方法文章

帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

51K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3234

⸱

2012年2月14日

 ,  , 
1Centre for Neurobiology of Stress, Dept Biological Sciences, University of Toronto at Scarborough

本文内容

摘要

本文描述了一种在小鼠中进行单侧内侧前脑束6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的实验方案。该方法死亡率较低（13.3%），存活小鼠中有89%表现出纹状体多巴胺含量减少>95%，且对侧旋转偏差达90.63±4.02%，偏向损毁侧。

摘要

帕金森病（PD）的单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁大鼠模型已被证明在推动我们理解帕金森症状潜在机制方面具有不可估量的价值，因为它重现了帕金森病患者中观察到的基底神经节环路和药理学变化1-4。然而，纹状体内输出通路的皮质-纹状体突触上发生的精确细胞和分子变化仍不清楚，而纹状体作为基底神经节的主要输入区域，被认为是帕金森症状潜在病理异常发生的部位3,5。

在帕金森病（PD）研究中，随着细菌人工染色体（BAC）小鼠模型的发展，针对黑质-纹状体通路退变后基底神经节环路变化机制的理解取得了显著进展。这些BAC小鼠通过特异性启动子驱动绿色荧光蛋白在纹状体两条输出通路中过表达（直接通路：eGFP-D1；间接通路：eGFP-D2 和 eGFP-A2a）8，使得这两条通路可被独立研究。例如，近期研究表明，在帕金森病小鼠模型中存在突触可塑性的病理改变9,10。然而，这些研究使用的是幼年小鼠和帕金森病的急性模型。目前尚不清楚在具有稳定6-OHDA损毁的成年大鼠中所观察到的变化是否同样存在于这些模型中。其他研究团队曾尝试通过损毁内侧前脑束（MFB）建立稳定的单侧6-OHDA损毁成年小鼠PD模型，但该实验的死亡率极高，仅有14%的小鼠存活21天或更长时间11。较新的研究通过黑质内注射建立损毁模型，不仅死亡率较低，且多巴胺能神经元损失超过80%>，但这些研究中左旋多巴（L-DOPA）诱导的异动症表达存在较大变异性11,12,13,14。另一种广泛使用的PD小鼠模型是MPTP损毁小鼠模型15。尽管该模型在评估潜在神经保护剂方面具有重要价值16，但在揭示PD症状潜在机制方面适用性较差，因为该模型常难以诱导出明显的运动功能障碍，且损毁程度存在较大个体差异17, 18。

本文通过将6-OHDA直接注射至内侧前脑束（MFB），建立了一种稳定的单侧6-OHDA损毁帕金森病（PD）小鼠模型，该模型可导致纹状体多巴胺水平持续减少>95%（通过高效液相色谱法测定），并产生在已充分表征的单侧6-OHDA损毁PD大鼠模型中所观察到的行为失衡。这一新建立的PD小鼠模型将有助于深入理解帕金森症状发生机制，成为一项重要的研究工具。

方案

1. 小鼠的饲养与准备

  1. 维持一个由细菌人工染色体（BAC）驱动的转基因小鼠品系8（突变小鼠区域资源中心（MMRRC）FVB品系），饲养于12:12小时明暗循环环境中，并可自由获取食物和水。这些小鼠为纯合FVB品系，无需与其他任何品系小鼠杂交，无论用于繁殖目的或确保6-OHDA损毁手术的成功。
  2. 为建立帕金森病模型，需使用出生后31至42天（P31-42）的成年小鼠进行6-OHDA损毁手术及假手术操作。
  3. 为降低感染风险，术前24小时在饮用水中给予拜耳锐（Baytril，抗生素）。

2. 手术用药的准备

在注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）之前，通常需对啮齿类动物预先给予去甲替林和反苯环丙胺，以提高6-OHDA诱导损伤的选择性和有效性。去甲肾上腺素/5HT再摄取抑制剂去甲替林可减少6-OHDA引起的去甲肾上腺素和5HT的耗竭22，而单胺氧化酶抑制剂反苯环丙胺则通过降低突触外6-羟基多巴胺的降解，增强多巴胺能末梢对6-OHDA的敏感性31。

