通过负染电镜技术观察蛋白质与大分子复合物：从载网制备到图像采集

摘要

通过负染电子显微镜（EM）观察蛋白质样品已成为一种流行的结构分析方法。该方法既可用于定量结构分析，例如计算所研究分子的三维重构，也可用于定性评估蛋白质样品的质量。本文提供了制备EM载网、染色样品以及在电子显微镜下观察样品的详细实验方案。初学者可轻松遵循这些操作步骤，将负染EM作为常规检测手段，结合其他生物化学分析方法，用于评估其蛋白质样品。

摘要

单颗粒电子显微镜技术（EM），无论是针对负染色还是冷冻水合的生物样品，已成为结构生物学中一种多功能的工具¹。近年来，该方法在研究蛋白质及大分子复合物结构方面取得了巨大成功^{2, 3}。与电子冷冻显微镜技术（cryoEM）相比，负染色是一种更简单的样品制备方法；在cryoEM中，冷冻水合的蛋白质样品被包埋在一层薄的玻璃态冰中⁴，而在负染色法中，蛋白质样品则被包埋在一层干燥的重金属盐薄膜中，以增强样品的对比度⁵。负染色电镜所增强的对比度使得相对较小的生物样品得以观察。除了用于测定纯化蛋白质或蛋白质复合物的三维（3D）结构⁶之外，该方法还可用于更广泛的目的。例如，负染色电镜可简便地用于观察纯化的蛋白质样品，获取有关样品均一性/非均一性、蛋白质复合物或大型组装体形成情况的信息，或仅用于评估蛋白质制备的质量。

在本视频文章中，我们介绍了一套完整的透射电镜观察负染蛋白质样品的实验方案，内容涵盖用于负染电镜的碳支持膜铜网的制备，到在加速电压为120 kV的透射电子显微镜下获取负染样品图像的全过程。这些实验方案已在我们的实验室中常规使用，初学者也可轻松掌握和操作。

方案

1. 用于碳镀膜的电镜载网制备

1. 用一个大玻璃烧杯装入蒸馏水。
2. 使用玻璃移液管将一滴火棉胶（约20μl，2%溶于乙酸戊酯，Electron Microscopy Sciences，宾夕法尼亚州，美国）滴加到水面上。火棉胶会扩散并在水/空气界面形成一层薄塑料膜；注意：第一滴火棉胶可用于清除水面可能存在的灰尘颗粒。在移除第一滴形成的薄膜后，水面即可无尘。
3. 将从Ted Pella Inc.（美国）购买的400目或200目镀金铜EM载网逐个放置到漂浮在水面上的塑料膜上；我们通常以紧密排列的方式放置50 ~ 100个载网，使载网的光亮面朝下接触塑料膜（图1A）。注意：400目载网适用于常规负染透射电镜样品；而200目载网适用于采集倾转配对图像。
4. 裁取一张略大于载网分布区域的纸片。小心地将纸片覆盖在载网上方（图1B），等待纸片完全浸湿（图1C）。注意：不同类型的纸张具有不同的吸水速率。所用纸张吸水不能过快。例如，普通滤纸不适合此用途，因其吸水过快并产生大量褶皱。由起皱纸张制成的碳膜不平整，因此不适用于随机锥形倾转三维重构所需的倾转配对图像采集。需测试多种纸张以找到合适类型。在我们实验室，通常使用从本地杂货店购买的记事本纸张。有时发现报纸纸张也适用。另一种选择是使用较厚的中国/日本书法用宣纸。
5. 迅速在浸湿纸片周围及附近对塑料膜进行切割。随后立即用镊子夹起纸片，使载网夹在塑料膜与纸片之间。将纸片放入培养皿中，使载网朝上自然晾干（图1D）；注意：必须让纸片自然风干。干燥过快会导致纸张产生大量褶皱。

