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小鼠心脏动作电位与钙瞬变的光学标测

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DOI：

10.3791/3275

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2011年9月13日

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1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

本文内容

摘要

本文详细介绍了在完整分离的Langendorff灌注小鼠心脏中进行跨膜电位（Vm）和细胞内钙瞬变（CaT）光学标测时的解剖操作、仪器设置及实验条件。

摘要

小鼠心脏是心血管研究中常用的模型，因为该物种具有低成本的基因工程技术。利用多种跨膜电位（Vm）、钙瞬变（CaT）及其他参数的荧光探针，可方便地对小鼠心脏进行心血管生理表型分析。兴奋-收缩耦联的特征是动作电位与细胞内钙离子动态变化，因此，从心脏同一位置同步记录Vm和CaT至关重要1-4。对经Langendorff灌流的小鼠心脏进行同步光学标测，有望揭示心力衰竭、心律失常、代谢性疾病及其他心脏疾病的潜在机制。细胞水平的研究无法实现对大量位点的激活、传导速度、动作电位时程及其他参数的可视化，而光学标测技术则能很好地解决这一问题1,5,6。本文介绍了基于先进CMOS成像技术，在小鼠心脏上以高时空分辨率同步进行Vm和CaT光学标测的仪器配置与实验条件。该方法获得的稳定光学记录结果表明，对Langendorff灌流小鼠心脏进行同步光学标测是可行且可靠的。

方案

1. 储备液的高级制备

  1. 提前用去离子水配制两份 Tyrode's 溶液（16x）储备液，并于 4°C:
    1. 储备液 I（119.872 g/L NaCl，3.056 g/L CaCl₂）2 (2H2O）、5.6 g/L KCl、2.6274 g/L NaH2PO4，3.408 g/L MgCl2 (6H2O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));
    2. 储备液 II（26.88 g/L NaHCO₃，Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）。
  2. 配制荧光染料的储备液。为避免反复冻融，我们保存 30 μl 两种染料的等分试样置于 -20°C，这足够进行一次实验：
    1. 电压敏感性染料 RH237（Invitrogen，Carlsbad，CA）储备液，1.25 mg/mL 的二甲基亚砜（DMSO，Sigma，St. Louis，MO）溶液；
    2. 钙指示剂 Rhod-2AM（Invitrogen，Carlsbad，CA）储存液，1 mg/mL 的 DMSO 溶液。
  3. 提前配制兴奋-收缩耦联抑制剂blebbistatin储存液（Tocris Bioscience，美国密苏里州圣路易斯，2 mg/mL DMSO溶液），并将溶解后的blebbistatin储存于 4°C.

2. 准备灌注溶液和实验装置7

  1. 新鲜配制 2 L 台氏液（含 128.2 mM NaCl、1.3 mM CaCl2 (2H2O)、4.7 mM KCl、1.05 mM MgCl2 (6H2O)、1.19 mM NaH2PO4、20 mM NaHCO3、11.1 mM D-葡萄糖的去离子水溶液，pH = 7.35 ± 0.05）。若使用储备液配制 2 L 台氏液（足够一次实验使用），则取 1750 mL 去离子水，加入 125 mL 储备液 I、125 mL 储备液 II 和 4 g 葡萄糖，混匀。
  2. 开启灌流系统的两台泵。将用于逆向灌流的蠕动泵（Peri-Star，WPI，Sarasota，USA）设定为 40 mL/min；将用于表面灌流并将灌流液返回储存槽的另一台蠕动泵（Cole-Parmer Masterflex L/S 蠕动泵，Cole-Parmer Instrument Company，Vernon Hills，Illinois）设定为 80 mL/min。
  3. 用 70% 乙醇清洗灌流系统 30 分钟，随后用 2 L 去离子水冲洗。
  4. 当灌流室内的去离子水完全排空后，开始循环台氏液，并使其通过一个 5-μm 滤器（Millipore，Billerica，MA，USA）。使用水浴夹套和循环器（ThermoNESLAB EX7，Newtown，USA）将灌流液加热至 +37°C，并通过向溶液中通入 O2/CO2（95% / 5%）混合气体进行氧合。使用 pH 计（Oakton Instruments，Vernon Hills，IL）监测溶液 pH，并调节 O2/CO2 气体通入速率，使 pH 维持在 7.35 ± 0.05。实验过程中持续监测 pH 和温度。
  5. 双通道光学标测装置由两台 MiCAM Ultima-L CMOS 相机（SciMedia，Costa Mesa，CA）组成，具有高空间分辨率（100×100 像素，每像素 230±20 μm）和高时间分辨率（1,000–3,000 帧/秒）。在指定用于钙成像的相机前安装带通滤光片（590±15 nm，Thorlabs，Newton，NJ）；而在指定用于电压成像的相机前则需放置长通滤光片（>700 nm，Thorlabs，Newton，NJ）。两台相机通过一个含有二向色镜（635 nm 截止波长，Omega Optical，Brattleboro，VT）的支架相互垂直排列。双相机支架正下方装有一枚镜头（Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235052），用于将来自心脏的发射光聚焦至二向色镜。工作距离约为 3 cm。
    激发光由卤素灯（Newport Oriel Instruments，Stratford，CT；SciMedia，Costa Mesa，CA）产生，依次通过热滤光片、快门和带通滤光片（520±45 nm）。柔性导光管将经带通滤光后的激发光引导至标本，同时使用快门控制仅在图像采集期间对标本进行光照，以避免荧光染料发生光漂白。
  6. 提前准备好用于起搏和信号记录的 Ag/AgCl2 电极，并在放置心脏前将其安装至灌流室中。确保放大器和滤波器已调节至适当水平。