  1. 预用药（盐酸去甲替林和盐酸帕吉林）可大量配制，并在 -80°C 下保存至使用。根据当天接受手术的小鼠数量，称取适量的盐酸去甲替林，使每只小鼠获得 25 mg/kg。由于小鼠体重较轻，难以精确递送小体积液体；因此将盐酸去甲替林配制成 2.5 mg/ml 的浓度，并以 10 ml/kg 的剂量给予动物。必须考虑化合物中盐成分的重量，以达到正确的浓度。盐酸去甲替林中盐酸盐重量的校正：盐酸去甲替林的分子量（MW）：302.84，HCl 的分子量：36.46，游离碱的分子量：266.38，校正因子：302.84 / 266.38 = 1.137。配制 10 ml 溶液所需：= 2.5 mg/ml 去甲替林 × 10.0 ml × 校正因子 = 2.5 mg/ml × 10.0 ml × 1.137 = 28.43 mg 盐酸去甲替林
  2. 根据当天接受手术的小鼠数量，称取适量的盐酸帕吉林，使每只小鼠获得 5 mg/kg。如上所述，需对化合物中的盐成分进行校正。由于小鼠体重较轻，难以精确递送小体积液体；因此将盐酸帕吉林配制成 0.5 mg/ml 的浓度，并以 10 ml/kg 的剂量给予动物。
    盐酸帕吉林中盐酸盐重量的校正：
    盐酸帕吉林的分子量：195.69，HCl 的分子量：36.46
    游离碱的分子量：159.23，校正因子：195.69 / 159.23 = 1.229
    配制 10 ml 溶液所需称取的量：
    = 0.5 mg/ml 帕吉林 × 10.0 ml × 校正因子
    = 0.5 mg/ml × 10.0 ml × 1.229
    = 6.15 mg 盐酸帕吉林
  3. 将 28.43 mg 盐酸去甲替林和 6.15 mg 盐酸帕吉林加入一个 10 ml 玻璃量筒中，加入 8 ml 无菌生理盐水（0.9%）。涡旋混合并加热至 45°C，直至完全溶解。此时溶液的 pH 值约为 3，若直接给予小鼠会引起不适，并导致术后泌尿系统和胃肠道功能相关的并发症。逐滴加入 NaOH（1 M），调节 pH 至 7.4。用无菌生理盐水（0.9%）定容至 10 ml，涡旋混匀。标记、注明日期，并在约 -80°C 下冷冻保存。由于盐酸帕吉林在室温下不溶于生理盐水，在整个手术期间，应将预用药混合物置于手术室中加热至 37°C 的水浴中保存。
  4. 6-羟基多巴胺（6-OHDA）溶液必须在手术前立即配制。用于溶解盐酸-6-羟基多巴胺（6-OHDA.HBr）的溶剂为含有抗坏血酸（0.2%）的无菌生理盐水（0.9%）。抗坏血酸可防止 6-OHDA.HBr 氧化为无活性形式，从而起到稳定作用。称取 0.2 g 抗坏血酸，加入一个空的 1 L 量筒中，用无菌生理盐水（0.9%）定容至 1 L 并搅拌。标记、注明日期，按需保存于约 -80°C。
  5. 称取适量的 6-OHDA.HBr，配制成 15.0 mg/ml 的溶液，使每只小鼠获得 3.0 μg。由于 6-OHDA.HBr 对光和热敏感，应避免光照，并在称量前置于冰上。
    6-OHDA.HBr 中氢溴酸盐重量的校正：
    6-OHDA.HBr 的分子量：250.09，HBr 的分子量：79.9，游离碱的分子量：170.19
    校正因子：250.09 / 170.19 = 1.47
    配制 0.5 ml 溶液所需称取的量：
    = 15.0 mg/ml 6-OHDA × 0.5 ml × 校正因子
    = 15.0 mg/ml 6-OHDA × 0.5 ml × 1.47
    = 11.03 mg 6-OHDA.HBr
  6. 将 6-OHDA.HBr 称入一个用铝箔包裹的无菌 1.0 ml 离心管中，加入 0.5 ml 溶剂（无菌生理盐水（0.9%），含 0.02% 抗坏血酸，pH 7.4）。涡旋至完全溶解，标记后立即置于冰上，直至使用。注意，6-OHDA 溶液必须在配制后约 6 小时内使用。若溶液在配制后立即或手术过程中变为深棕色，表明 6-OHDA.HBr 已发生氧化，不再具有神经毒性，必须弃用并重新配制。
  7. 对于假手术组动物，配制与 6-OHDA 损毁组动物相同体积的溶剂（无菌生理盐水（0.9%），含 0.02% 抗坏血酸，pH 7.4），置于用锡箔包裹的 1.0 ml 无菌离心管中，标记后立即置于冰上，直至使用。