2. 碳膜载网的制备

1. 我们实验室使用的碳镀膜机为 Cressington 208C 高真空涡轮碳镀膜仪（Ted Pella）。本系统配备有 Cressington 膜厚监测仪，该监测仪基于石英晶体振荡频率随其表面沉积薄膜质量变化的原理，测量所镀碳膜的厚度。然而，本文所述方案无需使用膜厚监测仪，因为并非每个实验室都具备该设备。
2. 使用碳棒磨刀器（Ted Pella）打磨碳棒，并将碳棒装入碳镀膜机中（图 2A）。将两根碳棒放置成相互接触，其中一根为尖端，另一根为平端。
3. 在载玻片磨砂区域的一半涂上真空脂，并将其放置在载网旁边（图 2B）。仅需将载玻片磨砂区域的一半涂覆真空脂。注意：涂有真空脂的区域在碳镀膜后颜色不会改变。涂与未涂真空脂区域之间的颜色对比可用于估计所镀碳膜的厚度。
4. 将带有载网的纸片放置在碳镀膜机的样品台上。将载玻片放置在载网旁边（图 2C）。注意：为防止大量载网从纸片上脱落，也可先将带有塑料膜的载网转移至载玻片上，再进行镀膜。
5. 抽真空至真空腔室压力达到 10^-5 Torr。注意：在较低真空度下进行镀膜通常会产生大量火花，导致载网上出现许多较大的碳颗粒。
6. 缓慢增加电流。随着电流增大，碳棒的尖端首先变为红色，随后变为白色。切勿用肉眼直接观察高亮度的尖端。当镀膜开始时停止增加电流。载玻片颜色将由白色变为浅灰色，再变为深灰色。载玻片颜色的深浅与所镀碳膜的厚度相关。当达到所需厚度时，关闭电流以停止镀膜（图 2D）。注意：1）经过多次碳镀膜过程后，玻璃钟罩内壁沉积的碳层可能使其颜色变深，导致所镀碳膜看起来比实际更厚。2）一根打磨好的碳棒可多次使用。每次镀膜后，尖端锐度会逐渐降低，而碳棒的锐度会影响所需最大电流。新打磨的细直径碳棒蒸发碳所需电流相对较低；后续镀膜可能需要略高的电流。
7. 释放真空腔室，取出镀膜后的载网以供后续使用。
   注意 1. 控制碳膜厚度更准确的方法是使用膜厚监测仪。也可通过监测仪测得的精确厚度对颜色进行定性校准。本技术适用的碳膜厚度范围为 3 至 7 nm。

这是一种简单易行的方法，可用于制备大量碳膜支持铜网，通常每次可制备约100个铜网。这些铜网表面含有一层薄塑料膜，通常不会影响负染图像的质量。然而，采用此方法制备的铜网不适用于冷冻电镜（cryoEM）。该塑料膜可通过将铜网浸泡于氯仿中数小时予以去除。

3. 制备用于负染电镜的甲酸铀酰溶液（0.75%）。详细方案此前已有描述⁵

1. 称取37.5 mg甲酸铀酰至一小烧杯中；
2. 加入5 ml沸水，在避光条件下搅拌5分钟；
3. 加入10 μl 5 M NaOH，继续搅拌5分钟；
4. 使用注射器滤器（Fisherbrand，13 mm注射器滤器，0.2 μm，尼龙非无菌，货号09-720-5）过滤溶液，并将滤后溶液储存于8 ml Falcon管中，用铝箔包裹避光保存；
   注意。 甲酸铀酰粉末可从Electron Microscopy Sciences（Hatfield, PA）购买，货号22451。甲酸铀酰溶液对光敏感，应避免直接光照，例如用铝箔包裹Falcon管。新鲜配制的溶液呈淡黄色（图3A）。染色液在室温下可稳定存放一至两周，之后开始出现沉淀。甲酸铀酰呈酸性，pH值约为4。加入NaOH可提高pH值，但若添加过快或过量，可能导致染色剂沉淀。除提供对比度外，甲酸铀酰还可固定蛋白质样品。由于其固定速度极快，通常低pH值不会影响蛋白质的整体构象或蛋白质复合物的形成⁷。

