本文介绍了一种从鼠类盲肠中回收的Pseudomonas aeruginosa中可靠提取RNA的方法。所获得的RNA在数量和质量上均足以用于后续的qPCR、转录谱分析和RNA测序实验。该技术可适用于其他肠道微生物的RNA提取。
本文内容
摘要
摘要
铜绿假单胞菌 （PA）感染可导致免疫系统受损宿主出现严重的发病率和死亡率，例如白血病患者、重度烧伤患者或器官移植患者1对于发生血流感染高风险的患者，胃肠道（GI）是定植的主要储存库2，但铜绿假单胞菌（PA）从一种无症状的定植微生物转变为侵袭性且常致死的病原体的机制尚不明确。此前，我们进行了 体内 通过回收定植小鼠盲肠内细菌细胞中的PA mRNA进行转录谱分析实验 3 以鉴定宿主免疫状态改变期间细菌基因表达的变化。
与任何转录谱分析实验一样，限制性步骤在于分离出足量且高质量的 mRNA。由于胃肠道中含有大量酶、碎片、食物残渣和颗粒物，RNA 的分离具有很大挑战性。本文介绍一种从鼠类胃肠道中可靠且可重复地分离细菌 RNA 的方法。该方法采用一种已建立的铜绿假单胞菌（PA）胃肠道定植及中性粒细胞减少诱导播散的小鼠模型4。在确认 PA 胃肠道定植后，处死小鼠并收集盲肠内容物，迅速冷冻。随后通过机械破碎、煮沸、苯酚/氯仿抽提、DNase 处理以及亲和层析相结合的方法提取 RNA。RNA 的浓度和纯度通过分光光度法（Nanodrop Technologies）和生物分析仪（Agilent Technologies）进行确认（图 1）。该胃肠道微生物 RNA 分离方法也可轻松适用于其他细菌和真菌。
方案
1. 小鼠模型 P. aeruginosa 胃肠道定植与播散
- 将6-8周龄雌性C3H/HeN小鼠（Harlan）通过口服抗生素处理以耗竭共生菌群，然后如先前所述4进行铜绿假单胞菌（PA）单一定植。
2. 收集小鼠盲肠腔内容物
- 将已清洗的不锈钢研钵浸入液氮中。
- 采用二氧化碳窒息法处死小鼠。
- 将小鼠尸体固定在泡沫板上，并用95%乙醇冲洗。从胸骨至会阴部沿中线作纵向切口切开皮肤，剥离皮肤和腹膜以暴露腹腔。
- 完整切除盲肠。用镊子夹住盲肠，置于不锈钢研钵上方，用解剖剪剪断盲肠两端。
- 将装有1 ml盲肠冲洗缓冲液（10 mM TrisHCl、1 mM EDTA和200 mM NaCl）5的P1000移液器吸头插入盲肠近端，将冲洗缓冲液及盲肠腔内容物冲入不锈钢研钵中。1 ml冲洗缓冲液足以将全部盲肠内容物冲洗出来。盲肠冲洗物接触研钵后会立即冻结。
- 用无菌研杵研磨盲肠冲洗物。
- 将研磨后的冷冻盲肠腔内容物转移至浸没于干冰/乙醇浴中的50 ml聚丙烯圆锥形离心管中。
- 对每只额外的小鼠重复步骤2.2至2.7。
- 于-80°C保存。
3. 细菌RNA提取
- 在65°C水浴中，将含有1体积酸性酚/氯仿（5:1，v/v）的50 ml Oak Ridge离心管（管盖用Parafilm封口）预热（体积基于两份盲肠腔内容物的最终总体积，约为3 ml）。
- 将装于50 ml聚丙烯圆锥形离心管中的0.5体积裂解缓冲液（2% SDS、16 mM EDTA和200 mM NaCl）6煮沸5分钟。
- 将煮沸的裂解缓冲液加入盲肠腔内容物中，混匀，于100°C加热5分钟，期间定期涡旋振荡。
- 将100°C的盲肠内容物/裂解液样品加入装有65°C酸性酚/氯仿的Oak Ridge离心管中，用Parafilm密封管盖。
- 于65°C孵育10分钟，期间每2分钟涡旋振荡一次。
- 在4°C下以2,500 g离心15分钟。
- 小心转移水相（避免触及白色界面）至新的50 ml Oak Ridge离心管中。水相体积约为盲肠内容物、裂解缓冲液和酸性酚/氯仿总体积的50%。加入等体积的酸性酚/氯仿。
- 用Parafilm密封管盖，高速涡旋振荡充分混匀。
- 在4°C下以2,500 g离心15分钟。
- 重复步骤3.7至3.9，直至水相与有机相之间无可见白色界面。
- 小心将水相转移至新的50 ml Oak Ridge离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1，v/v）。
- 密封管盖，充分涡旋振荡混匀。