3. 设置手术装置

手术器械在手术前必须使用高压灭菌器进行灭菌。每次手术之间，手术器械须在95%乙醇中灭菌，随后加热至250°C维持2分钟。所有实验必须遵循所属机构及国家相应的动物护理委员会的指导方针进行。

  1. 在安装设备之前，使用异丙醇清洁所有表面和设备。处理洁净的外科器械时应佩戴无菌手套。
  2. 设置一个大鼠恢复笼，笼底铺上纸巾，置于加热灯下或加热垫上。
  3. 设置麻醉推车，确保氧气进气管已连接并打开，异氟烷储液罐已完全加满。将氧气流速设为1 L/min，异氟烷浓度设为2–4%。理想情况下，麻醉机应具备两个出气口，分别用于将氧气与异氟烷混合气体输送至诱导室，以及在动物处于立体定位仪期间维持麻醉。
  4. 正确组装输注装置对于确保成功造模至关重要，因为装置中残留的空气或针头堵塞会减少在损毁部位输注的6-OHDA体积。按照图1所示方式组装输注装置。将一个RN金属螺帽套在PEEK管的一端（RN压接套件（接头1/16th 英寸），然后依次安装PEEK杯状卡套和标准PFA卡套。安装时应使标准PFA卡套的锥形端能够顺利插入PEEK杯状卡套的配合部分。将组件装入双小接头RN连接器（#1）中，并确保连接紧密。在双小接头RN连接器的另一端插入33号规格的进样针，将针穿过其中一个RN金属螺母并拧紧。确保33号规格进样针处于适当位置 180° 将PEEK管的一端以适当角度连接至双小接头RN耦合器（#1）。在PEEK管的另一端，依次穿入一个RN金属螺母、PEEK卡套，然后是PFA卡套。将金属螺母与卡套组件插入第二个双小接头RN耦合器中，并拧紧连接。在第二个双小接头RN耦合器（#2）的另一端插入鲁尔接头转小接头RN转换器（鲁尔转换器），并拧紧连接。
  5. 接下来必须对输注装置进行预充（见图1）。将 250 μl 和 1.0 μl Hamilton 注射器，内装无菌水，确保无气泡。连接 250 μl 将注射器连接至鲁尔接头，并下压注射器活塞 250 μl 注射器，使水从管路另一端的33号注射针头流出。在推动水通过系统的同时，持续抽拉 250 μl 将注射器从鲁尔接头中拔出，使鲁尔接头末端留有一小滴水珠。按压注射器的推杆 1.0 μl 注射器，直至有微小水珠排出。小心插入 1.0 μl 将注射器插入鲁尔接头时，务必确保水珠位于 1.0 μl 注射器与鲁尔接头上的水滴接触并完全插入 1.0 μl 将注射器插入鲁尔接头。确保小型双RN接头耦合器中无气泡。
  6. 系统已预灌注完毕，可将灌注装置固定于立体定位仪框架和输注泵上。将连接有33号注射针头的小型双通RN接头通过夹具固定在立体定位仪框架的操纵臂上，然后夹紧 1.0 μl 将注射器连接至灌注泵，使得灌注泵启动时注射器被压紧于夹具上而无法移动。设置输液泵以允许设定的输注速率 0.1 μl/min.

