 降解是亚硫酸氢盐转化实验方案的一个限制因素。对 DNA 的化学处理会在单链 DNA 中引入多种链断裂，而实现完全亚硫酸氢盐转化所需的一些剧烈条件（包括高浓度亚硫酸氢盐和长时间孵育）可能会加速 DNA 降解。在所述的标准反应条件下，DNA 降解通常不是常见问题；然而，如果对实验方案进行了修改，例如针对难以转化的序列，或使用已降解或质量较差的 DNA 模板（如 FFPE 样品），则 DNA 降解可能成为一个显著的限制因素。

采用本方案可对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）以及降解的 DNA 样品进行有效的亚硫酸氢盐转化和扩增，但建议进行相应调整以避免 DNA 进一步降解。建议使用如 tRNA 之类的载体 RNA。当 DNA 浓度较低（<200 ng）时，也可添加糖原作为载体。由于从 FFPE 组织中提取的 DNA 已经发生片段化，且在脱氨过程中会进一步断裂，因此必须注意尽量减少额外的降解。在变性前不得对 DNA 进行额外片段化处理，并将亚硫酸氢盐反应的孵育时间限制在 4 小时以内。由于 DNA 片段化严重，扩增子设计不应超过 300 bp。

另一个可能影响PCR扩增的因素是，未甲基化胞嘧啶的亚硫酸氢盐转化会降低DNA模板的复杂性。第4.1节中概述的引物设计方法、增加引物长度以及巢式PCR均有助于提高特异性和PCR扩增产量。

最后，由于DNA模板在亚硫酸氢盐转化过程中会发生改变，因此扩增偏差可能成为一个问题。应使用协议中所述的50/50甲基化/非甲基化（M/U）DNA混合对照样本，检查甲基化与非甲基化模板的扩增是否呈比例进行，参见图3。同时，应利用HpaIII限制性内切酶和凝胶电泳确保仅对已转化的模板进行扩增（图3）。可能需要通过调整退火温度和/或镁离子浓度，或延长延伸时间来优化PCR条件。某些模板可能特别难以扩增，此时可能需要调整引物位置或使用简并引物。

下一代测序技术正在迅速发展，以达到与亚硫酸氢盐基因组测序相似的分辨率，而第三代单分子测序技术有望在无需亚硫酸氢盐测序的情况下实现对DNA一级序列和甲基化的同步分析。然而，这些技术的广泛应用及其特异性仍需一段时间才能实现。亚硫酸氢盐基因组测序是甲基化分析的金标准，是一种稳健的实验方案。该方法已不断改进，常见问题和局限性已基本解决，应用范围也已从单个基因分析扩展至高通量及全基因组分析，如Clark et al. 20064所述。故障排除指南及额外建议详见表1。建议最佳策略是首先遵循标准操作流程，仅在出现问题时才引入相应的修改。

亚硫酸氢盐转化问题表格；DNA变性、PCR优化、故障排除策略。
表1. 故障排除指南

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料名称类型
亚硫酸氢钠Ajax Finechem
对苯二酚Merck & Co., Inc.
Wizard DNA 纯化系统Promega Corp.

参考文献

  1. Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).
  2. Clark, S. J. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).
  3. Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).
  4. Clark, S. J. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CpG PCR

相关文章