4. 负染电镜载网制备方案。该方案此前已有详细描述⁵

1. 使用 PELCO easiGlow GlowDischarge 系统（Ted Pella Inc.，USA）对镀碳膜的载网进行辉光放电处理。电流设置为 15 mA，辉光放电时间为 30 秒。注意。 辉光放电后的载网应尽快使用。我们通常在辉光放电后 2 小时内使用载网。
2. 在一片 Parafilm 上放置两滴 20 μl 的蒸馏水和两滴 25 μl 的甲酸铀酰溶液（图 3B）。
3. 使用反向施力防毛细作用镊子夹持经辉光放电处理的载网，使镀碳膜的一面朝上。注意：必须使用防毛细作用镊子，否则镊子间的毛细作用会将液体样品从载网上吸走。
4. 将 2 μl 蛋白质样品加到辉光放电处理的载网上，静置 30 秒。注意：静置时间以及辉光放电的时长会影响蛋白质在载网上的吸附浓度。对于浓度极低的样品，需要更长的吸附时间。然而，过长的吸附时间可能导致缓冲液浓度改变，原因是水分蒸发。要获得合适的颗粒分布，通常需要通过反复试验进行优化。
5. 用滤纸吸去样品。
6. 将载网表面轻触第一滴水，然后用滤纸吸去水分。再用第二滴水重复此步骤。
7. 将载网表面短暂接触第一滴染液，随后用滤纸吸去染液。
8. 将载网表面接触第二滴染液 20 秒，然后用滤纸吸去染液。
9. 使用真空干燥载网。注意：也可将载网置于实验台或通风橱中自然晾干。真空干燥的优点是可以立即在电镜下观察载网；但快速干燥可能产生的假象是染色不均匀。

5. 透射电子显微镜

1. 本演示中使用的显微镜为 FEI 公司的 Tecnai T12，配备 Gatan 4K x 4K CCD 相机。
2. 插入样品前，简要检查显微镜的光路对中情况；注意：每次电镜使用期间仅需执行一次。在型号合适的显微镜上，可预先保存接近完美的对中状态。加载该对中文件即可将显微镜恢复至接近完美的对中条件。
3. 将电镜载网装入单倾标准样品 holder 中。
4. 将 holder 插入 T12 的 CompuStage，等待抽真空过程完成。
5. 将 holder 插入镜筒。
6. 对样品进行聚焦，并设定所需的欠焦值，通常为 -1.5 µm。注意：聚焦可通过手动方式（使用最小对比度法）实现，也可通过 CCD 相机采集实时图像并计算实时傅里叶功率谱来完成。
7. 使用 CCD 相机记录图像；
8. 在负染蛋白质样品的图像中，蛋白质通常呈现为白色对比度，即在较暗背景上的白色密度。需注意，尽管同一载网上不同区域的蛋白质浓度通常较为接近，但染色程度在不同区域可能存在差异。某些区域可能出现染色不均，甚至出现正染（蛋白质在亮背景上呈暗色），而其他区域则染色良好。因此，通常需要在载网上寻找适合成像的优质区域。

6. 代表性结果

展示了负染样品的典型优质图像示例，包括马脾铁蛋白（图4A）、Fab片段（图4B）、古菌20S蛋白酶体（图4C）和核小体（图4D）。

图1. 负染透射电镜用碳膜载网的制备。 A) 将透射电镜载网以紧密排列的方式逐个放置在火棉胶膜表面。B) 放置一张略大于载网区域的纸片。C) 等待纸片完全润湿。D) 将纸片连同载网一起取出，进行空气干燥。