4. 单侧6-OHDA损毁手术

  1. 手术前30分钟，称量每只动物的体重并记录。使用连接1 ml注射器的27号针头，按10 ml/kg剂量通过腹腔注射（i.p.）给予一只小鼠盐酸去甲替林（2.5 mg/ml，Sigma Aldrich）和盐酸帕吉林（0.5 mg/ml，Sigma Aldrich）溶液（溶于0.9%无菌生理盐水，pH 7.4）。例如，一只30.0 g的小鼠将接受300 μl的术前用药。开启加热板并将其置于耳杆和门齿杆下方。加热板有助于在手术期间维持动物体温，并使动物处于适合立体定位仪耳杆和门齿杆的高度。
  2. 给予盐酸去甲替林和盐酸帕吉林溶液后15分钟，将小鼠放入密闭麻醉室中，通过吸入异氟烷（2–3%溶于O2）进行麻醉。当动物对后肢夹捏无反应且无眨眼反射时，表明已达到充分麻醉状态。
  3. 剃除小鼠头部顶部的毛发，并使用棉球将局部麻醉剂利多卡因直接涂抹于皮肤表面。利多卡因涂抹5分钟后，用聚维酮碘溶液对动物头部进行消毒。
  4. 将动物置于适用于小鼠的立体定位仪中。首先将动物固定于门齿杆上（门齿杆设置：-3.0 至 +2.0 mm），并将麻醉面罩覆盖在动物面部。调节氧气流速至1 L/min，异氟烷浓度至1.5–2%。门齿杆应相对于耳杆调整至适当水平，使颅骨顶部保持水平。插入耳棒（直径5.0 mm）。当头部完全平整且无法向任何方向移动时，表明耳棒已正确插入。
  5. 使用手术刀片沿小鼠头部正中线切开皮肤，并将皮肤向两侧牵开。用纱布擦干颅骨表面。
  6. 压下1.0 μl微量注射器的推杆，将33号注射针插入包裹锡箔的1 ml试管中，该试管内含有6-OHDA溶液（15 mg/ml）。保持33号注射针浸没在6-OHDA溶液（15 mg/ml）中，缓慢回抽1.0 μl微量注射器的推杆以吸取溶液。
  7. 沿颅骨正中线做1 cm长切口。将注射针尖推进至前囟，从33号注射针中缓慢释放少量6-OHDA溶液，形成微小液滴。缓慢降低注射针尖至前囟位置，当液滴接触前囟时停止推进针尖，并记录该坐标。将注射针向背侧回撤2 mm，沿矢状缝前后方向移动至后囟。从33号注射针中再次释放少量6-OHDA溶液形成微小液滴。缓慢降低注射针尖至后囟，当液滴接触后囟时停止推进针尖，并记录该坐标。前囟与后囟的内侧-外侧（ML）和背侧-腹侧（DV）坐标应一致；若不一致，应相应调整门齿杆以校正前后（AP）坐标，调整耳棒以校正ML坐标。根据《小鼠脑立体定位坐标图谱》25，将针头移至相对于前囟的AP: -1.2 mm，ML: -1.1 mm处。回撤针头，使用25号针头在颅骨上钻孔。
  8. 将注射针重新移至上述坐标位置，并将针插入至DV: -5 mm深度。以0.1 μl/min的速度单侧向内侧前脑束注入0.2 μl的6-OHDA或对照溶剂（总量3 μg）。注射完成后，保持针头在原位5分钟，以促进药物从注射部位扩散。
  9. 缓慢回撤注射针。
  10. 使用三针缝合关闭头皮切口，并皮下注射（s.c.）1 ml乳酸林格氏液。
  11. 将动物从立体定位仪中取出，置于恢复笼中直至意识恢复。

