作者无任何利益冲突需要披露。

使用微流控装置捕获细胞

Cell Capture Using a Microfluidic Device

我们制备的设备以每套10个或20个的形式包装成套件。设备送达时将以冷藏状态装在盒中寄送，套件内包含实验所需的所有组件。套件中的实验材料包括装有所有注射器和缓冲液的包装袋，可于室温下保存。此外，还附有一份本次实验将遵循的操作规程副本。还有一个冷藏箱，用于存放实际使用的设备以及所有需要冷藏的运行缓冲液。通常，试剂盒以每组10个或20个的方式包装。不使用时，试剂盒应冷藏保存。每个注射器和试剂盒组分均已仔细标记，标签与我们所遵循的实验方案中的表格相对应，因此在各个步骤中使用哪个注射器或试剂盒组分均无歧义。在打开包装、取出器械并将其放入生物安全柜后，我们将进行中性粒细胞的分离及裂解操作，以用于后续基因组学应用，因为所获得的细胞样本将用于RNA提取。因此，我们必须确保实验区域的清洁，这不仅指无菌意义上的清洁，还包括清除环境中通常存在的各种RNA。因此，使用能够破坏RNA的溶液彻底擦拭整个操作区域和所有设备显得尤为重要。通常情况下，我们会使用RNA SAP或RNAs away等商品化试剂，对所有实验工具和工作台面进行擦拭处理，这类产品可从多家厂商获得。该设备以热封袋包装形式提供。每个设备均经过密封并带有条形码。如果您正在处理任何临床样本，应记录此条形码。因此，将设备打开密封，取下盖子后放入泵的持握式歧管装置中。我们使用的血样为全血样本，将通过标准的1 mL BD注射器进行灌注，该注射器标记为注射器一。通常的做法是，将注射器从包装中取出，并小心地取下采血管的盖帽。然后，吸取700微升（0.7毫升）血液，取其中一半（即350微升）注入1.5毫升离心管中。这样，你的血液样本便可用于后续处理。您的血液样本管可以继续传递使用，同时您体内仍会保留足够的血液，以应对设备故障的情况。接下来，我们将把含有血液的注射器装载到针头上，该针头通过一段管路与这个微流控分离装置相连。我们操作时需要格外小心，尤其是在使用微流控分离装置时。我们必须非常小心，避免将任何气泡引入装置中，否则装置将无法正常工作。通常情况下，我们会先取一支注射器，推动活塞，将液体加至装置的上表面，确保液体完全浸润后，再将注射器中的液体全部排出。此时停止操作，小心地将注射器筒体从针头处取下，然后利用注射器中剩余的缓冲液，将针头尖端或针头的接头部分完全充满。我们将弃去该液体。然后取含有血液的注射器，将其插入此连接接头中，注意避免血液溢出，同时小心不要引入任何气泡。建议使用止血钳夹住注射器管体和管路，以防血液溢出。将注射器与管路接头或针头连接后，轻轻敲击注射器数次，以去除连接处可能存在的气泡。随后将该注射器安装到注射泵上，并用锁紧螺钉固定牢固。启动注射泵，其已预设为我们所需的流速条件。我们将以每分钟30微升的流速使血液流经该装置。将注射器筒体装入注射泵后，按下可移动推杆臂上的按钮，并将其向下滑动，直至接触推杆顶部，开始推动液体从该装置的尖端流出。这是一种钝头的不锈钢针头。一旦确认系统已完成预充，我们就开始运行。要启动血液流动，请按“运行”按钮；要停止流动，则按“停止”按钮，然后取一个干净的1.5 mL离心管或Fendor管，小心地拔下管路。仅拔掉一个，将管道从设备的一个端口断开。一旦该管道被拔下，我们将将其插入1.5 mil fendor管中。然后按下运行按钮，重新开始血液流动。当看到有血滴形成时，我们停止泵的运行，并将血滴插入刚刚在装置中打开的入口。我们将按下“运行”以开始血液流动，并设置五分钟的计时器。我们需要确保血液均匀地充满所有腔室，且装置内无明显气泡。如果存在气泡阻碍液体流入任何一个腔室，可以使用镊子沿通向捕获腔室或从捕获腔室流出的小通道轻轻刮过，以排除气泡。该装置的填充情况良好，因此五分钟后，在注射泵上按下停止键以停止血液流动，松开注射器的夹子，并将其从注射泵支架中取出。接下来，我们将使用编号为三的注射器，其中已装入无核酸酶的 PBS 溶液。我们将再次确保装置表面完全浸润，以避免产生气泡，并轻弹注射器，使任何气泡上升至注射器筒顶部。松开注射泵上的夹臂，将三毫升注射器插入泵中。拧紧夹臂，然后推动推杆，直至其接触注射器的推杆。按下运行，等待液体充满装置，并观察不锈钢针尖处出现液滴。当看到液滴形成时，停止泵。我们将取出含有血液的不锈钢尖端。然后插入洗涤缓冲液，并按“运行”。我们将让此步骤运行五分钟。在此期间，应使用干净的擦拭纸轻轻擦去入口或出口处可能出现的少量血液。