从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

摘要

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。

摘要

癌组织是由肿瘤细胞和称为“间质”的非癌性成分组成的复杂组织。间质包括细胞外基质（ECM）以及多种间充质细胞，如成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、周细胞和白细胞^1-3。

肿瘤相关间质会对邻近癌细胞释放的大量旁分泌信号产生响应。在疾病发展过程中，间质常被癌相关成纤维细胞（CAFs）所占据，其中包括大量肌成纤维细胞。这些细胞此前已从多种不同类型的人类癌瘤组织中被分离提取用于研究 体外 培养。一部分CAF亚群可通过其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的上调而加以区分^4,5这些细胞是“活化成纤维细胞”的特征性标志，具有与在损伤和纤维化组织中常见的肌成纤维细胞相似的特性。 ⁶该肌成纤维细胞型CAFs亚群的存在与高级别恶性肿瘤密切相关，并且与患者的不良预后相关。

许多实验室（包括我们自己的实验室）已经证明，当将癌相关成纤维细胞（CAFs）与癌细胞共同注射到免疫缺陷小鼠体内时，能够显著促进肿瘤发生^7-10。然而，从癌症患者体内分离得到的CAFs在体外传代培养过程中常常发生衰老，限制了其在持续实验研究中的广泛应用。为克服这一难题，我们开发了一种新颖的技术，利用共移植乳腺肿瘤异种移植模型，从人乳腺成纤维细胞实验性地生成永生化的人乳腺CAFs细胞系（exp-CAFs）。

为了获得实验性癌症相关成纤维细胞（exp-CAFs），首先从乳房缩小成形术组织中分离得到原代人乳腺成纤维细胞，并利用端粒酶全酶的催化亚基hTERT使其永生化，同时通过基因工程手段使其表达绿色荧光蛋白（GFP）和嘌呤霉素抗性基因。这些细胞随后与表达激活型 ras 将癌基因（MCF-7-ras细胞）植入小鼠异种移植模型。经过一段时间的孵育 体内最初注射的人乳腺成纤维细胞根据其嘌呤霉素抗性从肿瘤异种移植组织中提取 ¹¹.

我们观察到，定居的人类乳腺成纤维细胞在肿瘤进展过程中发生了分化，呈现出肌成纤维细胞样的表型，并获得了促进肿瘤的特性。重要的是，这些被定义为 exp-CAFs 的细胞，与从患者乳腺癌组织中分离得到的 CAFs 所具有的促肿瘤肌成纤维细胞表型非常相似。因此，我们从肿瘤异种移植模型中获得的 exp-CAFs 为研究人类乳腺癌中 CAFs 的生物学特性提供了一个有效的模型。所描述的实验方案也可拓展用于生成和表征来自其他类型人类癌组织的多种 CAF 群体。

方案

1. 原代培养人正常乳腺成纤维细胞的分离

图1A概述了分离原代培养的人正常乳腺成纤维细胞的实验步骤。

1. 按前述方法配制细胞解离缓冲液¹²：含10%胎牛血清（FCS）、青霉素-链霉素（200单位/毫升）、I型胶原酶（1毫克/毫升）和透明质酸酶（125单位/毫升）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 将来自乳房缩小成形术的乳腺组织（约0.5克）用磷酸盐缓冲液（PBS）反复清洗数次。使用无菌剃刀片将组织切成小碎片（<1.5 mm³）。
3. 将组织碎片转移至含有适量上述细胞解离缓冲液（每0.5克组织加10毫升）的15毫升锥形管中，涡旋震荡1分钟（最大速度）。
4. 在37°C下缓慢振荡消化组织碎片12–18小时。^*注意：管中仍会有大量未完全消化的组织碎片残留。
5. 室温静置5分钟，不振荡。用5毫升移液管将富含基质细胞的上清液转移至新的锥形管中。
6. 以250 × g离心5分钟收集基质细胞组分，弃上清后用PBS重悬细胞沉淀。再次以250 × g离心5分钟，弃上清后用含10% FCS的DMEM重悬细胞沉淀。将细胞接种于15厘米培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养。
7. 继续传代培养至细胞融合，通常需要8–10天。使用冻存液（含10%二甲基亚砜和20% FCS的DMEM）将细胞于-80°C保存。制备5支冻存管作为原始细胞库。取一支冻存管复苏后扩增，制备5支次级细胞库，所用成纤维细胞应在5次群体倍增（PDs）内完成传代，用于后续实验。上述操作可最大限度减少长期体外培养过程中可能出现的克隆选择和培养应激。^*注意：P1.1–7步骤也可用于从乳房切除术获得的乳腺癌组织中分离癌相关成纤维细胞（CAFs）¹²。

