本文介绍了一种从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞的方法。通过唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）刺激并扩增PBMC来源的γδ T细胞。大规模扩增的γδ T细胞可用于癌症的自体细胞免疫治疗。
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摘要
摘要
人类γδ T细胞能够识别并响应多种应激诱导的抗原，从而产生广泛的先天性抗肿瘤和抗感染活性。1 外周血中大多数γδ T细胞表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。这些细胞以主要组织相容性复合物非依赖的方式识别抗原，并发展出强烈的细胞溶解活性和类似Th1的效应功能。1 因此，γδ T细胞是癌症免疫治疗中极具吸引力的效应细胞候选者。Vγ9Vδ2 T细胞可响应磷酸化抗原，例如由细菌通过异戊烯基生物合成途径产生的(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸（HMBPP）2，以及真核细胞通过甲羟戊酸途径产生的异戊烯基焦磷酸（IPP）3。在生理条件下，非转化细胞中产生的IPP不足以激活γδ T细胞。肿瘤细胞中甲羟戊酸途径的失调导致IPP积累，从而激活γδ T细胞。3 由于氨基双膦酸盐（如帕米膦酸盐或唑来膦酸盐）可抑制甲羟戊酸途径中位于IPP下游的酶——法尼基焦磷酸合酶（FPPS），因此可通过氨基双膦酸盐治疗性地提高细胞内IPP水平以及对γδ T细胞识别的敏感性。在药理学相关浓度下，非转化细胞中IPP的积累效率低于肿瘤细胞，这使得我们能够利用氨基双膦酸盐激活γδ T细胞进行癌症免疫治疗。4 有趣的是，当外周血单个核细胞（PBMC）用氨基双膦酸盐处理时，单核细胞因高效摄取药物而导致IPP积累。5 积累IPP的单核细胞转变为抗原呈递细胞，进而刺激外周血中的Vγ9Vδ2 T细胞。6 基于上述机制，我们开发了一种利用唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）大规模扩增γδ T细胞培养物的技术。7 其他扩增γδ T细胞的方法则使用合成的磷酸化抗原，如溴羟基焦磷酸（BrHPP）8 或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）9。所有这些方法均可实现体外扩增，获得大量可用于过继性免疫治疗的γδ T细胞。然而，只有唑来膦酸是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准且可商业获得的试剂。经唑来膦酸扩增的γδ T细胞表现出CD27-CD45RA-效应记忆表型，其功能可通过干扰素-γ（IFN-γ）产生实验进行评估。7
方案
1. 外周血单个核细胞的分离
- 将血液（7.5–8.0 ml）吸入含肝素钠的 BD Vacutainer CPT 细胞分离管中。该管内含有肝素钠抗凝剂和 Ficoll-Hypaque 密度液，以及一个聚酯凝胶屏障，可将两种液体分隔开。将试管/血液样本在室温（18°C 至 25°C）下，使用水平转子（摆动吊篮）以 1800 × g 离心 20 分钟。关闭离心机刹车。
- 离心后，从上至下各层依次为：a) 血浆 — b) 外周血单个核细胞（PBMC）和血小板 — c) 密度液 — d) 聚酯凝胶 — e) 粒细胞 — f) 红细胞（图 1）。
- 收集部分血浆层，保留 5 至 10 mm 的血浆在界面层上方，避免扰动细胞层。该血浆可用于后续培养（第 2.5 节）。
- 用移液器在界面处收集富集的组分（PBMC），并转移至 15 ml 锥形管中。
- 用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 PBMC，将试管轻柔颠倒 5 次混匀，然后以 400 × g 离心 5 分钟。
- 重复洗涤步骤两次，然后将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。测定细胞数量。通常每 1 ml 全血可回收约 1.3 × 106 个细胞。
- 通过流式细胞术测定 PBMC 中 γδ T 细胞的频率和表型（第 3 节）（图 2）。
2. γδ T 细胞的扩增
- 将细胞悬液置于15 ml锥形管中，在室温下以400 × g 离心5分钟，弃去上清液。
- 通过向培养基中加入人IL-2（IL-2）和唑来膦酸（Zometa），配制终浓度分别为1000 IU/ml和5 μM的培养基（CM）。ALyS203（Cell Science & Technology Institute）或OpTmizer（Invitrogen）培养基均适用于γδ T细胞的良好扩增（更多详细信息见参考文献6和9）。Zometa以液体形式提供（4 mg/5 ml小瓶）。配制5 μM溶液时，将50 μl Zometa加入30 ml培养基中。
- 用培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度至1×106 个细胞/ml。
- 将含1×106 个细胞的1 ml培养基加入24孔板的每孔中。对于大规模培养，可根据培养板、培养皿或培养瓶孔的表面积，按0.5 × 106 个细胞/cm2 的密度接种细胞。
- 加入自体血浆（第1.3节）、混合人AB血清或胎牛血清（FCS），使其体积约占培养体系总体积的10%（24孔板每孔100 μl）。将培养板置于37°C、5% CO2 的加湿培养箱中培养24–48小时。
