使用唑来膦酸扩增人外周血 γδ T 细胞

摘要

本文介绍了一种从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞的方法。通过唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）刺激并扩增PBMC来源的γδ T细胞。大规模扩增的γδ T细胞可用于癌症的自体细胞免疫治疗。

摘要

人类γδ T细胞能够识别并响应多种应激诱导的抗原，从而产生广泛的先天性抗肿瘤和抗感染活性。¹ 外周血中大多数γδ T细胞表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。这些细胞以主要组织相容性复合物非依赖的方式识别抗原，并发展出强烈的细胞溶解活性和类似Th1的效应功能。¹ 因此，γδ T细胞是癌症免疫治疗中极具吸引力的效应细胞候选者。Vγ9Vδ2 T细胞可响应磷酸化抗原，例如由细菌通过异戊烯基生物合成途径产生的(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸（HMBPP）²，以及真核细胞通过甲羟戊酸途径产生的异戊烯基焦磷酸（IPP）³。在生理条件下，非转化细胞中产生的IPP不足以激活γδ T细胞。肿瘤细胞中甲羟戊酸途径的失调导致IPP积累，从而激活γδ T细胞。³ 由于氨基双膦酸盐（如帕米膦酸盐或唑来膦酸盐）可抑制甲羟戊酸途径中位于IPP下游的酶——法尼基焦磷酸合酶（FPPS），因此可通过氨基双膦酸盐治疗性地提高细胞内IPP水平以及对γδ T细胞识别的敏感性。在药理学相关浓度下，非转化细胞中IPP的积累效率低于肿瘤细胞，这使得我们能够利用氨基双膦酸盐激活γδ T细胞进行癌症免疫治疗。⁴ 有趣的是，当外周血单个核细胞（PBMC）用氨基双膦酸盐处理时，单核细胞因高效摄取药物而导致IPP积累。⁵ 积累IPP的单核细胞转变为抗原呈递细胞，进而刺激外周血中的Vγ9Vδ2 T细胞。⁶ 基于上述机制，我们开发了一种利用唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）大规模扩增γδ T细胞培养物的技术。⁷ 其他扩增γδ T细胞的方法则使用合成的磷酸化抗原，如溴羟基焦磷酸（BrHPP）⁸ 或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）⁹。所有这些方法均可实现体外扩增，获得大量可用于过继性免疫治疗的γδ T细胞。然而，只有唑来膦酸是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准且可商业获得的试剂。经唑来膦酸扩增的γδ T细胞表现出CD27^-CD45RA^-效应记忆表型，其功能可通过干扰素-γ（IFN-γ）产生实验进行评估。⁷

方案

1. 外周血单个核细胞的分离

1. 将血液（7.5–8.0 ml）吸入含肝素钠的 BD Vacutainer CPT 细胞分离管中。该管内含有肝素钠抗凝剂和 Ficoll-Hypaque 密度液，以及一个聚酯凝胶屏障，可将两种液体分隔开。将试管/血液样本在室温（18°C 至 25°C）下，使用水平转子（摆动吊篮）以 1800 × g 离心 20 分钟。关闭离心机刹车。
2. 离心后，从上至下各层依次为：a) 血浆 — b) 外周血单个核细胞（PBMC）和血小板 — c) 密度液 — d) 聚酯凝胶 — e) 粒细胞 — f) 红细胞（图 1）。
3. 收集部分血浆层，保留 5 至 10 mm 的血浆在界面层上方，避免扰动细胞层。该血浆可用于后续培养（第 2.5 节）。
4. 用移液器在界面处收集富集的组分（PBMC），并转移至 15 ml 锥形管中。
5. 用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 PBMC，将试管轻柔颠倒 5 次混匀，然后以 400 × g 离心 5 分钟。
6. 重复洗涤步骤两次，然后将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。测定细胞数量。通常每 1 ml 全血可回收约 1.3 × 10⁶ 个细胞。
7. 通过流式细胞术测定 PBMC 中 γδ T 细胞的频率和表型（第 3 节）（图 2....

讨论

本文介绍的方法能够高效地从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞。通过唑来膦酸和IL-2激活并扩增的γδ T细胞可发育出完整的效应功能，表现为细胞因子的产生和细胞毒性。已有报道称，合成磷酸化抗原溴羟基焦磷酸（BrHPP）和2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）也可扩增γδ T细胞；然而，这些试剂尚未商业化供应。相比之下，唑来膦酸已获批用于临床，商品名为Zometa。因此，该试剂易于获得且可靠。

培养基和血清的选择至关重要。应使用适当的培养基，如ALyS203（Cell Science & Technology Institute）或OpTmizer（Invitrogen），以成功扩增γδ T细胞。¹¹ 需确认自体血浆、混合人AB血清或胎牛血清（FCS）能够支持γδ T细胞的培养。还需注意，某些供体的外周血单个核细胞（PBMC）对唑来膦酸刺激无反应，无论其他培养试剂如何。若出现此情况，唯一的选择是更换供体。

如我们所展示的，γδ T 细胞在相对较早阶段即实现富集；培养至第 7 天.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ZOMETA	诺华公司		唑来膦酸
PROLEUKIN	诺华公司		人重组IL-2
BD Vacutainer CPT 细胞分离管（含肝素钠）	BD 生物科学	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203- 培养基	细胞科学 &科技研究所	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
布雷菲德菌素A	Sigma-Aldrich	B5936-200UL
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P1585-1MG
ionomycin	Sigma-Aldrich	13909-1ML
IntraPrep	贝克曼库尔特公司	A07803
抗人CD3-FITC或PE/Cy5	贝克曼库尔特公司	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
抗人CD4-ECD	贝克曼库尔特公司	6604727
抗人 CD8-PE/Cy5	贝克曼库尔特有限公司	6607011
抗人 CD14-PE/Cy5	贝克曼库尔特公司	A07765
抗人CD19-PE	贝克曼库尔特公司	A07769
抗人CD45-ECD	贝克曼库尔特公司	A07784
抗人 CD56-PE/Cy5	贝克曼库尔特有限公司	A07789
抗人TCRαβ-PE	贝克曼库尔特公司	A39499
抗人 TCR Vγ9-FITC	贝克曼库尔特公司	IM1463
抗人 CD27-PE/Cy5	贝克曼库尔特公司	6607107
抗人 CD45RA-ECD	贝克曼库尔特公司	IM2711
抗人 CD69-PE	BD 生物科学	555531
抗人 NKG2D-PE	贝克曼库尔特公司	A08934
抗人干扰素γ-PE	贝克曼库尔特公司	IM2717U
小鼠IgG1同型对照-PE	贝克曼库尔特公司	A07796
小鼠IgG1同型对照-ECD或PE/Cy5	贝克曼库尔特公司	A07797A07798