2. 生成表达GFP标记、耐嘌呤霉素的永生化人正常乳腺成纤维细胞

1. 为了永生化在 P1.7) 步骤中分离得到的原代人正常乳腺成纤维细胞，引入表达 hTERT 和 GFP 的逆转录病毒 pMIG（MSCV-IRES-GFP）载体¹²。将细胞培养 4–5 天，然后通过流式细胞术分选 GFP 阳性细胞。
2. 将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒 pBabe-puro 载体导入 GFP 标记的永生化成纤维细胞中。在嘌呤霉素（终浓度：1 μg/ml）存在下培养细胞 5–7 天，以获得 GFP 阳性（GFP+）、嘌呤霉素抗性（puro^R）的永生化人乳腺成纤维细胞。
3. 接下来，为检测这些成纤维细胞是否产生具有活性的病毒（可能导致 GFP 和嘌呤霉素抗性基因发生水平转移），将 2.5×10⁵ 个 GFP+puro^R 永生化人乳腺成纤维细胞接种于 6 cm 培养皿中，培养 2 天。
4. 使用注射器滤器（孔径：0.45 μm）过滤上述成纤维细胞条件培养基，并在鱼精蛋白硫酸盐（5 μg/ml）存在下将其加入 10T1/2 小鼠成纤维细胞中，孵育 12 小时（鱼精蛋白硫酸盐可提高病毒感染效率）。随后更换为含 10% FCS 的 DMEM 培养基，继续培养 2 天。
5. 通过荧光显微镜观察细胞。若 10T1/2 细胞被 GFP 病毒感染，则会呈现 GFP 阳性。同时，用嘌呤霉素（1 μg/ml）处理细胞 5–7 天，观察培养皿中是否有 puro^R 的 10T1/2 细胞存活并形成克隆集落。
6. 需注意，亲代 GFP+puro^R 人乳腺成纤维细胞所产生的具有活性的病毒可能引起基因的水平转移，导致肿瘤异种移植模型中的邻近小鼠细胞和/或癌细胞转变为 GFP+puro^R 表型。这可能会干扰从肿瘤异种移植组织中分离最初注射的 GFP+puro^R 人乳腺成纤维细胞的实验过程。

3a. 将人乳腺成纤维细胞与乳腺癌细胞共同注射至免疫缺陷小鼠

生成exp-CAFs的实验步骤如图1Ba所示。

1. 将1×10⁶个MCF-7-ras人乳腺癌细胞与3×10⁶个GFP⁺puro^R永生化人乳腺成纤维细胞（于P2.2步骤中制备）混合。每注射样本用400 μl含50% (v/v) Matrigel的培养基悬浮细胞。
2. 将细胞混合物皮下注射至免疫缺陷裸鼠体内。当CAF从不同肿瘤中独立提取时，将每种混合物分别注射至多只小鼠的左右侧 flank 部位。

3b. 将人乳腺成纤维细胞注射至免疫缺陷小鼠体内

1. 为生成用于与实验组CAFs对照的成纤维细胞，将P2.2中获得的3×10⁶个GFP⁺puro^R永生化人乳腺成纤维细胞重悬于400 μl培养基中，每注射点加入50% (v/v) Matrigel（图1Bb）。切勿将成纤维细胞与癌细胞混合。
2. 将P3b.1步骤中制备的成纤维细胞植入裸鼠皮下部位。

