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一种简易的Chelex法从按蚊属（Anopheles spp.）中提取DNA

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DOI：

10.3791/3281

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2013年1月9日

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1Malaria Institute at Macha, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种快速且经济的方法，用于从蚊虫标本中提取高质量的疟原虫及媒介DNA。该方法利用Chelex树脂的螯合特性，可简便地对蚊虫中肠和唾液腺阶段的疟原虫进行基因分型，同时通过PCR实现对Anopheles复合种的分子鉴定。

摘要

作为疟疾防控项目的重要组成部分，地方性流行国家正越来越多地采用分子工具，以高效地对疟原虫和媒介蚊虫进行分型、鉴定和监测1,2,3,4,5。为了在行动研究中可持续地推广应用这些准确的方法，从而加强疟疾防控与消除工作，亟需操作简便且成本低廉的技术，其试剂和设备需求应尽可能精简6,7,8。本文介绍一种基于Chelex的简易技术，用于从野外采集的蚊虫样本中提取疟原虫和媒介蚊虫的DNA。

我们通过对赞比亚马查疟疾研究所周边2,000 km2范围内家庭卧室中通过击倒法采集的156只蚊虫进行形态学鉴定，获得了72只Anopheles gambiae sl.蚊虫。将这72只Anopheles gambiae sl.蚊虫的头胸部与腹部解剖分离后，分别将两部分置于1.5 ml微量离心管中，并加入20 μl去离子水中。使用无菌移液器吸头，将每部分蚊虫组织在去离子水中分别充分匀浆至均匀悬浮状态。将所得匀浆液各取10 μl保留，另10 μl转移至另一已灭菌的1.5 ml离心管中。分别对这两份等分试样采用简化的Chelex法或标准盐析法进行DNA提取9,10。盐析法之所以得名并被广泛使用，是因为其在DNA提取过程中的蛋白质沉淀步骤采用高浓度盐溶液，替代了有害有机溶剂（如苯酚和氯仿）9。

提取物用作PCR扩增的模板，引物靶向节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）4号亚基基因（ND4），以检测DNA质量11；同时进行一种用于鉴定Anopheles gambiae复合种的PCR10，以及一种用于Plasmodium falciparum感染分型的巢式PCR12。通过DNA质量（ND4）PCR比较显示，Chelex法相对于成熟的盐析法具有93%的敏感性和82%的特异性。在使用复合种鉴定PCR时，相应的敏感性和特异性分别为100%和78%；在P. falciparum检测PCR中则分别为92%和80%。在全部三种PCR应用中，Chelex法与常规盐析法在产生扩增产物信号的样本比例上均无显著差异。Chelex法仅需三种简单试剂，耗时37分钟即可完成；而盐析法则需要10种不同试剂，处理时间长达2小时47分钟，其中包括一个过夜步骤。我们的结果表明，Chelex法与现有的盐析提取法效果相当，可作为一种简单且可持续的替代方法，适用于试剂供应链难以持续维持的资源有限地区。

方案

1. 蚊虫标本的预备解剖

  1. 将蚊子置于一小片石蜡膜上，并固定在解剖显微镜下。
  2. 滴加去离子水覆盖样本，以软化组织。
  3. 在胸部与腹部连接处精确切开蚊体，从而分离头部和胸部与腹部组织。
  4. 将每只蚊子的各解剖部位转移至已预先标记蚊子编号信息并标明身体部位（e.g. “m”代表中肠部位；“ht”代表头部和胸部部位）的洁净灭菌1.5 ml微量离心管中。
  5. 丢弃使用过的石蜡膜，并在处理下一只蚊子前，用70%酒精浸湿的无尘纸仔细擦拭显微镜载物台。

2. 蚊虫标本的DNA提取

  1. 将 20 μl 去离子水加入样本管中，用移液枪头将浸没的蚊虫组织部分研磨成均匀悬浮液。
  2. 向样本匀浆中加入 100 μl 经高压灭菌的 1X PBS/1% 皂苷溶液，轻轻短暂涡旋混匀。
  3. 室温孵育 20 分钟。
  4. 在 20,000 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。
  5. 将沉淀物重悬于 100 μl 1X PBS 中。
  6. 再次在 20,000 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。
  7. 通过轻柔涡旋（5 秒），将沉淀物重悬于 75 μl 无菌去离子水和 25 μl 20% w/v Chelex-100 树脂悬浮液（溶于去离子水）中。
  8. 使用经酒精灯火焰灭菌的无菌 23G 皮下注射针头在样本管盖上穿刺一个小孔。
  9. 将样本悬浮液置于浮架（或加热块）上的水浴中煮沸 10 分钟。
  10. 在 20,000 x g 离心 1 分钟，将所得 DNA 溶液转移至预先标记的储存管中，作为 PCR 应用的模板使用。