当洗涤缓冲液通过装置运行五分钟后，装置内应已完全清除所有血液，这可以通过观察判断：装置中不再有残留的红色血液，看起来是透明的。因此，五分钟后，我们将停止洗涤缓冲液的运行。再次，我们将从注射泵上取下注射器。将1.5 mL的微量离心管直接盖在柔性出口管上，并小心提起该微量离心管，将废液管从装置中缓缓拉出。我们将把该物品丢弃至生物危害容器中。试剂盒中包含一根新的出液管路，该管路由聚四氟乙烯（Teflon）制成，管路末端同样带有不锈钢尖端。我们将用这段新的出液管替换旧的出液管。取这段出液管，尝试将其弯曲成U形或V形。此外，试剂盒中还包含一个凯亚破碎柱，该柱可剪切DNA，并基本实现细胞裂解物的均质化。接下来，我们将打开研磨柱的紫色盖帽，将出口管路插入凯氏研磨柱中。然后从试剂盒中取出标有“用于RLT”的2号注射器，我们将使用该注射器。它是一个标准的BD品牌1 mL注射器，配有22号钝头不锈钢针头。我们将使用该注射器向装置中注入 350 微升来自 kyogen 的标准 RLT 溶液。由于装置存在约 50 微升的死体积，因此我们需要注入 RLT，并在 RLT 之后再注入一段空气栓，以将装置内的死体积排入 chi shredder 柱中。具体操作方法是：取注射器，先抽取 350 微升空气，随后再吸取 350 微升（即 0.35 毫升）的 RLT，此时 RLT 位于注射器的底部。不要试图将注射器倒置并将空气注入。此处保留空气是为了确保我们将全部RLT溶液注入凯氏破碎柱中。接下来，我们将拔出连接洗涤缓冲液的管路。我们将插入装有RLT的注射器，并在大约30秒的时间内缓慢将RLT注入装置中，确保出口管路将废液排入chi破碎柱。当开始有空气注入装置时，向下按压活塞，等待所有液体完全释放至Kay破碎柱中。盖上Kay破碎柱的盖子，将其放入微量离心机中平衡后，以15,000 RPM或台式微量离心机的最高转速离心2分钟。离心柱离心两分钟后，我们将样品取出，此时样品已处于RLT裂解液中，随后将其转移至所提供的紫色盖冻存管中。如果您正在处理临床样本，请在实验开始时就对这些冻存管进行标记。此处即为冻存管中的裂解物。立即将此冷冻管置于-80°C超低温冰箱中，用于后续运输或RNA提取。因此，这是一种替代性中性粒细胞分离方案。我们不会使用RLT缓冲液裂解细胞，而是采用标准组织学染色法对细胞进行染色。一种染色剂。因此，我们将已密封的装置从袋中取出，再次拆开包装，记录下装置上的批号，并将培养皿放入培养皿架中。我们将从袋子中取出1毫升注射器（注射器编号一），用其吸取700微升血液，并将其中一半（350微升）注入一个eend DPH管中。将其暂时放置一旁。然后取注射器四（带有导管），我们将使用该导管进行选择性注入，将血液注入装置中。以化学方法握住针头底部，从管路末端开始操作。取下注射器筒体，填充引诱剂。适配器将缓冲并处理该注射器。我们将含有血液的注射器通过化学擦拭纸插入针头，以收集任何溢出的液体。轻敲注射器，去除针头与注射器主体连接处的气泡。将注射器装入注射泵中，通过下压注射泵的移动臂来预冲管路。我们将从装置的一个出口（即捕获装置）上断开管路，并将其放入一个1.5 mL离心管中。然后通过按注射泵上的“运行”按钮开始推动血液流动。等待血液在不锈钢尖端形成一滴液滴。液滴形成后，按下停止按钮，吸去该血液，将其插入装置中，然后按下运行按钮。现在我们设定一个五分钟的计时器。好的，经过五分钟的流动后，按下注射泵的停止按钮，并卸下注射器。然后，我们将用含有洗涤缓冲液（即1×PBS）的3毫升注射器替换该注射器。同样，我们需要确保装置顶部已紧密连接，然后移除含有血液或运行液的针头部分。开始对装置进行预冲洗。我们将形成液滴，将其插入装置中，按下运行按钮，用吸水纸吸去入口或出口管路上的任何血液，清洗步骤后让液体流动五分钟。再次停止注射泵，并将注射器从泵架上取下。进行标准的GIM维持时，我们首先使用100%甲醇对细胞进行固定和脱水。因此，我们使用一支预先装有甲醇的3毫升注射器。再次启动注射器，确保甲醇开始流动，然后停止注射泵，将注射器插入装置中，按下运行。我们将使样本在该甲醇溶液中固定2至4分钟。固定并使用甲醇处理两到四分钟后，我们停止泵运行，取下装有甲醇的注射器，然后更换为一支含有三毫升体积的注射器，其中装有Sigma公司的EEM Sustain标准品，用去离子水按1:5比例稀释。稀释后，我们将溶液装入注射器，并在注射器末端连接一个0.8微米滤器，以过滤可能进入系统并导致装置堵塞的任何颗粒。染色时间为5到10分钟。然后用去离子水冲洗。