- 在4°C下以2,500 g离心15分钟。将水相（体积约为总反应体积的50%）转移至15 ml聚丙烯圆锥形离心管中，加入等体积异丙醇。
- 于-20°C孵育至少2小时或过夜。
- 在4°C下以2,500 g离心45分钟，管底将形成凝胶状沉淀。弃去上清液。
- 用1 ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，涡旋振荡。在4°C下以10,000 g离心5分钟。
- 弃去上清液，将离心管倒置，使沉淀在室温下干燥10分钟。
- 将RNA沉淀重悬于200 μl无RNase的水中。
4. DNase 处理（Turbo DNA-Free，Applied Biosystems）
- 加入 20 μl 10X Turbo DNase 缓冲液和 2 μl Turbo DNase，轻轻混匀。
- 在 37° 下孵育 20 分钟。
- 加入 20 μl 重悬的 DNase 失活试剂，充分混匀。
- 在室温下孵育 5 分钟，期间偶尔混匀。
- 在室温下以 10,000 g 离心 1.5 分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。
- 加入等体积的冷（4°）酸性酚/氯仿，涡旋混匀 1 分钟。
- 在室温下以 12,500 g 离心 2 分钟。
- 将水相转移至新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（49:1 v/v），涡旋混匀。
- 在室温下以 12,500 g 离心 2 分钟。
- 将水相（约总体积的 50%）转移至新管中。
- 加入 0.1 倍体积的 3M 醋酸钠（pH 5.5）和 2.5 倍体积的冰冻 100% 乙醇，涡旋混匀。
- 在 -20° 下孵育至少 2 小时，或在 -80° 下孵育 30 分钟。
- 在 4° 下以 12,000 g 离心 30 分钟。
- 弃去上清液。
- 用 1 ml 冰冻的 70% 乙醇在 4° 下以 10,000 g 离心 5 分钟洗涤沉淀。
- 弃去上清液，在空气中干燥 10 分钟。
- 将沉淀重悬于 100 μl 无 RNase 水中。可能需要置于 65° 水浴中以助溶解。
- 为检测 DNase 处理的效果，可对处理与未处理样品进行标准 RT-PCR 反应，扩增核糖体蛋白（或其他参考基因），并设置无逆转录酶对照。
5. RNA 纯化步骤（Qiagen，RNeasy 试剂盒）
- 参见Qiagen RNeasy Mini手册第56-57页（4th 第2版，2006年4月。按指示操作。
6. 代表性结果
采用本方案从两个盲肠中回收的细菌总RNA量约为2-3 μg。所获得的RNA在数量和质量上均足以用于后续的qPCR、转录谱分析和RNA测序实验。RNA纯度通常通过测定样品在260 nm与280 nm处的吸光度比值（260 nm/280 nm）7来评估，但该方法无法提供有关RNA完整性的信息。Agilent Bioanalyzer是一种基于微流控技术的平台，可用于DNA、RNA、蛋白质和细胞的片段大小分析、定量及质量控制，并采用一种称为RNA完整性数（RNA Integrity Number, RIN）8的指标来评估RNA完整性。采用本方案提取的RNA，其260/280比值范围为1.7至2.0，RIN值≥7.0。图1展示了采用本方案回收的细菌RNA在Agilent Bioanalyzer上的分析示例。
图1. 从小鼠盲肠内容物中分离并回收的Pseudomonas aeruginosa总RNA样本的Agilent Bioanalyzer电泳图谱及类凝胶图像。RIN 8.0。
讨论
本文所述的RNA提取方法可用于从鼠类胃肠道中收获足量的高质量Pseudomonas aeruginosa总RNA。该方法不仅限于P. aeruginosa，也可能适用于其他细菌。从肠道中回收足够数量的微生物会因不同微生物而有显著差异。在我们的鼠类模型中，P. aeruginosa通常在粪便中的定植水平为每克5 × 107至5 × 108 cfu/g4。由于回收的盲肠内容物约为0.5克，因此从两个盲肠中回收的P. aeruginosa数量估计为5 × 107至5 × 108 cfu。若使用其他微生物，建议先验证其在胃肠道的定植水平，再计算为获得目标cfu数量所需的盲肠个数。还需注意的是，在使用该特定鼠类模型时，未感染PA且经抗生素处理的小鼠，其盲肠内容物中无法分离出可定量的RNA。