图2. 用碳镀覆电镜载网。 A）设置碳蒸发装置：将两根碳棒装入镀膜设备中，其中一根（左侧）尖端削成尖锐的锥形，另一根（右侧）具有平坦表面，并与对面碳棒的尖端接触。B）在载玻片的一侧涂少量真空脂。黑色框线内的区域已涂有真空脂。C）设置待镀覆的载网。玻璃载片用于固定纸片位置。箭头所指为涂有真空脂的区域。D）镀膜完成后，覆盖真空脂区域的载玻片颜色未发生变化。颜色对比可指示所镀碳膜的厚度。

图3. 负染色步骤示意图。 A) 新配制的（左侧）甲酸铀酰溶液透明澄清，无沉淀迹象。1~2周后，试管底部开始出现沉淀物积累。B) 在一片Parafilm上分别放置两滴（约25 μl）蒸馏水和两滴甲酸铀酰溶液。使用防毛细作用镊子夹持经辉光放电处理的碳膜载网，使碳膜面朝上。在载网上滴加一滴样品（约2 μl）。C) 静置30秒后，用滤纸吸去液体。D) 将载网翻转，使样品面接触第一滴水。重复步骤C和D，完成染色过程。

图4. 负染色蛋白质样品的透射电镜图像示例。 A) 马脾铁蛋白，B) 抗原结合片段（Fab），C) 古菌20S蛋白酶体，以及 D) 核小体。所有图像均以相同放大倍数采集。标尺为20 nm。

讨论

负染电镜是一种强大的工具，可用于研究纯化蛋白质样品的三维结构，例如使用随机锥形倾斜⁸方法，该方法需要采集一对图像：一份来自倾斜60°的样品区域，另一份来自同一区域但未倾斜的样品，以计算大分子复合物的三维重构。此外，负染电镜还可用于多种其他应用，例如筛选膜蛋白的二维（2D）晶体⁹、观察蛋白质复合物在不同构象状态下的形态¹⁰，或简单地用于观察纯化蛋白质样品的均一性及/或异质性，从而为优化蛋白质纯化流程提供反馈信息等。该技术可成为生物化学家强有力的实验手段。本文介绍了从制备碳支持膜载网到在电子显微镜下采集负染蛋白质样品图像的完整操作流程。如图所示，该流程相对简单且易于操作。若旨在通过随机锥形倾斜法计算样品的三维重构，则必须获取倾斜配对图像；但若仅进行单颗粒分析，则采集多张未倾斜图像即可。无论哪种情况，后续均需进行图像处理，相关内容已超出本视频文章的范围。

与任何方法一样，该实验方案也存在多种变异。在大多数情况下，甲酸铀酰作为负染色试剂效果非常好。醋酸铀酰是另一种常用的负染色试剂，其作用方式与甲酸铀酰非常相似，但颗粒尺寸较大，且在许多情况下对比度低于甲酸铀酰。使用醋酸铀酰的优点在于其溶液比甲酸铀酰更稳定，无需每隔一至两周重新配制新鲜溶液。甲酸铀酰和醋酸铀酰均为酸性物质，因此一个明显的担忧是低pH值可能引起所研究蛋白样品的结构变化。然而，这两种染色液同时也具有蛋白质固定剂的功能。先前的研究已表明，它们均能快速固定蛋白样品⁷。这种快速固定作用使得低pH值的影响变得不那么重要，因为在染色过程中，蛋白样品在低pH引发任何改变之前就已经被固定。尽管如此，当低pH值成为关注问题时，其他负染色试剂（如钼酸铵和磷钨酸）可能在染色样品时获得更优的结果⁷。钼酸铵和磷钨酸的pH值接近中性，但这些染色剂所产生的蛋白样品对比度通常不如甲酸铀酰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
火棉胶	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml，溶于乙酸戊酯，浓度2%
铜质载网（Gilder Cu grids）	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200目
Cressington 208C 高真空涡轮碳镀膜仪	Ted Pella, Inc.	9260
双头碳棒	Ted Pella, Inc.	58
甲酸铀酰	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	纯度99.9%
PELCO easiGlow 等离子清洗系统	Ted Pella, Inc.	91000	在当地药店购买
Whatman #1 滤纸	Fisher Scientific	09-805E