染色5到10分钟后，停止注射泵，将装有染色缓冲液的注射器更换为装有去离子水的注射器，基本上持续冲洗直至观察到设备中的SAI蓝色染料被完全洗去。一旦过量的染料已被冲洗干净，即停止冲洗液的流动。然后，我们将从入口处取下注水器。接着，取下装置的出口管路，并用镊子夹住该管路的末端。这是一种柔性的特氟龙管，我们将把它重新插入装置的入口。这样可以密封装置，保持细胞的水合状态及其形态完整。现在，我的同事Dr.John Hong Chang将演示一种分离CD4阳性淋巴细胞的替代方案，随后直接在微流控装置内进行免疫荧光染色。我是Shong Hong，今天我将向大家演示在微流控装置中进行细胞染色。在此阶段，我已经向您展示了如何使用微流控免疫亲和分离装置，从未经处理的全血中特异性地分离出血液细胞。他的研究目的是裂解这些细胞，以获取其中的蛋白质和DNA成分。而就我的研究目的而言，我感兴趣的是获取细胞后进行细胞计数，例如，从全血中获得CD4细胞计数，并将该数值用作诊断指标。因此，所使用的装置与Ken的装置非常相似。它由一个直形的P-D-M-S-A材料腔室构成。几何结构略有不同，因此操作参数也稍有差异，但总体而言，整个操作流程非常相似。因此，我将跳过所有细胞捕获和洗涤步骤，直接进入细胞计数流程中的细胞染色步骤。这里我已准备好一个装置，其中已从全血中捕获了一半的细胞，并且该装置已经用PBS冲洗过。流出的细胞已被洗出装置，而我提前配制好了特异性用于标记被捕获在装置内细胞的抗体混合物。因此，此处所用的抗体浓度已针对在荧光显微镜下对细胞进行高强度荧光染色进行了优化。实验步骤非常简单：将装有抗体溶液的注射器装载到注射泵上，然后确保流速设定为我们所需参数。然后启动注射泵，观察管路末端，确保已有溶液流出，从而确认管路中不再有气泡。接着，可将管路插入已捕获细胞的微流控装置中。此时，抗体将流入装置，对装置内已分离的细胞进行染色。此处的流速为每分钟 5 µL，但根据装置的具体几何结构，您可能需要根据实验目的采用不同的流速参数。我们将以每分钟5 µL的流速注入抗体溶液，持续5分钟，此体积足以完全置换微流控通道内的所有溶液。抗体注入后，停止流动。因此，我们以每分钟5 µL的流速让抗体溶液流动5分钟，以完全置换微通道内的全部溶液。随后，我们停止流动，并让装置在室温下孵育30分钟。此步骤应在避光条件下进行，以防止抗体在细胞与荧光抗体孵育过程中发生淬灭。通常染色15至30分钟后，只需将装置上的管路拔下，并将抗体注射器更换为缓冲液注射器，以洗去装置中未结合的抗体。此处的洗涤液含有1% BSA的PBS溶液。BSA用于阻断抗体在表面的非特异性结合，我们将进行相同的操作。首先，我们调节注射泵的流速，以确保达到所需的正确流速，然后启动注射泵，并在将其插入装置之前，确认管路中有液体流出。这样操作的目的是确保管路中没有残留的气泡。因此，当我们进行注射时，不会有气泡进入我们的装置中。我们将管路插入装置，并继续让液体流动五分钟，以彻底置换并洗去装置中所有未结合的抗体。洗涤步骤完成后，我们将使用1% PFA固定细胞。这样做的目的是使样品可在数周内保存，以便在需要时立即进行成像。该操作流程非常简单明了。这与我们之前的操作类似。我们将注射器装载到泵上，调节流速至所需数值，然后启动注射泵，并将管路连接到我们的装置，以向其中注入对苯二甲醛（paraform IDE）溶液（即固定剂），从而固定细胞。同样，我们让溶液流动约五分钟。因此，PFA 会置换装置中的全部缓冲液，从而固定装置内的所有细胞。在 PFA 固定步骤完成后，只需取下 PFA 注射器，装置即可用于成像。在某些情况下，研究人员希望进行细胞核染色，以便与细胞表面标志物染色进行叠加显示。因此，为了实现这一目的，我们将在最后使用DPI进行细胞核染色。只需将DPI注射器装入注射泵，启动泵，使DPI流入我们的装置中。此时，细胞内的细胞核将被染色，从而显示细胞的位置。随后，可将DPI染色图像与表面标志物染色图像叠加，以显示细胞的位置。因此，在DPI染色结束后，我们需要再次用缓冲液洗去未结合的L band DPI P。同样，我们使用含有1% BSA的PBS缓冲液来洗去未结合的DPI。该操作与我们之前的操作类似。只需将缓冲液注射器插入装置中，让缓冲液流入装置，以冲洗未结合的dap。这就是在微流控装置中对细胞进行染色的完整流程。在完成所有染色步骤后，这些装置即可用于成像。由于我们使用了PFA固定，若无法立即进行成像，装置也可保存数周。

使用微流控装置捕获细胞

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