帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

摘要

本文描述了一种在小鼠中进行单侧内侧前脑束6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的实验方案。该方法死亡率较低（13.3%），存活小鼠中有89%表现出纹状体多巴胺含量减少>95%，且对侧旋转偏差达90.63±4.02%，偏向损毁侧。

摘要

帕金森病（PD）的单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁大鼠模型已被证明在推动我们理解帕金森症状潜在机制方面具有不可估量的价值，因为它重现了帕金森病患者中观察到的基底神经节环路和药理学变化^1-4。然而，纹状体内输出通路的皮质-纹状体突触上发生的精确细胞和分子变化仍不清楚，而纹状体作为基底神经节的主要输入区域，被认为是帕金森症状潜在病理异常发生的部位^3,5。

在帕金森病（PD）研究中，随着细菌人工染色体（BAC）小鼠模型的发展，针对黑质-纹状体通路退变后基底神经节环路变化机制的理解取得了显著进展。这些BAC小鼠通过特异性启动子驱动绿色荧光蛋白在纹状体两条输出通路中过表达（直接通路：eGFP-D1；间接通路：eGFP-D2 和 eGFP-A2a）⁸，使得这两条通路可被独立研究。例如，近期研究表明，在帕金森病小鼠模型中存在突触可塑性的病理改变^9,10。然而，这些研究使用的是幼年小鼠和帕金森病的急性模型。目前尚不清楚在具有稳定6-OHDA损毁的成年大鼠中所观察到的变化是否同样存在于这些模型中。其他研究团队曾尝试通过损毁内侧前脑束（MFB）建立稳定的单侧6-OHDA损毁成年小鼠PD模型，但该实验的死亡率极高，仅有14%的小鼠存活21天或更长时间¹¹。较新的研究通过黑质内注射建立损毁模型，不仅死亡率较低，且多巴胺能神经元损失超过80%>，但这些研究中左旋多巴（L-DOPA）诱导的异动症表达存在较大变异性^11,12,13,14。另一种广泛使用的PD小鼠模型是MPTP损毁小鼠模型¹⁵。尽管该模型在评估潜在神经保护剂方面具有重要价值¹⁶，但在揭示PD症状潜在机制方面适用性较差，因为该模型常难以诱导出明显的运动功能障碍，且损毁程度存在较大个体差异^{17, 18}。

本文通过将6-OHDA直接注射至内侧前脑束（MFB），建立了一种稳定的单侧6-OHDA损毁帕金森病（PD）小鼠模型，该模型可导致纹状体多巴胺水平持续减少>95%（通过高效液相色谱法测定），并产生在已充分表征的单侧6-OHDA损毁PD大鼠模型中所观察到的行为失衡。这一新建立的PD小鼠模型将有助于深入理解帕金森症状发生机制，成为一项重要的研究工具。

方案

1. 小鼠的饲养与准备

1. 在12小时光照/12小时黑暗循环条件下维持细菌人工染色体（BAC）驱动的转基因小鼠品系⁸（突变小鼠区域资源中心（MMRRC）FVB），并自由提供食物和饮水。这些小鼠为纯合FVB品系，无需与其他任何品系小鼠杂交，无论出于繁殖目的或确保6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁手术成功均无需杂交。
2. 为建立帕金森病模型，需使用出生后31至42天（P31-42）的成年小鼠进行6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁手术及假手术。
3. 为降低感染风险，术前24小时在饮水中给予拜耳锐（Baytril，抗生素）。

2. 手术用药的准备

在注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）之前，通常需对啮齿类动物预先给予去甲丙咪嗪和反苯环丙胺，以提高6-OHDA诱导损伤的选择性和有效性。去甲肾上腺素/5-HT再摄取抑制剂去甲丙咪嗪可减少6-OHDA引起的去甲肾上腺素和5-HT的耗竭²²，而单胺氧化酶抑制剂反苯环丙胺则通过降低突触外6-羟基多巴胺的降解，增强多巴胺能末梢对6-OHDA的敏感性³¹。

1. 预用药（盐酸去甲替林和盐酸帕吉林）可大量配制，并在 -80°C 下保存至使用。根据当天接受手术的小鼠数量，称取适量的盐酸去甲替林，使每只小鼠获得 25 mg/kg 的剂量。由于小鼠体重较轻....

讨论

本方案描述了一种用于建立稳定的单侧6-OHDA损毁帕金森病小鼠模型的方法，该方法具有极高的可重复性、高损毁成功率以及低死亡率。6-OHDA损毁手术的成功可通过自发性旋转行为的测量进行简便评估，其中>70%的同侧旋转行为提示损毁侧纹状体中多巴胺含量减少>95%²⁷。相较于通过计数黑质致密部中TH阳性细胞数量来评估损毁程度，对纹状体多巴胺水平的定量分析是衡量纹状体多巴胺耗竭程度最为准确的方法，因其可直接反映纹状体多巴胺水平²⁸。鉴于本方案所采用的注射位点（中脑内侧前脑束，MFB）及损毁发展时间（21天）与已被充分表征的单侧6-OHDA损毁帕金森病大鼠模型一致^1,4，可认为该小鼠模型与大鼠模型类似，能够重现帕金森病患者中观察到的药理学变化及脑环路改变。因此，本方法为在转基因小鼠中建立帕金森病症状模型提供了有效手段。鉴于转基因小鼠是研究分子和蛋白质在活体（in vivo）条件下从分子、细胞到整体组织水平功能的极为强大的工具，将这两种技术相结合，将极大有助于进一步阐明帕金森病症状产生的分子与细胞机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸去甲丙咪嗪	Sigma-Aldrich	D125	25mg/kg
盐酸帕吉林	Sigma-Aldrich	P8013	5mg/kg
6-羟基多巴胺氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	H116	3mg/只小鼠
立体定位仪框架	Kopf Instruments	Model 900
小鼠耳杆套件	Kopf Instruments	Model 921 Zygoma Ear Cups
小鼠门齿杆	Kopf Instruments	Model 923B
小鼠麻醉面罩	Kopf Instruments	Model 923B
预装引管套件（含250ml注射器）	Hamilton Co	PRMKIT 81120
RN压缩接头套件（1 mm）	Hamilton Co	55750-01
RN压缩接头套件中的PEEK管材<（1/16英寸）	Hamilton Co	55751-01
双通道小型中心接头RN连接器	Hamilton Co	55752-01
鲁尔接头转小型中心接头RN适配器	Hamilton Co	55753-01
1ml 25S型注射器，型号7001KH	Hamilton Co	80100
*33G可拆卸针头（RN），6支装。定制1英寸，45<°斜面	Hamilton Co	7803-05
剪刀	Fine Science Tools	14084-08
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
手术刀片	Fine Science Tools	10035-20
镊子	Fine Science Tools	11608-15
止血钳	Fine Science Tools	13004-14
异氟烷	Abbott Laboratories	02241315	2-3%
缝线（Vicryl 4.0）	Syneture	SS-683
灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
输注泵	Harvard Apparatus	PhD 22/2000
针头（27G）	BD Biosciences	305109
针头（25G）	BD Biosciences	305127
注射器（1ml）	BD Biosciences	309692
麻醉车	LEI medical	M2000
拜耳新	CDMV, St. hyacinthe, QC	102207
利多卡因	CDMV, St. hyacinthe, QC	3914
聚维酮碘溶液	CDMV, St. hyacinthe, QC	19955