睾丸被膜内畸胎瘤生成

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）具有治疗多种不同疾病的可能性。这些细胞的应用价值在于它们能够分化为体内任何类型的细胞。本文中，我们介绍用于证明hPSCs多能性的畸胎瘤实验方法。

摘要

多能干细胞（PSCs）具有独特的特性，即能够分化为三个胚层来源的所有细胞类型。这使得它们成为治疗多种疾病的一种潜在重要工具。随着诱导性多能干细胞（iPSCs）的出现以及人类胚胎干细胞（hESCs）研究的持续进展，迫切需要建立能够证明特定细胞系具有多能性的检测方法。生殖系传递（germline transmission）一直是验证小鼠胚胎干细胞（mESC）系多能性的金标准^1,2,3。通过该检测，研究人员可证明某一mESC系能够生成胚胎中的所有细胞类型，包括生殖细胞⁴。随着人类胚胎干细胞系的建立^5,6，如何恰当验证这些细胞的多能性尚不明确，因为人类胚胎干细胞无法进行生殖系传递检测。因此，目前采用畸胎瘤检测作为替代方法，用于证明人类多能干细胞（hPSCs）的多能性^7,8,9。尽管该检测方法近年来受到一定质疑，且新的技术正在积极探索中，但畸胎瘤检测仍是当前公认的金标准⁷。在该检测中，将待测细胞注射到免疫缺陷小鼠体内。若细胞具有多能性，则最终会形成畸胎瘤，且肿瘤切片中可观察到来源于三个胚层的组织¹⁰。在畸胎瘤检测中，hPSCs可注射至小鼠体内的不同部位，最常见的注射部位包括睾丸包膜、肾包膜、肝脏，或腿部的皮下及肌肉内¹¹。本文中，我们描述了一种利用睾丸包膜作为肿瘤生长部位，由hPSCs生成畸胎瘤的可靠实验方案。

方案

注意：所有动物实验操作必须经过 IACUC 或同等机构批准。

所有外科手术器械必须在手术前进行灭菌。须使用无菌手套、手术单和纱布。

1. 手术前准备

1. 获取6周龄的Mus Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID/J雄性小鼠，或其他免疫缺陷型小鼠品系。
2. 对所有手术器械、手套和纱布进行灭菌处理。
3. 使用accutase将待注射的人多能干细胞（hPSCs）解离。
4. 计数细胞，并将1,000,000个细胞重悬于20–30 μL Matrigel与DMEM/F-12以1:1比例稀释的混合液中。细胞处理完成后置于冰上保存。
5. 注意：在正式实验前，建议先进行一次预实验，注射台盼蓝（Trypan Blue），以帮助识别潜在问题，避免浪费细胞。
6. 在动物实验室内，根据所在机构认可的操作规程对小鼠进行麻醉。在我们的实验中，使用异氟烷麻醉机。小鼠首先置于诱导室中，氧气流速为1 L/min，异氟烷浓度为3–4%。麻醉后，改用鼻罩维持麻醉，氧气流速为1 L/min，异氟烷浓度为2–3%。
7. 使用电动剃毛器剃除腹部毛发，并从腹壁中心开始顺时针向外清洁腹前壁。先使用聚维酮碘溶液擦拭，再用70%乙醇冲洗。重复此过程3次，每次更换新的棉签。将动物转移至加热垫上，在组织培养罩或解剖罩内保持体温。
8. 使用无菌手术剪在髋关节稍下方沿纵轴方向切开皮肤和腹膜，切口长约1 cm。
9. 用镊子夹住腹膜，另一把无菌镊子伸向右侧髋部，将白色脂肪组织连同附着的睾丸轻轻拉出。
10. 将睾丸置于无菌纱布上。
11. 用结核菌素注射器或Hamilton（1 mL）注射器吸取待注射的hPSC悬液。建议同时设置一个已知具有多能性的对照hPSC细胞系（如WA09，也称为H9），以便作为阳性对照，用于判断注射或手术操作是否存在缺陷。
12. 缓慢将hPSC悬液（20–30 μL）注射至睾丸被膜中心部位，避开主要血管，若观察到睾丸被膜开始肿胀，应立即停止注射。
13. 缓慢拔出针头，以避免细胞回流。
14. 使用镊子将睾丸及脂肪组织复位至腹腔内的原始位置。
15. 使用2–3针可吸收缝线缝合腹膜，皮肤切口使用自动夹具（autoclips）闭合。
16. 术后应将小鼠保持温暖直至苏醒，并在术后1–2天内每天给予两次镇痛药物（请参照所在动物实验设施认可的药物）。
    注意：所使用的麻醉剂和镇痛剂不会干扰肿瘤的形成。
17. 术后监测动物6–12周以观察肿瘤生长情况。极少数情况下，注射后6周内肿瘤可能已长至5 mm，因此密切监测动物状态至关重要。若出现此情况，应立即实施安乐死，并按常规流程对肿瘤进行处理和分析。
18. 当肿瘤可触及且大小达到约5 mm时，根据机构认可的动物实验操作规程对小鼠实施麻醉并处死。
19. 取出肿瘤并进行相应记录——拍照、测量尺寸、称重。
20. 将肿瘤切成小块，置于4%多聚甲醛溶液中固定。固定后样品保存于4%多聚甲醛中，直至送至病理科进行切片、染色和分析。

2. 代表性结果：

若按照所述方案操作，且所注射的细胞系具有多能性，则最迟在12周内应形成可触及且肉眼明显的肿瘤。对于WA09等已建立的hPSC细胞系，我们通常在6周内即可观察到肿瘤。对于iPSC细胞系，通常在8至10周内出现肿瘤也属正常现象。为确保操作步骤正确无误，必须同时注射已知具有多能性的细胞系作为阳性对照。肿瘤通常外观高度异质，并带有多个附着的囊肿（图1）。经病理学家对肿瘤样本进行分析后，应可见来自三个胚层的分化组织（图2）。

图 1. 在睾丸白膜中由人多能干细胞（hPSC）形成的典型畸胎瘤。

按照所述方案，将一百万个WA09细胞注射到免疫缺陷小鼠的睾丸被膜内。六周后观察到畸胎瘤的形成。A）从小鼠体内取出的畸胎瘤。B）畸胎瘤的近距离图像。注意其异质性及囊性结构。

图 2. 畸胎瘤的苏木精和伊红染色切片显示来自各胚层的组织。
固定后，对畸胎瘤进行切片并用苏木精和伊红染色。病理学家分析结果显示存在来自三个胚层的细胞。

讨论

本文介绍的方法提供了一种在睾丸被膜中由人多能干细胞（hPSCs）高效、可靠且直接地生成畸胎瘤的手段。该技术包含若干关键参数。尤其重要的是，应注射已知具有多能性的hPSC细胞系作为对照。其他重要参数包括注射后至肿瘤出现的观察时间间隔。对于WA09这类细胞系，通常在6至8周内可观察到畸胎瘤；而对于新建立的诱导多能干细胞（iPSC）系，我们发现通常需要10周时间。另一个需关注的因素是注射的细胞数量。我们注射一百万个细胞，但该检测也可使用更少数量的细胞轻松完成。此外，注射所用的介质也至关重要。我们发现，将细胞悬浮于Matrigel与DMEM/F-12以1:1比例混合的溶液中进行注射，效果最佳，优于使用PBS或单独的DMEM/F-12。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Invitrogen	A1110501
DMEM/F-12	Invitrogen	113300-032
Matrigel	BD Biosciences	354277