5. 6-羟基多巴胺损毁动物的术后护理

  1. 将动物放入笼子中（每笼3只小鼠），自由摄取食物和含糖水（10 mM）。在笼底的食物容器中提供Nutra-gel和KMR（幼猫代乳粉），以刺激食欲和胃肠道蠕动。
  2. 术后每天检查小鼠，持续2周24。每次检查时应特别注意动物的警觉性，通过评估其在笼内活动能力来判断。还应观察上一观察周期的食物和水摄入量，以及粪便的存在与否及其性状。常见的术后并发症是脱水，表现为皮肤捏压后回缩缓慢。若发现此情况，应皮下注射1 ml乳酸林格氏液，持续1周或直至症状改善。对于雄性动物，应仔细观察生殖器是否有阴茎脱出，表现为阴茎发红。若发生此情况，应在患病动物阴茎上涂抹mucol凝胶，并皮下注射1 ml乳酸林格氏液，持续1周或直至症状改善。
  3. 每天称量动物体重，以监测体重变化。
  4. 若腹腔注射导致胃肠道系统出现轻微撕裂，可能引发腹腔感染。因此，应评估是否存在腹部感染，表现为腹部肿胀膨隆。可通过在饮水中添加Baytril治疗3–4天，或持续至症状改善。

6. 帕金森病评估

为了评估损伤程度，在6-OHDA损毁手术后14-21天进行行为学评估，此时多巴胺的耗竭程度达到最大并趋于稳定26。

  1. 腹腔注射每克体重0.01 ml的0.9%无菌生理盐水后，将小鼠放入玻璃圆筒（11 cm × 9.5 cm）中，并使用摄像机（CG9, Sanyo）记录其活动。
  2. 回放视频，分别计数小鼠相对于损伤侧同侧和对侧方向完成的360°完整旋转次数。
  3. 同侧旋转所占比例越高，表明动物的帕金森样症状越严重，因此应计算同侧旋转次数占总旋转次数（对侧与同侧旋转之和）的百分比。