3. 恶性疟原虫基因分型与按蚊属物种的分子鉴定

  1. 加入 2.5 μl Chelex DNA 提取物至 25 μl PCR 反应体系中，用于检测 DNA 质量11、鉴定 Anopheles 种类10 以及对 P. falciparum12 的中肠和唾液腺感染进行基因分型。
  2. 为最大化扩增产物产量，尤其是针对 P. falciparum 的检测，应在 PCR 反应中加入 1.5X 牛血清白蛋白（BSA）。推荐的反应体系如下：（2.5 μl 模板，0.25 μM 引物，1.5 μM 氯化镁，200 μM dNTPs，1X PCR 缓冲液，1.5X BSA 和 1.0 U Taq DNA 聚合酶，总体积为 25 μl）。
  3. 为检测提取物中的 DNA 质量，扩增节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADH）4 号亚基（ND4）基因的一段区域（引物 ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3'] 和 ND4RV [5'-CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3']；预期产物大小为 400 bp）11,13。
  4. 为区分 Anopheles gambiae sl. 复合群中的同胞种（仅限 An. gambiae ss 和 An. arabiensis），扩增位于基因间区（IGS）SNP 位点侧翼的区域（引物 UN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3']，GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT-3']，AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']；预期产物大小为 An. gambiae ss 390 bp，An. arabiensis 315 bp）10,11。
  5. 为对 P. falciparum 抗叶酸类药物耐药相关多态性进行分型，采用巢式 PCR 扩增寄生虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因中编码氨基酸密码子 108、51、59、16 和 164 位点的侧翼区域：
    第一轮引物：M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3'] 和 M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
    第二轮引物：M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3'] 与 F/ [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
    或
    F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3'] 与 M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3']。
    同时扩增 P. falciparum 二氢蝶酸合酶（DHPS）基因中包含氨基酸密码子 436、437、540、581 和 613 的区域：
    第一轮引物 R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3'] 与 R/ [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3']；
    第二轮引物
    J: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] 与 K/ [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3']
    或
    K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3'] 与 K/
    或
    L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3'] 与 L/ [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3']12。
  6. 取 4 μl 扩增产物，在 30 μl 反应体系中按照制造商说明进行等位基因特异性限制性内切酶消化，以检测与抗叶酸类药物耐药相关的多态性12。
  7. 每泳道加入 5 μl PCR 扩增产物（或 15 μl 限制性酶切产物）至含溴化乙锭的 2% 琼脂糖凝胶中，进行电泳（100–120 V），并在紫外透射仪下观察条带。

结果

PCR检测蚊虫DNA提取质量（图1）、Anopheles arabiensis 的分子鉴定（图2）以及 P. falciparum 检测（图3）的结果示例表明，尽管步骤显著减少（表1），简化的Chelex法所得结果与标准盐析法10相当。由于两种方法获得的DNA质量相近，因此在按麦克尼马尔卡方检验分析时，针对An. gambiae复合种的样本阳性率以及寄生虫感染率之间均无统计学差异（图3）。

灵敏度（%）的计算公式为 TP/(TP+FN)×100，其中 TP 表示真阳性，FN 表示假阴性。特异性（%）的计算公式为 TN/(TN+FP)×100，其中 TN 表示真阴性，FP 表示假阳性。在以标准盐析法作为金标准进行比较时，DNA 质量（ND4）PCR 检测对 Chelex 法的灵敏度为 93%，特异性为 82%。采用同胞种鉴定 PCR 时，相应的灵敏度和特异性分别为 100% 和 78%；用于 P. falciparum 检测的 PCR，其相应的灵敏度和特异性分别为 92% 和 80%。

在简化版Chelex法和常规盐析法中，向反应体系中添加BSA均可通过缓解PCR抑制物的影响，普遍提高PCR阳性率（图3）14；但除Chelex提取物的DNA质量（ND4 PCR）外（p = 0.039），该提高均无统计学显著性。对P. falciparum DHFR（或其他目标基因）扩增子进行等位基因特异性限制性内切酶消化，可实现对蚊虫中肠和唾液腺疟原虫感染的耐药等位基因进行基因分型（图4；唾液腺数据未显示）。

简易 Chelex 操作步骤标准盐析法操作步骤
步骤试剂步骤试剂
  1. 将样本加入 1.5 ml 微离心管中，并在 100 μl 1X PBS/1% 皂苷溶液中匀浆（2 分钟）。
  2. 室温静置 20 分钟。
  3. 以 20,000 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。
  4. 加入 100 μl 1X PBS，短暂涡旋混匀（3 秒）。
  5. 以 20,000 × g 离心 2 分钟，弃去上清液。
  6. 加入 25 μl 20% w/v Chelex 水溶液（去离子水配制）和 75 μl 无菌去离子水。
  7. 用灼热的无菌 23G 皮下注射针头在样品管盖上刺一个小孔，将管内容物煮沸 10 分钟。
  8. 将微离心管以 20,000 × g 离心 1 分钟。
  9. 将上清液转移至无菌预标记小瓶中，DNA 溶液保存于 -20 °C 待用（2.5 μl 用于 25 μl PCR 反应）。
 PBS