^*请注意，接种的成纤维细胞将在皮下形成成纤维结缔组织，而非肿瘤。

4a. 肿瘤异种移植瘤的解剖

1. 在植入后第42天处死携带皮下人乳腺癌异种移植瘤的小鼠（图1Ba）。^*注意：当共植入其他癌细胞和/或成纤维细胞时，成纤维细胞可能需要在肿瘤异种移植体内孵育超过42天，以启动其肌成纤维细胞表型。
2. 使用镊子和剪刀通过钝性解剖从小鼠侧腹收获肿瘤异种移植组织。将肿瘤组织浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。

4b. 成纤维细胞异种移植体的解剖

1. 在植入后第42天处死携带成纤维细胞异种移植瘤的小鼠（图1Bb）。
2. 使用镊子和剪刀解剖皮下成纤维细胞异种移植瘤组织，将成纤维组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。^*请注意，成纤维细胞异种移植瘤呈微小透明状组织，可能在皮肤下难以发现。

5. 异种移植瘤原代培养细胞的制备

1. 使用无菌生物安全柜解剖肿瘤（约 0.5 克）或成纤维组织（约 0.1 克）。将切除的组织转移至含有 1 ml PBS 的 15 cm 培养皿表面。使用无菌剃刀片将组织切碎成小的组织碎片（<1.5 mm³）。*注意：如果成纤维细胞异种移植组织重量小于 0.1 克，应收集数个额外的成纤维细胞异种移植组织并混合，以增加细胞分离的数量。
2. 将组织碎片转移至含有细胞解离缓冲液（每 0.5 克组织加入 10 ml）的 15 ml 圆锥形离心管中，并在最大转速下涡旋震荡 1 分钟。
3. 将细胞悬液在 37°C 条件下孵育 3 小时，期间持续缓慢振荡。

6. 培养中嘌呤霉素抗性细胞的分离

1. 将从肿瘤或成纤维细胞异种移植中分离的细胞悬液在250 × g条件下离心5分钟，并用PBS重悬细胞沉淀。再次在250 × g条件下离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基（10% FCS-DMEM）中。将细胞接种于15 cm培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养，并加入嘌呤霉素（1 μg/ml）以清除可能污染的癌细胞和/或小鼠间质细胞。持续传代培养细胞直至形成融合单层（2–4周）。使用冻存液将细胞于-80°C保存。*注意：所得的嘌呤霉素抗性细胞（puro^R），分别命名为42天龄的exp-CAF1细胞（图1Ba）或对照成纤维细胞-1细胞（图1Bb），具有永生化特性且GFP表达呈阳性。建议使用10T1/2细胞检测这些细胞是否产生活性病毒，方法见P2.3-6。

7a. 体外培养中 exp-CAF2 细胞的分离

为了进一步增强CAF的活化肌成纤维细胞表型，将培养42天的exp-CAF1细胞与MCF-7-ras细胞混合，再次皮下注射到裸鼠体内，继续培养200天。解剖并分离肿瘤异种移植组织，制备成单细胞悬液，并在含嘌呤霉素（1 μg/ml）的10% FCS-DMEM培养基中，接种于15 cm培养皿中培养，具体操作如P6.1所示。将细胞扩增培养至融合状态（8–10天）。使用冻存液将细胞在-80°C保存。所得嘌呤霉素抗性（puro^R）细胞命名为培养242天的exp-CAF2细胞（图1Ba）。

7b. 培养中对照成纤维细胞-2 的提取

为了生成针对 exp-CAF2 细胞的对照成纤维细胞，将 42 日龄的对照成纤维细胞-1 单独注射到裸鼠皮下，不与癌细胞共注射，并额外培养 200 天。解剖并消化成纤维组织，制备成单细胞悬液，将细胞接种于 15 cm 培养皿中，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，在存在嘌呤霉素（1 μg/ml）的条件下培养，如 P6.1 所示。持续传代培养至细胞融合（3–4 周）。使用冻存液将细胞在 -80°C 条件下保存。所得的嘌呤霉素抗性（puro^R）细胞命名为对照成纤维细胞-2 细胞（图 1Bb）。