7. 采用高效液相色谱法测定纹状体多巴胺含量

  1. 在6-OHDA损毁手术至少21天后，并完成行为学研究后，通过过量麻醉处死小鼠，小心取出脑组织。保留一片纹状体组织（230 μm) 来自每只小鼠的两个半脑，并在切片后立即速冻，随后于 -80°C 直至纹状体样本制备完成。
  2. HPLC样品缓冲液（0.1 M PCA含2 mM谷胱甘肽）可防止从纹状体样品中提取的多巴胺降解。
    对于 100 ml 样品缓冲液：
    = 100 ml 高效液相色谱级 H2O
    = 0.862 ml PCA（70%）（Sigma）
    61.5 mg 谷胱甘肽（还原型）
    量取高效液相色谱级 H2O，加入PCA，将谷胱甘肽溶解于溶液中，充分混匀并过滤。样品缓冲液可保存于 4°C 长达1个月。
  3. 在冰上解冻纹状体切片，然后在 200 μl 使用超声细胞破碎仪（Fisher Sonic，USA）裂解样品。操作过程中始终将样品置于冰上，每个样品重复匀浆3次，每次10秒，每次匀浆间隔确保样品充分冷却。
  4. 放置一旁 20 μl 每份匀浆样品（储存于 -80°C用于蛋白质测定
  5. 离心样品（20,800 × g，20 分钟）4°C，Eppendorf 58-04R，USA），然后去除上清液并通过滤膜过滤 0.2 μm PVDF膜（Pall，货号：1935-28143-310）并置于-80℃保存80°C 直至进行高效液相色谱（HPLC）分析。将蛋白质沉淀保留作为蛋白质定量检测的备用样品。
  6. 高效液相色谱流动相的制备，用于流经高效液相色谱柱。
    对于1 L流动相：
    60 mM NaH2PO4.2O（一碱式）= 8.27 g
    30 mM 柠檬酸 = 5.7 g
    0.13 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物 = 48 mg
    0.16 mM 十二烷基硫酸钠（SDS）= 45 mg
    850 ml HPLC级水（Caledon，货号：8801-7）
    15% v/v 乙腈-190（pH 3.35）= 150 ml 高效液相色谱级（Caledon，货号：1401-7）
    ~2 μl 10 M NaOH（溶于HPLC级H2O）
    所有试剂应尽可能达到≥99.0%纯度且为HPLC级。水和乙腈必须为HPLC级。流动相需在配制后一周内使用。应专用洁净玻璃器皿和搅拌子用于流动相的配制（包括1个1 L玻璃量筒和至少2个1 L玻璃烧瓶）。在配制流动相前，准备好两个洁净的1 L烧瓶，一个用于溶解，另一个用于过滤和脱气时转移溶液。流动相需在高效液相色谱仪中循环过夜，使用前应确认基线平稳。
  7. 量取700 ml HPLC级水至玻璃量筒中，溶解NaH2PO4.2O、柠檬酸、EDTA 和 SDS。加水至 850 ml。
  8. 使用 10 M NaOH 将 pH 调至 3.35，然后加入乙腈，并用聚四氟乙烯涂层搅拌子混合溶液。
  9. 在第二个洁净的空1 L烧瓶中放入一根搅拌子，并通过真空过滤将流动相滤入其中 0.22 μm HVLP Millipore 滤膜：（货号：SLGP033RS）。用85:15 H2O/ACN 在过滤前。移动相完全过滤后，在真空条件下搅拌至少 10 分钟以脱气。
  10. 制备用于测定纹状体样本中多巴胺浓度的标准品。每批纹状体样本前后均需运行标准品，以进行高效液相色谱（HPLC）分析。可预先配制1 mg/ml的多巴胺储备液并储存于 20 μl -80°C 分装保存80°C将5 mg多巴胺溶解于5 ml样品缓冲液（见上文）中，充分混匀以配制储备液。开始配制标准品时，取 5 μl 1 mg/ml 储备液，加入 2.5 ml 样品缓冲液中，充分混匀以获得 2 μg/ml 多巴胺溶液
  11. 通过高效液相色谱法（HPLC）运行四种标准品以生成浓度曲线。多巴胺的浓度分别为：100 ng/ml、50 ng/ml、25 ng/ml 和 12.5 ng/ml。为获得上述四种多巴胺浓度，需进行如下操作 10 μl 的 2 μg/ml 多巴胺溶液（按7.10制备）并加入 190 μl 加入样品缓冲液，配制浓度为 100 ng/ml 的多巴胺溶液。随后用样品缓冲液对 100 ng/ml 的多巴胺溶液进行 1:1 系列稀释。只需取 100 μl 100 ng/ml 多巴胺并加入 100 μl 加入样品缓冲液并混匀，配制成 50 ng/ml 的多巴胺，然后取 100 μl 50 ng/ml 多巴胺并加入 100 μl 加入样品缓冲液并混匀，以配制浓度为25 ng/ml的多巴胺等溶液。
  12. 为准备高效液相色谱系统（Waters 1525μ Binary泵，717plus自动进样器，Symmetry C-18反相柱（15 cm × 4.6 mm 内径， 5 μm 粒径) (30°C），配备双电极分析池（ESA 5011A）的电化学检测器（ESA Coulochem III），并由Breeze软件（Waters）控制，首先通过计算机软件选择清洗程序或按照制造商说明用流动相冲洗系统。此步骤将高效液相色谱系统中所有先前溶液置换为新鲜流动相。
  13. 将第一和第二电极的电化学电位分别设置为 400 mV 和 -300 mV。随后，以 1 ml/min 的流速运行流动相，至少平衡系统 2 小时，理想情况下过夜。在平衡过程中，应开启检测池并监测基线读数，当读数稳定后，系统即可使用。在平衡的前 1 小时内，将系统流出的流动相导入废液容器；此后可将出口管路插入流动相瓶中，使流动相在高效液相色谱系统中循环使用。
  14. 将纹状体样本在冰上解冻，然后注射 20 μl 每种多巴胺标准品，随后进行2次x 20 μl 每个样品以及另外的 20 μl 将每种多巴胺标准品注入平衡后的高效液相色谱系统，流动相流速为1 ml/min。
  15. 使用高效液相色谱系统软件分析标准品和样品中多巴胺峰的峰面积。将纹状体样品中多巴胺峰的峰面积与标准多巴胺浓度曲线进行比较，可确定样品中多巴胺的含量 20 μl 每个纹状体样本中的多巴胺含量。将此数值按比例放大，以计算整个纹状体切片中的总多巴胺含量。
  16. 对样品进行标准蛋白质定量分析 20 μl 取你在步骤7.4中预留的纹状体匀浆液，测定纹状体样本中的蛋白质浓度（单位为mg/ml）。据此计算纹状体样本中多巴胺的含量（单位为ng/mg），以便比较不同半球之间以及不同小鼠之间的多巴胺浓度。