3. 收集小鼠心脏，插管并建立兰格多夫灌流

  1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪麻醉（氯胺酮，80 mg/kg 体重；赛拉嗪，10 mg/kg 体重）和肝素（100 单位），并确认无痛反射以确保适当的麻醉深度。
  2. 行胸骨中线切口后，迅速取出心脏，并在充氧（95% O2，5% CO2）、恒温（37±1°C）的台氏液中清洗。
  3. 在解剖显微镜下快速识别主动脉，并在右锁骨下动脉远端对升主动脉进行整齐切割。将一小段主动脉连接至自制的21号带喇叭口尖端的套管。使用4-0黑色编织丝线（Surgical Specialties Corporation, Reading, PA）将心脏固定在套管上。插管后，以台氏液逆行灌注并同时进行表面灌流。调节逆行灌注速度至2–5 mL/min，使主动脉压力维持在60–80 mmHg（压力传感器，World Precision Instruments Inc (WPI), Sarasota, USA；桥式放大器 TBM4M，WPI, Sarasota, USA）。
  4. 心脏插管完成后，剥离并移除肺、胸腺及脂肪组织。
  5. 将分离的心脏用针（Fine Science Tools）在心尖部固定于灌流室底部（Sylgard包被），以防止液流引起的心脏移动。同时将左右心耳拉直并用针（Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA）固定于灌流室底部，以提供最大的心房光学测量表面积。
    非常重要！ 通过肺静脉将一根细硅胶管插入左心室，并用丝线将其固定于邻近结缔组织。此举可防止左心室内滞留灌流液积聚和酸化，尤其在使用兴奋-收缩去耦联剂抑制心室收缩后更为重要（见第4部分第19步）。
  6. 将自制电极置于心脏表面，用于传递由Master-8（A.M.P Instruments Ltd, Jerusalem, Israel）或PowerLab 26T（AD Instruments, Sydney, Australia）产生的起搏刺激。
  7. 在心脏上方的溶液表面固定一小块盖玻片，以减少溶液振动引起的心脏运动伪影。
  8. 将激发光聚焦于心脏表面，并调节双相机装置与心脏之间的距离，以获得最高分辨率图像。
  9. 关闭室内所有光源，开始使用PowerLab 26T进行电生理记录。

4. 加载电压和钙离子敏感性染料以及兴奋-收缩解偶联剂

  1. 将 0.6 mL 的 blebbistatin 预热。取 0.5 mL blebbistatin 与灌注液储液罐中的灌注液混合。将剩余的 0.1 mL blebbistatin 用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过靠近套管的给药口缓慢注入（持续 20 分钟）。观察 blebbistatin 逐渐减少运动伪影的过程。
  2. 将 30 μL 电压敏感性染料 RH237 原液用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过与 blebbistatin 相同的注射口在 5–7 分钟内缓慢注入。
  3. 将 30 μL 钙离子指示剂 Rhod-2 AM 与 Pluronic F127（Invitrogen, Carlsbad, CA，DMSO 中 20% 溶液）按 1:1 比例混合，随后用 1 mL Tyrode 溶液稀释，并通过同一注射口在 5–10 分钟内缓慢施加。
  4. 等待 5–10 分钟，使 blebbistatin 和染料充分到达细胞膜和胞质。当运动完全被抑制后，继续后续实验步骤。
  5. 在整个实验过程中持续监测心电图记录，以确保心脏电生理功能正常。
  6. 使用 SciMedia 定制软件（SciMedia, Costa Mesa, CA）开始荧光信号记录。

5. 代表性结果：

用于荧光成像的光学显微镜装置，配备滤光片；用于分析细胞内 Ca²⁺ 水平。
图 1. 灌流、电记录与光学标测的实验装置。
EM=发射光；Lp=长通滤光片

心电图研究、心脏刺激装置；包含心房、心室信号、电极、心电图示意图。
图 2. 心室起搏期间记录的实验装置及信号示例。左侧：心电图信号由 Ag/AgCl2 圆盘电极采集（上图），并展示了一个 S1S1 刺激方案的示例（下图）。中间：Langendorff 灌流小鼠心脏装置。右侧：显示了来自心房（上图）和心室（下图）的代表性光学动作电位和钙瞬变信号。黄色箭头（上图）指向来自心室的荧光信号散射，该信号在心房记录中可见。
LV=左心室；RV=右心室；LA=左心房；RA=右心房

