从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

摘要

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。

摘要

癌组织是由肿瘤细胞和称为“间质”的非癌性成分组成的复杂组织。间质包括细胞外基质（ECM）以及多种间充质细胞，如成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、周细胞和白细胞^1-3。

肿瘤相关间质会对邻近癌细胞释放的大量旁分泌信号产生响应。在疾病发展过程中，间质常被癌相关成纤维细胞（CAFs）所占据，其中包括大量肌成纤维细胞。这些细胞此前已从多种不同类型的人类癌瘤组织中被分离提取用于研究 体外 培养。一部分CAF亚群可通过其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的上调而加以区分^4,5这些细胞是“活化成纤维细胞”的特征性标志，具有与在损伤和纤维化组织中常见的肌成纤维细胞相似的特性。 ⁶该肌成纤维细胞型CAFs亚群的存在与高级别恶性肿瘤密切相关，并且与患者的不良预后相关。

许多实验室（包括我们自己的实验室）已经证明，当将癌相关成纤维细胞（CAFs）与癌细胞共同注射到免疫缺陷小鼠体内时，能够显著促进肿瘤发生^7-10。然而，从癌症患者体内分离得到的CAFs在体外传代培养过程中常常发生衰老，限制了其在持续实验研究中的广泛应用。为克服这一难题，我们开发了一种新颖的技术，利用共移植乳腺肿瘤异种移植模型，从人乳腺成纤维细胞实验性地生成永生化的人乳腺CAFs细胞系（exp-CAFs）。

为了获得实验性癌症相关成纤维细胞（exp-CAFs），首先从乳房缩小成形术组织中分离得到原代人乳腺成纤维细胞，并利用端粒酶全酶的催化亚基hTERT使其永生化，同时通过基因工程手段使其表达绿色荧光蛋白（GFP）和嘌呤霉素抗性基因。这些细胞随后与表达激活型 ras 将癌基因（MCF-7-ras细胞）植入小鼠异种移植模型。经过一段时间的孵育 体内最初注射的人乳腺成纤维细胞根据其嘌呤霉素抗性从肿瘤异种移植组织中提取 ¹¹.

我们观察到，定居的人类乳腺成纤维细胞在肿瘤进展过程中发生了分化，呈现出肌成纤维细胞样的表型，并获得了促进肿瘤的特性。重要的是，这些被定义为 exp-CAFs 的细胞，与从患者乳腺癌组织中分离得到的 CAFs 所具有的促肿瘤肌成纤维细胞表型非常相似。因此，我们从肿瘤异种移植模型中获得的 exp-CAFs 为研究人类乳腺癌中 CAFs 的生物学特性提供了一个有效的模型。所描述的实验方案也可拓展用于生成和表征来自其他类型人类癌组织的多种 CAF 群体。

方案

1. 原代培养人正常乳腺成纤维细胞的分离

图1A概述了分离原代培养的人正常乳腺成纤维细胞的实验步骤。

1. 按照先前所述方法制备细胞解离缓冲液¹²：含10%胎牛血清（FCS）、青霉素-链霉素（200单位/毫升）、I型胶原酶（1毫克/毫升）和透明质酸酶（125单位/毫升）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 将从乳房缩小成形术中获取的乳腺组织（约0.5克）用磷酸盐缓冲液（PBS）反复洗涤数次。使用无菌剃刀片将组织切成小碎片（<1.5 mm³）。
3. 将组织碎片转移至含有适量上述细胞解离缓冲液（每0.5克组织加10毫升）的15毫升锥形管中，涡旋振荡1分钟（最高速度）。
4. 在37°C条件下，以缓慢振荡方式在细胞解离缓冲液中消化组织碎片12–18小时。^*注意：管中仍会残留大量未完全消化的组织碎片。
5. 室温静置5分钟，不振荡。使用5毫升移液管将富含基质细胞的上清液转移至新的锥形管中。
6. 将基质细胞组分在250 × g离心5分钟，弃上清后用PBS重悬细胞沉淀。再次在250 × g离心5分钟，弃上清后用添加10% FCS的DMEM重悬细胞沉淀。将细胞接种于15厘米培养皿中，在含10% FCS的DMEM培养基中，于37°C、5%二氧化碳环境中培养。
7. 持续传代培养至细胞融合。通常需要8–10天。使用冻存....

讨论

缺乏针对CAF的特异性标志物以及CAF之间存在的高度异质性，使得对该细胞类型的表征本身即构成挑战。研究CAF 体外 还因这些细胞在长期培养过程中会发生衰老并停止增殖而受到阻碍。我们此前尝试使用逆转录病毒介导的hTERT cDNA构建体直接永生化原代CAFs未能成功。因此，为了进一步研究这些细胞的促肿瘤特性，我们开发了一种利用共移植肿瘤异种移植模型从人乳腺成纤维细胞生成永生化CAFs的方法。从乳房缩小成形术组织中分离得到的原代人乳腺成纤维细胞，在与乳腺癌细胞共同注射入小鼠体内之前先进行永生化处理。随后，从所形成的肿瘤异种移植物中分离出人成纤维细胞（详见图1Ba）。重要的是，在肿瘤进展过程中，这些人乳腺成纤维细胞逐渐演变为具有促肿瘤作用的肌成纤维细胞样CAFs。我们确实观察到，与42天或70天的exp-CAF1细胞及对照成纤维细胞-2细胞相比，242天的exp-CAF2细胞表现出更强的促肿瘤肌成纤维细胞特性。¹¹. 这种促肿瘤的肌成纤维细胞特性在乳腺癌患者来源的CAFs中同样可见，其依赖于由TGF-β和SDF-1细胞因子介导的自分泌信号环路的建立¹¹基因转移或癌细胞与成纤维细胞之.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	英杰	61965-026
胎牛血清	GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌	10270
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
I型胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130-1G
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H4272
波形蛋白（V9）抗体	诺沃卡斯特拉实验室	NCL-L- VIM-V9
Tenascin C（BC-8）抗体			一份来自 博士 Luciano Zardi
αα-SMA-Cy3（1A4）抗体	Sigma-Aldrich	C6198
脯氨酰-4-羟化酶	Dako	M0877
(5B5) 抗体
I型胶原1A抗体	Sigma-Aldrich	HPA011795
广谱细胞角蛋白抗体	Sigma-Aldrich	C5992
纤连蛋白抗体	BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1（成纤维细胞特异性蛋白-1） 特异性蛋白-1（specific protein-1）抗体	Dako	A5114
成纤维细胞表面蛋白 （克隆1B10）抗体	Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP 质粒构建体			向作者索取
pBabe-puro 载体			购买 来自 Addgene
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
15 ml 锥形管	康宁	430766
裸鼠	Taconic	NCRNU-F	雌性 NCr 裸鼠
C3H/10T1/2 细胞	ATCC		CCL-226