8. 代表性结果

在6-OHDA损毁手术后15至21天，神经毒素引起的细胞死亡已基本完成26，此时可通过腹腔注射生理盐水后测量动物自发的360°旋转行为，以评估6-OHDA损毁是否成功（图2）。该行为学评估方法简便快捷，且避免了使用多巴胺能药物（如安非他明或阿扑吗啡）激发试验可能带来的致敏效应。此外，与前肢爪放置试验相比，自发旋转行为是预测多巴胺损耗<95%动物的更佳指标27。通过将行为学实验结束后采用HPLC法测定的纹状体样本中多巴胺水平与每只动物自发同向旋转的百分比进行相关性分析，我们发现，表现出70%或更高比例朝向6-OHDA损毁侧同向旋转的动物，其纹状体多巴胺含量已丧失>95%（图3）27。在内侧前脑束部分6-OHDA诱导的损毁（59.44±17.20）（图3）情况下，测量自发旋转行为时未观察到同向与对侧旋转之间存在显著偏侧化倾向（40.91±8.01）（图2）。因此，正如在大鼠中向内侧前脑束给予6-OHDA后所观察到的结果，可导致黑质-纹状体多巴胺能神经元的严重丧失，而腹腔注射生理盐水是筛选此类动物6-OHDA损毁程度的准确方法。

静力平衡装置示意图，双毂联轴器，注射器配置，RNA 引物过程。

图1. 6-羟基多巴胺损毁手术中注射针装置组装的示意图。

显示假手术组、6-羟基多巴胺损毁组和部分6-羟基多巴胺损毁组每分钟同侧旋转百分比的柱状图。

图2. 假手术组与6-OHDA损毁小鼠旋转行为的评估。假手术组与6-OHDA损毁小鼠的自发旋转行为。数据以同侧旋转的平均百分比±标准误（SEM）表示，其中对侧旋转与同侧旋转总和为100%。空心柱：假手术动物；灰色柱：多巴胺损失>95%的6-OHDA损毁动物；黑色柱：接受6-OHDA损毁手术但为部分损毁的动物。*** 与假手术组相比，P<0.001。采用单因素方差分析，随后进行Dunn多重比较检验（假手术组：n=17；6-OHDA损毁（>95%）组：n=23；部分6-OHDA损毁组：n=3）。

假手术与6-OHDA损毁后纹状体多巴胺水平的柱状图比较；统计学分析。

图3. 使用高效液相色谱法（HPLC）评估假手术组和6-OHDA损毁小鼠的纹状体多巴胺水平。在假手术组和6-OHDA损毁动物的手术侧与未手术侧半脑中测定纹状体多巴胺含量。数据以未手术侧纹状体多巴胺水平的均值百分比 ± 标准误（SEM）表示。空心柱：假手术动物；灰色柱：多巴胺损失 >95% 的6-OHDA损毁动物；黑色柱：接受6-OHDA损毁手术但为部分损毁的动物。*** P<0.001，** P<0.01，与假手术动物相比。采用单因素方差分析，随后进行Dunn多重比较检验（假手术组：n=17，6-OHDA损毁（>95%）：n=23，部分6-OHDA损毁：n=3）。