- 维持细胞密度在0.5–2 × 106 个细胞/ml。每2–3天仅补充含人IL-2（1000 IU/ml）的新鲜培养基（不含Zometa），并根据细胞增殖程度，将培养细胞转移至新的孔或培养瓶中（图3）。向培养基中补充血浆或血清，使血清终浓度至少维持在1%。
- 在第12–14天收获细胞，并通过流式细胞术分析γδ T细胞的频率、表型和功能（见下文）。
3. 通过流式细胞术进行表型分析
- 将含有 2 x 105 个细胞的 200 μl 样品转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。
- 加入 2 ml 冷 PBS，于 400 x g 离心 5 分钟。然后将沉淀重悬于 50 μl FACS 缓冲液（PBS + 1% FCS + 0.1% 叠氮化钠）中。向各样品中加入 5 μl 每种抗体（单克隆抗体列于表 1中）。
- 冰上避光孵育 20 分钟。
- 向每个样品中加入 2 ml FACS 缓冲液，然后涡旋混匀。于 4°C、400 x g 离心 5 分钟。小心弃去上清液。
- 将细胞重悬于 300 μl FACS 缓冲液中并涡旋混匀。使用流式细胞仪分析样品（图 2）。
4. 干扰素-γ 产生检测10
- 实验前一天，将 Daudi 细胞以每毫升 3-5 × 105 个细胞的密度接种于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基（以下简称 RPMI-10）中，并加入 Zometa（5 μM），于 37°C 培养过夜，制备刺激细胞（以下称为 Z-Daudi）。
- 收集 Z-Daudi 细胞，用 RPMI-10 培养基重悬至浓度为 2 × 106 个细胞/ml。向每孔圆底 96 孔板中加入 100 μl Z-Daudi 细胞悬液（含 2 × 105 个细胞）。
- 将 γδ T 细胞用含 20 μg/ml 布雷菲德菌素 A 的 RPMI-10 培养基调整至浓度为 2 × 106 个细胞/ml。向每孔含 Z-Daudi 细胞的孔中加入 100 μl γδ T 细胞悬液（含 2 × 105 个细胞），或向对照孔中加入 100 μl RPMI-10 培养基（仅培养基对照），或加入含 20 ng/ml 佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 [PMA] 和 2 μg/ml 离子霉素的 RPMI-10 培养基。
- 用移液器反复吹打数次混匀。于 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 4 小时。
- 将 96 孔板在 4°C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS 重悬细胞沉淀。
- 将细胞转移至流式管中，每管加入 4 ml 冷 PBS，于 4°C 以 400 × g 离心 5 分钟。
- 用 50 μl FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，加入 5 μl FITC 标记的抗 TCRVγ9 抗体和 2.5 μl PE/Cy5 标记的抗 CD3 单克隆抗体。避光室温孵育 15 分钟。
- 每管加入 100 μl IntraPrep 试剂 1，室温孵育 15 分钟。每管加入 4 ml PBS，室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清，每管加入 100 μl IntraPrep 试剂 2，室温避光孵育 5 分钟，期间不振荡。
- 向检测管中加入 5 μl PE 标记的抗 IFN-γ 单克隆抗体，避光室温孵育 15 分钟。
- 每管加入 4 ml PBS，室温下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清，用 0.5 ml FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。
- 用流式细胞仪分析细胞样本。设门于 CD3+ TCRVγ9+ 细胞群，检测 IFN-γ 的表达情况（图 4）。
5. 代表性结果：
在培养开始时确定 PBMC 中 γδ T 细胞的比例非常重要。如图 2 A所示，第 0 天 PBMC 中 CD3+TCRVγ9+ γδ T 细胞的比例为 1.6%。主要细胞群体为 CD27+CD45RA+ 初始型或 CD27+CD45RA- 中心记忆型表型。当 γδ T 细胞被有效刺激后，通常在第 3 至第 5 天形成细胞簇（图 3 A 和 B）。若细胞簇形成延迟，则其他细胞类型（如 CD4+ 或 CD8+ αβ T 细胞或 NK 细胞）的生长可能占据主导，抑制 γδ T 细胞的扩增（图 3 C 和 D）。经过 14 天培养后，在成功的 γδ T 细胞培养中，γδ T 细胞在总培养细胞中的比例增至 93.8% 以上（图 2 E）。培养后的 γδ T 细胞上调了 NKG2D 和 CD69 的表达（图 2 G 和 H），并表现为 CD27-CD45RA- 效应记忆型表型（图 2 F）。通过检测细胞因子分泌和细胞毒性功能来评估 γδ T 细胞的功能。细胞内 IFN-γ 染色显示，γδ T 细胞在 PMA/离子霉素刺激或经唑来膦酸处理后积累 IPP 的 Z-Daudi 细胞刺激下，均可产生 IFN-γ（图 4）。这些结果表明，唑来膦酸可有效刺激并扩增具有功能活性的 γδ T 细胞。
| 试管 | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | mouse IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | mouse IgG1 | mouse IgG1 |