我们的小鼠模型 铜绿假单胞菌 胃肠道定植与播散试图模拟该病原体的发病机制 P. aeruginosa 癌症和干细胞移植患者中的菌血症。在此类患者群体中，由于抗生素或化疗药物治疗（例如抗生素导致胃肠道共生菌群减少），常出现共生菌群继发性减少，从而导致致病微生物过度生长（例如单一病原菌定植） P. aeruginosa）以及免疫抑制后的继发性播散。该小鼠模型的优缺点此前已有论述。4本研究的目的是提供一种从胃肠道中分离微生物总RNA的方法。该方案可轻松适用于其他研究胃肠道微生物致病机制不同方面的鼠类模型（例如，共生菌群相互作用、细菌对炎症性肠病的影响等）。
该方法的一个优点是结合了多种裂解步骤，包括冻融、机械破碎（使用研钵和研杵研磨、匀浆）、煮沸以及化学裂解（例如SDS）。尽管包含多种裂解步骤，某些微生物（尤其是革兰氏阳性细菌以及真菌/酵母）可能仍需要额外的机械破碎。在热裂解/酸性苯酚-氯仿孵育（步骤3.5）之后，加入微珠（细菌使用0.1 mm，酵母使用0.5–0.7 mm）并进行后续的振荡破碎步骤，应足以裂解这些微生物9, 10。
鉴于从小鼠盲肠中回收的材料性质复杂，必须进行多次冷酸酚/氯仿抽提（步骤 3.7 至 3.9），才能获得适用于后续下游反应的高质量且完整的 RNA。通常需要进行 3 至 5 次冷酸酚/氯仿抽提，直至水相与有机相之间的白色界面完全消失。最后，DNase 处理（步骤 4）与 RNeasy 纯化步骤（步骤 5）的结合对于去除污染性 DNA 以及小分子非 mRNA（5S rRNA 和 tRNA）至关重要。如前所述，采用本方案所获得的 RNA 在数量和质量上均足以满足后续转录谱分析3、qPCR（未发表）以及 RNA Seq（未发表）实验的要求。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 AI62983（AYK）、AI22535（GPB）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 研钵和研杵 | Fisher Scientific | 12-947-1 | |
| 匀浆器 | Omni | TM-125 | |
| 橡树岭离心管（50 ml） | Nalge Nunc international | 3119-0050 | |
| 酸性苯酚/氯仿 | Ambion | AM9720 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| 异戊醇 | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| RNeasy 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 3M 醋酸钠 | Ambion | AM9740 | |
| 100% 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 |
参考文献
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- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
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- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
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- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
重印与许可
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