皂苷
Chelex-100 胶珠
  1. 将样本加入 1.5 ml 微离心管中，并在含 1% DEPC 的 100 μl Bender 缓冲液*中匀浆（2 分钟）。
  2. 65 °C 孵育 1 小时。
  3. 加入 15 μl 冷的 8 M 醋酸钾溶液，轻轻混匀后冰上孵育 45 分钟。
  4. 将样品在微离心管中以 20,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新的 1.5 ml 管中。
  5. 加入 250 μl 100% 乙醇，通过倒置混匀充分混合。
  6. 室温孵育 5 分钟。
  7. 以 20,000 × g 离心 15 分钟。
  8. 吸除并弃去上清液，使沉淀在管中完全干燥（30 分钟）。
  9. 将沉淀在 20 μl 含 RNA 酶（10 μg/ml）的 0.1X SSC 缓冲液中重悬，4 °C 过夜。
  10. 加入 80 μl DEPC 水，-20 °C 保存待用。
 焦碳酸二乙酯（DEPC）
*Bender 缓冲液：
0.1 M NaCl
0.2 M 蔗糖
0.1 M Tris-HCl

0.05 M EDTA，pH 9.1

DEPC 水配制的 0.5% SDS

8 M 醋酸钾

乙醇

0.1X 柠檬酸钠盐水（SSC）缓冲液

RNA 酶（10 μg/ml）
总耗时：37 分钟总耗时：2 小时 47 分钟，另加过夜

表1. 从蚊虫标本中提取DNA的简易Chelex法与标准盐析法在试剂和时间需求方面的逐步比较。

显示DNA提取比较的凝胶电泳结果；泳道表示盐析法和Chelex法。
图1. 对来自中国台湾野外样本的Anopheles arabiensis蚊虫，采用简化Chelex法“C”与标准盐析法“M”提取DNA的质量进行ND4线粒体PCR比较。NC为阴性对照；M1和C1、M2和C2、M3和C3以及M4和C4为同一只An. arabiensis蚊虫标本配对的盐析法与Chelex法提取物。L为100 bp DNA ladder。

凝胶电泳结果；DNA提取，盐析法，Chelex法，315bp标记条带。
图2. 对Anopheles arabiensis的分子鉴定PCR结果。C1和M1、C2和M2、C3和M3、C4和M4分别表示同一只蚊虫样本经简化Chelex法（“C”）和盐析法（“M”）提取DNA后的扩增产物；AR为Anopheles arabiensis阳性对照；L为100 bp DNA ladder。

PCR检测结果柱状图；盐析法与Chelex法处理对加入和不加入BSA时阳性率的影响
图3. Chelex法与盐析法提取蚊虫野外样本DNA后通过PCR检测阳性并进行分子鉴定 Anopheles arabiensis (AR)10，节肢动物NADH脱氢酶基因4（ND4）DNA质量检测11以及抗叶酸药物耐药性 P. falciparum DHFR基因分型12 (F-M4). 结果显示了反应体系中添加或未添加BSA的检测结果。采用McNemar卡方检验，以确定从简化Chelex法与标准盐析法提取DNA所得PCR阳性率之间的差异是否具有统计学意义。

DNA凝胶电泳结果，蚊子中肠，522bp、326bp、196bp分离，分析方法。
图4. 简化Chelex法在蚊媒（显示中肠数据）中P. falciparum感染的基因分型中的应用，用于检测药物抗性等位基因。对P. falciparum DHFR基因密码子108侧翼扩增子进行BstN I酶切12，显示蚊子样本（M1-M5；显示中肠数据）中存在环氯胍抗性S108T突变株。U，未酶切的522 bp扩增子；FCR3，携带S108T的P. falciparum实验室标准阳性对照克隆；K1，携带环氯胍敏感型S108N的P. falciparum实验室标准阴性对照克隆；L，100 bp DNA ladder。

讨论

本文介绍的简化Chelex法能够从蚊虫标本中提取适用于多种PCR应用的高质量Anopheles spp和P. falciparum DNA。该技术可用于疟疾传播媒介蚊虫的分子鉴定，以及国家疟疾防控项目中对蚊体内耐药性P. falciparum等位基因的监测。简化Chelex法的优势包括操作简便、所需试剂更少从而降低成本、安全性高，且处理时间（37分钟）短于标准方案（如盐析法10需2小时47分钟并包含过夜步骤，表1）。上述优点以及试剂需求极少（仅3种试剂），相较于当前标准方案（需10种试剂，表1）11,15，使得简化Chelex法特别适用于疟疾流行地区实验室，因为在这些地区持续的试剂供应链往往难以维持。该方法的一个局限性是，与标准方案一样，也可能受到蚊虫体壁中常见PCR抑制物的影响16。然而，通过在检测中加入BSA可轻易缓解此问题。BSA也已被成功用作其他PCR应用中对抗抑制物的扩增增强剂17,18。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢马查地区的首领、村长及社区居民在蚊虫野外样本采集过程中始终如一的合作与支持。Doug Norris 博士和 Rebekah Kent 提供了关于盐析法实验方案的宝贵专业技术支持。本研究由约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所试点资助系统提供资金支持。蚊虫和寄生虫DNA实验室标准品由美国模式培养物保藏中心（MR4）慷慨捐赠。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Chelex-100，50-100 干筛目数BioRad#143-2832
皂苷SIGMA142-7425
牛血清白蛋白（BSA）New England BiolabsB9001S

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