8. 典型结果：

对照成纤维细胞-2和从乳腺肿瘤异种移植模型中分离的exp-CAF2细胞对间充质标志物呈强阳性染色，包括人特异性波形蛋白（vimentin）、脯氨酰-4-羟化酶（prolyl-4-hydroxylase）、I型胶原（collagen 1A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4以及成纤维细胞表面蛋白（图2A）¹¹，表明这些细胞具有人类来源及间充质特性。相比之下，上皮细胞标志物细胞角蛋白（cytokeratin）在这些GFP⁺成纤维细胞中未见染色（图2B）。因此，这些结果提示，所分离的exp-CAF2细胞和对照成纤维细胞-2来源于最初植入小鼠异种移植模型中的人乳腺成纤维细胞。

重要的是，与培养42天的exp-CAF1细胞和对照成纤维细胞-2细胞相比，更高比例的exp-CAF2细胞对α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞外基质糖蛋白tenascin-C⁵染色呈阳性，这两种蛋白均为肌成纤维细胞的标志物（图2C、D）¹¹。这些数据表明，人乳腺驻留成纤维细胞在肿瘤异种移植模型中逐步演变为癌症相关成纤维细胞（CAF）类型的肌成纤维细胞。

图1 人乳腺成纤维细胞分离的示意图。A) 乳房缩小术获取的组织使用无菌剃刀片切碎（P1.2），并转移至15 ml锥形管中（P1.3）。将小块组织在细胞解离缓冲液中进行消化（P1.4），随后制备用于培养 体外 (P1.5-7)。为了永生化分离得到的原代人乳腺成纤维细胞，引入了一种表达hTERT和GFP的逆转录病毒pMIG（MSCV-IRES-GFP）载体，并通过流式细胞术分选获得GFP阳性细胞（P2.1）。随后将编码嘌呤霉素抗性基因的逆转录病毒pBabe-puro载体导入这些细胞中。经嘌呤霉素处理后，筛选出GFP标记（GFP⁺) 嘌呤霉素抗性（Puro^R），永生化的人类乳腺成纤维细胞被分离（P2.2）。

Ba) 为了生成exp-CAFs，GFP⁺puro^R 永生化的人类乳腺成纤维细胞与MCF-7-ras乳腺癌细胞共同皮下注射至免疫缺陷裸鼠（P3a）体内。移植后42天切除异种移植瘤（P4a），并解离为单细胞悬液（P5），随后对这些细胞进行培养 体外 在嘌呤霉素存在下培养以清除任何污染的癌细胞和小鼠间质细胞（P6）。获得的嘌呤霉素抗性细胞称为实验生成的CAF1（exp-CAF1）细胞。这些细胞在植入后第42天被切除，再次与MCF-7-ras细胞混合，并如前所述皮下植入宿主小鼠体内（P7a）。将所形成的肿瘤继续生长200天，随后解剖、解离，并在嘌呤霉素存在下进行培养。分离得到的嘌呤霉素抗性细胞称为exp-CAF2细胞（242天龄）。

Bb) 为分离对照细胞以对抗exp-CAFs，将GFP⁺puro^R永生化的人乳腺成纤维细胞作为不含MCF-7-ras细胞的纯培养物皮下注射至裸鼠体内（P3b）。在植入后42天（P4b）分离成纤维组织，将其解离为单细胞悬液（P5），并如前所述分离出嘌呤霉素抗性细胞，命名为对照成纤维细胞-1（P6）。这些成纤维细胞再次在不含MCF-7-ras细胞的条件下皮下植入裸鼠体内，额外培养200天（P7b）。取出成纤维组织，进行解离，并在含嘌呤霉素的培养基中培养。分离得到的嘌呤霉素抗性细胞称为对照成纤维细胞-2（242天龄）。