比较假手术组与6-OHDA损毁大鼠中脑黑质致密部TH+细胞的柱状图，神经科学研究。

图4. 假手术组与6-OHDA损毁小鼠黑质致密部（SNc）中酪氨酸羟化酶免疫反应性的评估。作为黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元丢失的标志，假手术组和6-OHDA损毁动物手术侧与未手术侧半脑中酪氨酸羟化酶（TH）阳性免疫组织化学染色的丢失情况，按照Thiele等（已接受发表）所述方法进行测定。数据以未手术侧纹状体TH阳性细胞的平均百分比±标准误（SEM）表示。空心柱：假手术动物；灰色柱：多巴胺能神经元丢失>95%的6-OHDA损毁动物；黑色柱：接受6-OHDA损毁手术但为部分损毁的动物。*** P<0.001，** P<0.01，与假手术动物相比。采用单因素方差分析，随后进行Dunn多重比较检验（假手术组：n=17，6-OHDA损毁（>95%）：n=23，部分6-OHDA损毁：n=3）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了一种用于建立稳定的单侧6-OHDA损毁帕金森病小鼠模型的方法，该方法具有极高的可重复性、高损毁成功率以及低死亡率。6-OHDA损毁手术的成功可通过自发性旋转行为的测量进行简便评估，其中>70%的同侧旋转行为提示损毁侧纹状体中多巴胺含量减少>95%27。相较于通过计数黑质致密部中TH阳性细胞数量来评估损毁程度，对纹状体多巴胺水平的定量分析是衡量纹状体多巴胺耗竭程度最为准确的方法，因其可直接反映纹状体多巴胺水平28。鉴于本方案所采用的注射位点（中脑内侧前脑束，MFB）及损毁发展时间（21天）与已被充分表征的单侧6-OHDA损毁帕金森病大鼠模型一致1,4，可认为该小鼠模型与大鼠模型类似，能够重现帕金森病患者中观察到的药理学变化及脑环路改变。因此，本方法为在转基因小鼠中建立帕金森病症状模型提供了有效手段。鉴于转基因小鼠是研究分子和蛋白质在活体（in vivo）条件下从分子、细胞到整体组织水平功能的极为强大的工具，将这两种技术相结合，将极大有助于进一步阐明帕金森病症状产生的分子与细胞机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了加拿大外交和国际贸易部（加拿大政府）、多伦多大学康诺特基金、加拿大创新基金会、自然科学与工程研究理事会（NSERC）、克伦比尔基金会以及治愈帕金森信托基金的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盐酸去甲丙咪嗪Sigma-AldrichD12525mg/kg
盐酸帕吉林Sigma-AldrichP80135mg/kg
6-羟基多巴胺氢溴酸盐Sigma-AldrichH1163mg/只小鼠
立体定位仪框架Kopf InstrumentsModel 900
小鼠耳杆套件Kopf InstrumentsModel 921 Zygoma Ear Cups
小鼠门齿杆Kopf InstrumentsModel 923B
小鼠麻醉面罩Kopf InstrumentsModel 923B
预装引管套件（含250ml注射器）Hamilton CoPRMKIT 81120
RN压缩接头套件（1 mm）Hamilton Co55750-01
RN压缩接头套件中的PEEK管材<（1/16英寸）Hamilton Co55751-01
双通道小型中心接头RN连接器Hamilton Co55752-01
鲁尔接头转小型中心接头RN适配器Hamilton Co55753-01
1ml 25S型注射器，型号7001KHHamilton Co80100
*33G可拆卸针头（RN），6支装。定制1英寸，45<°斜面Hamilton Co7803-05
剪刀Fine Science Tools14084-08
手术刀Fine Science Tools10003-12
手术刀片Fine Science Tools10035-20
镊子Fine Science Tools11608-15
止血钳Fine Science Tools13004-14
异氟烷Abbott Laboratories022413152-3%
缝线（Vicryl 4.0）SynetureSS-683
灭菌器Fine Science Tools18000-45
输注泵Harvard ApparatusPhD 22/2000
针头（27G）BD Biosciences305109
针头（25G）BD Biosciences305127
注射器（1ml）BD Biosciences309692
麻醉车LEI medicalM2000
拜耳新CDMV, St. hyacinthe, QC102207
利多卡因CDMV, St. hyacinthe, QC3914
聚维酮碘溶液CDMV, St. hyacinthe, QC19955

参考文献

  1. Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
  2. Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
  3. Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
  4. Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
  5. Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
  6. Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
  7. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
  8. Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
  9. Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
  10. Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
  11. Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
  12. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  13. Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
  14. Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
  15. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
  16. Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
  17. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  18. Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
  19. Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
  20. Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
  21. Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
  22. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  23. Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
  24. Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
  25. Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
  26. Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
  27. Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
  28. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
  29. Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
  30. Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
  31. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

6

相关文章