使用电极记录心脏信号；Vm 和 CaT 图形分析；电极设置、结果图表。
图 3. 野生型小鼠心脏心室中 Vm 和 CaT 的代表性光学记录。A. 实验装置示意图，黑色圆点标记了均匀分布的记录位点，其光学记录结果见 (C)。B. 来自阵列中心位置（见 (C) 中方框区域）的 Vm 和 CaT 记录示例。C. 来自均匀分布位点阵列的 Vm（蓝色）和 CaT（红色）信号。信号按 3×3 像素进行合并处理。

心脏激活时间与电压动态示意图；包含起搏、Vm、dV/dt 图形。
图 4. 激活图与传导。A. 野生型小鼠心脏的激活图示例，白色箭头指示横向（T）和纵向（L）方向。B. 对应于 A 中三个点（T1、T2、T3；L1、L2、L3）的 Vm 信号（上图）和 dV/dt（下图）。

在对照和异丙肾上腺素条件下APD80与CaD80的心脏图谱比较；动作电位，钙瞬变。
图 5. 动作电位和钙瞬变持续时间分析。A. 显示了在对照条件下（左）和应用30 nM异丙肾上腺素后（右）心脏的动作电位在80%复极化时的持续时间（APD80）以及钙瞬变在80%舒张时的持续时间（CaD80）图谱。右侧心室中的黄/绿色表明异丙肾上腺素缩短了APD80和CaD80。B. 野生型小鼠心室（上）和心房（下）的APD80与CaD80典型记录示例。

讨论

在本实验中，我们通过添加一根细小的硅胶管对兰格多夫（Langendorff）灌流法进行了改进，这一改进在使用兴奋-收缩解偶联剂抑制心室收缩后尤为关键。该硅胶管用于防止灌流液淤积、灌流液酸化以及左心室缺血的发生。小鼠心脏对低温极为敏感；因此，心脏各部位的温度差异将导致动作电位时程出现人为差异。为此，在灌流腔室中引入了加热系统，以确保整个实验过程中温度恒定维持在37°C8。由于兰格多夫模型无法保留心脏的神经支配，因此在灌流液中需考虑添加神经递质，以研究生理性的交感和副交感张力9。除了逆行灌流外，对心脏进行表面灌流（superfusion）有助于维持适宜的环境参数，如pH值和温度。在本方法中，兰格多夫灌流的心脏被水平放置。也可采用垂直式兰格多夫灌流装置10，但这可能导致心脏力学特性出现轻微差异11。除CMOS相机外，也可使用其他检测器同时进行膜电位（Vm）和钙瞬变（CaT）的成像映射12。

使用高时空分辨率的CMOS相机可确保记录的准确性；然而，光学标测信号并非来自单个细胞。实际上，每个荧光信号均来自数百至数千个细胞，具体取决于光学放大倍数。由于心室荧光信号较强，可能因光散射而扭曲心房信号，因此需要谨慎解读光学记录的信号。小鼠心脏制备的另一局限性在于，由于心脏体积小导致表面曲率较大，从而引起信号失真和噪声13。传导速度的测量不仅可能受小鼠心脏曲率的影响，还可能受电极极性和虚拟电极的影响。为了准确获得传导速度、激活各向异性及复极化图谱，必须将相机精确聚焦于心脏表面。

该方法中，实时心电图记录可作为心脏电生理学光学研究的补充。本方案采用电压敏感性染料（RH237）和钙离子指示剂（Rhod-2AM），因其响应速度快、激发光谱相似且发射光谱不同3,7。除RH237和Rhod-2AM外，也可使用其他染料组合来测量Vm和CaT3。一种新型电压敏感性染料PGHI具有较大的斯托克斯位移（>200 nm），由于PGHI与Rhod-2AM的发射波长分离更明显，可获得更佳的Vm和CaT信号14。未来的研究改进方向可能包括探索新型荧光探针、开发新型成像探测器以及改进图像处理软件。更高分辨率的成像以及用于三维光学标测的新型光学成像模式，也是光学标测技术未来的重要发展方向5。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

NIH 基金项目 R01 HL085369

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NaCl费舍尔科技S271-1
CaCl2 (2H2O)费舍尔科技C79-500
KCl费舍尔科技S217-500
MgCl2 (6H2O)费舍尔科技M33-500
NaH2PO4 (H2O)费舍尔科技S369-500
NaHCO3费舍尔科技S233-3
D-葡萄糖费舍尔科技D16-1
Blebbistatin拓可生物科技1760
RH237英维特罗根S1109
Rhod-2AM英维特罗根R1244
Pluronic F127英维特罗根P3000MP
二甲基亚砜 (DMSO)西格玛-奥德里奇D2650
PowerLab 26T figure-materials-1 ADInstruments

参考文献

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CMOS

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