图 2 实验组癌相关成纤维细胞（Exp-CAFs）与对照组成纤维细胞均来源于亲本人类乳腺成纤维细胞。（A） 对照组成纤维细胞-2（对照组成纤维细胞）与 exp-CAF2 细胞的免疫荧光分析。两种细胞类型均对间充质标志物（红色）呈阳性染色，包括人波形蛋白（vimentin）、脯氨酰-4-羟化酶（prolyl-4-hydroxylase）、胶原蛋白1A（collagen 1A）、纤连蛋白（fibronectin）、S100A4 及成纤维细胞表面蛋白。 （B） 相反，表达绿色荧光蛋白（GFP，绿色）的 exp-CAF2 细胞中未检测到上皮细胞标志物广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）。细胞核使用 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色）。比例尺，50 μm（引自 Kojima 等¹¹）

（C） exp-CAF2细胞和对照成纤维细胞-2细胞（对照f.）的免疫荧光染色，使用针对α-SMA（红色）或腱生蛋白-C（TN-C）（红色）的抗体。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺， 50 μm. (D) 48%的exp-CAF2细胞α-SMA染色呈阳性，而42天龄的exp-CAF1细胞中14%、对照组成纤维细胞-2细胞群中2.5%呈α-SMA阳性。（引自Kojima等11）

讨论

缺乏针对CAF的特异性标志物以及CAF之间存在的高度异质性，使得对该细胞类型的表征本身即构成挑战。研究CAF 体外 还因这些细胞在长期培养过程中会发生衰老并停止增殖而受到阻碍。我们此前尝试使用逆转录病毒介导的hTERT cDNA构建体直接永生化原代CAFs未能成功。因此，为了进一步研究这些细胞的促肿瘤特性，我们开发了一种利用共移植肿瘤异种移植模型从人乳腺成纤维细胞生成永生化CAFs的方法。从乳房缩小成形术组织中分离得到的原代人乳腺成纤维细胞，在与乳腺癌细胞共同注射入小鼠体内之前先进行永生化处理。随后，从所形成的肿瘤异种移植物中分离出人成纤维细胞（详见图1Ba）。重要的是，在肿瘤进展过程中，这些人乳腺成纤维细胞逐渐演变为具有促肿瘤作用的肌成纤维细胞样CAFs。我们确实观察到，与42天或70天的exp-CAF1细胞及对照成纤维细胞-2细胞相比，242天的exp-CAF2细胞表现出更强的促肿瘤肌成纤维细胞特性。¹¹. 这种促肿瘤的肌成纤维细胞特性在乳腺癌患者来源的CAFs中同样可见，其依赖于由TGF-β和SDF-1细胞因子介导的自分泌信号环路的建立¹¹基因转移或癌细胞与成纤维细胞之...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	英杰	61965-026
胎牛血清	GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌	10270
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
I型胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130-1G
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H4272
波形蛋白（V9）抗体	诺沃卡斯特拉实验室	NCL-L- VIM-V9
Tenascin C（BC-8）抗体			一份来自 博士 Luciano Zardi
αα-SMA-Cy3（1A4）抗体	Sigma-Aldrich	C6198
脯氨酰-4-羟化酶	Dako	M0877
(5B5) 抗体
I型胶原1A抗体	Sigma-Aldrich	HPA011795
广谱细胞角蛋白抗体	Sigma-Aldrich	C5992
纤连蛋白抗体	BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1（成纤维细胞特异性蛋白-1） 特异性蛋白-1（specific protein-1）抗体	Dako	A5114
成纤维细胞表面蛋白 （克隆1B10）抗体	Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP 质粒构建体			向作者索取
pBabe-puro 载体			购买 来自 Addgene
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
15 ml 锥形管	康宁	430766
裸鼠	Taconic	NCRNU-F	雌性 NCr 裸鼠
C3H/10T1/2 细胞	ATCC		CCL-226