表1. 用于γδ T细胞多色染色的单克隆抗体。本实验室进行的γδ T细胞表型分析示例见图2。
图 1. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离。采集 7.5–8.0 ml 血液至含肝素钠的 BD Vacutainer CPT 细胞分离管中，并立即以 1800 × g 离心 20 分钟。离心后，自上而下可见如下分层：a) 血浆 — b) 单个核细胞（PBMC）和血小板 — c) 密度溶液 — d) 聚酯凝胶 — e) 粒细胞 — f) 红细胞。
图2. γδ T细胞典型的表面表型。外周血单个核细胞（PBMC）经唑来膦酸和IL-2刺激培养14天。细胞用FITC标记的抗TCR Vγ9抗体和PE/Cy5标记的抗CD3抗体染色，以监测γδ T细胞的扩增情况（A和E）。通过TCRVγ9的表达鉴定γδ T细胞，并检测其CD27和CD45RA（B和F）、NKG2D（C和G）或CD69（D和H）的表达情况。
图3. 代表性γδ T细胞培养结果。PBMC用IL-2（1000 IU/ml）和唑来膦酸（5 μM）刺激。图中显示代表性视野（IX71倒置显微镜[Olympus]，200倍）。在γδ T细胞成功扩增的第3天（A）和第5天（B），可观察到γδ T细胞的簇状聚集体。相比之下，在γδ T细胞生长不充分的情况下，则未观察到簇状或聚集体（C和D）。
图 4. IFN-γ 的产生。γδ T 细胞分别仅与 RPMI-10（A）、PMA/离子霉素（B）或 Z-Daudi（C）共孵育 4 小时。首先对 TCRVγ9 的表面表达进行染色，随后通过细胞内 IFN-γ 染色检测 IFN-γ 的产生情况。
图5. γδ T细胞培养的动力学。(A) 培养细胞的绝对数量，(B) γδ T细胞的百分比，以及(C) 指定时间点γδ T细胞的绝对数量。
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讨论
本文介绍的方法能够高效地从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞。通过唑来膦酸和IL-2激活并扩增的γδ T细胞可发育出完整的效应功能，表现为细胞因子的产生和细胞毒性。已有报道称，合成磷酸化抗原溴羟基焦磷酸（BrHPP）和2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）也可扩增γδ T细胞；然而，这些试剂尚未商业化供应。相比之下，唑来膦酸已获批用于临床，商品名为Zometa。因此，该试剂易于获得且可靠。
培养基和血清的选择至关重要。应使用适当的培养基，如ALyS203（Cell Science & Technology Institute）或OpTmizer（Invitrogen），以成功扩增γδ T细胞。11 需确认自体血浆、混合人AB血清或胎牛血清（FCS）能够支持γδ T细胞的培养。还需注意，某些供体的外周血单个核细胞（PBMC）对唑来膦酸刺激无反应，无论其他培养试剂如何。若出现此情况，唯一的选择是更换供体。
如我们所展示的，γδ T 细胞在相对较早阶段即实现富集；培养至第 7 天...
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ZOMETA | 诺华公司 | 唑来膦酸 | |
| PROLEUKIN | 诺华公司 | 人重组IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT 细胞分离管（含肝素钠） | BD 生物科学 | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- 培养基 | 细胞科学 &科技研究所 | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | 贝克曼库尔特公司 | A07803 | |
| 抗人CD3-FITC或PE/Cy5 | 贝克曼库尔特公司 | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| 抗人CD4-ECD | 贝克曼库尔特公司 | 6604727 | |
| 抗人 CD8-PE/Cy5 | 贝克曼库尔特有限公司 | 6607011 | |
| 抗人 CD14-PE/Cy5 | 贝克曼库尔特公司 | A07765 | |
| 抗人CD19-PE | 贝克曼库尔特公司 | A07769 | |
| 抗人CD45-ECD | 贝克曼库尔特公司 | A07784 | |
| 抗人 CD56-PE/Cy5 | 贝克曼库尔特有限公司 | A07789 | |
| 抗人TCRαβ-PE | 贝克曼库尔特公司 | A39499 | |
| 抗人 TCR Vγ9-FITC | 贝克曼库尔特公司 | IM1463 | |
| 抗人 CD27-PE/Cy5 | 贝克曼库尔特公司 | 6607107 | |
| 抗人 CD45RA-ECD | 贝克曼库尔特公司 | IM2711 | |
| 抗人 CD69-PE | BD 生物科学 | 555531 | |
| 抗人 NKG2D-PE | 贝克曼库尔特公司 | A08934 | |
| 抗人干扰素γ-PE | 贝克曼库尔特公司 | IM2717U | |
| 小鼠IgG1同型对照-PE | 贝克曼库尔特公司 | A07796 | |
| 小鼠IgG1同型对照-ECD或PE/Cy5 | 贝克曼库尔特公司 | A07797A07798 |
参考文献
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
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