GENPLAT（GLBRC 酶平台）是一种用于发现和优化用于生物质降解的酶混合物的自动化平台。该平台可适用于多种原料以及包含多种组分的酶混合物。
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摘要
摘要
用于生物质降解的酶成本高昂，是木质纤维素类原料经济性转化为乙醇等液体运输燃料的主要障碍。我们开发了一个集成的高通量平台，称为GENPLAT，用于发现和开发新型酶及酶复合物，以从多种预处理/生物质组合中释放糖类。GENPLAT包含四个组成部分：单一纯酶、实验设计的统计学方法、生物质浆液和酶的机器人移液操作，以及释放的Glc和Xyl的自动比色测定。单一酶通过在Pichia pastoris或Trichoderma reesei中表达获得，或通过色谱法从商业酶制剂或新型微生物提取物中纯化得到。采用商用实验设计统计软件设计单纯形格子（部分因子）混合模型。利用机器人移液技术在96孔板格式中构建高度复杂的酶混合物。通过酶联比色法自动测定释放的Glc和Xyl。含有多达16种组分的优化酶混合物已在多种原料和预处理组合上进行了测试。
GENPLAT 可适用于纯酶混合物、商品化产品混合物（如 Accellerase 1000 和 Novozyme 188）、新型微生物提取物，或上述成分的组合。用于配制和测试这些混合物的 ˜10 种纯酶所需量少于 100 μ每种蛋白质的用量以及总反应数少于100次，当最终总加载量为15 mg蛋白质/g葡萄糖时。我们使用来自多个来源的酶。酶可从天然来源纯化获得，例如真菌培养物（如 黑曲霉, Cochliobolus carbonum，以及 Galerina marginata），或者可以通过在宿主（如 大肠杆菌，毕赤酵母，或丝状真菌，例如 T. reesei蛋白质也可从商业酶混合物（例如 Multifect Xylanase、Novozyme 188）中纯化获得。目前已有越来越多的纯酶可通过商业途径获取，包括糖苷水解酶、细胞壁活性酯酶、蛋白酶和裂解酶等，例如来自 Megazyme, Inc.（www.megazyme.com）、NZYTech（www.nzytech.com）和 PROZOMIX（www.prozomix.com）的产品。
采用 Design-Expert 软件（Stat-Ease, Inc.）设计单纯形格点实验方案，并用于分析响应值（本例中为葡萄糖和木糖的释放量）。混合物包含 4 至 20 种组分，各组分比例可在 0% 至 100% 之间变化。实验点通常包括极端顶点，并包含足够数量的中间点，以建立有效的模型。按照实验设计术语，我们的大多数研究属于“混合物”实验，即所有组分之和等于固定的总蛋白载量（以 mg/g 葡聚糖表示）。单纯形格点中的混合物数量取决于混合物中组分的数量以及多项式的阶数（二次或三次）。例如，一个包含 6 种组分的实验若采用增强型特殊三次模型，将涉及 63 个独立反应，该模型可检测三因素交互作用；而若采用增强型二次模型，则仅需 23 个独立反应。对于包含超过八种组分的混合物，二次实验设计更为实用，根据我们的经验，此类模型通常具有统计学有效性。
所有酶的添加量均表示为最终总添加量的百分比（在我们的实验中，通常为每克葡萄糖单元添加15毫克蛋白质）。对于“核心”酶，其最低百分比限制设定为5%。该限制基于我们的经验得出：若任一核心酶的添加量为0%，葡萄糖（Glc）和/或木糖（Xyl）的产率会非常低，导致模型质量较差，因为过多样品表现出极低的Glc或Xyl产率。设定下限的同时也确定了上限。例如，在一个六组分实验中，若每个组分的下限设定为5%，则每个组分的上限即为75%。所有其他被视为“辅助”酶的最低限制均设定为0%。“核心”与“辅助”是相对的分类，会因底物不同而有所变化；但在本研究中，从玉米秸秆中释放Glc所需的核心酶包括来自T. reesei的以下酶：CBH1（又称Cel7A）、CBH2（Cel6A）、EG1（Cel7B）、BG（β-葡萄糖苷酶）、EX3（内切-β1,4-木聚糖酶，GH10）和BX（β-木糖苷酶）。
方案
1. 酶的生产
- 通过将相应基因克隆到载体 pPICZ 或 pPICZα 中，并转化至 Pichia pastoris，在 P. pastoris 中表达蛋白质。在带挡板的 500-ml 摇瓶中以 300-ml 培养液体积进行培养，每 24 小时添加甲醇诱导一次（Banerjee 等, 2010a）。
- 通过切向流过滤对培养滤液进行浓缩和脱盐。
- 将酶以小份分装，保存于含 20% 甘油的溶液中，置于 -80°C 冷冻。酶的浓度范围为 1–10 mg/ml。
2. 实验设计
- 输入待测试酶的数量、各酶的上下限比例（例如，核心酶的下限比例为5%），以及实验设计类型（如二次或三次设计）至 Design-Expert 软件中。
- 计算数量 μg 每种酶的添加量，使其总加载量达到15 mg/g葡聚糖，然后计算每种酶的用量 μl 加入每个反应体系中。
- 根据实验设计生成Excel工作表，明确指定用于水和酶分配的源耗材、源孔、目标耗材、目标孔及转移体积，并通过“从文件转移”功能将其导入Biomek FXP软件。
3. 酶解
- 将生物质浆液悬浮于含有 5 μg/ml 四环素和 5 μg/ml 放线菌酮的 50 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）中，置于桨式储液槽内。
- 使用剪去末端 0.5 cm 的 Span-8 1000-μl 移液吸头，通过机器人将 200 μl 浆液移取至 96 孔深孔反应板的每一孔中。以 100 μl/sec 的速度混合浆液一次，然后从桨式储液槽中吸取相同体积并分配至反应板中。
- 使用已输入 Beckman FX 系统的程序，将酶液加入同一块反应板中。
- 用可穿刺封板膜密封反应板。
- 反复倒置并轻敲反应板数次，以克服表面张力。将反应板置于杂交孵育器中，在 50°C、10 rpm 振荡条件下孵育 48 小时。
4. 葡萄糖和木糖的测定
- 将反应板放入摆臂离心机中，以 1250 × g 离心 3 分钟。
- 使用 Biomek FX 的 AP96 载具，将 100 μl 上清液转移至常规 96 孔板中。
- 将板在 90–95°C 下孵育 10 分钟以灭活酶，随后以 1250 × g 离心 30 秒。
- 进行葡萄糖（Glc）测定：将 12 μl 上清液转移至常规 96 孔板中，加入 192 μl 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂。在 50°C 下孵育 20 分钟，然后在微孔板读板仪中于 510 nm 处读取吸光度。空白对照为不含酶的反应混合液。
- 进行木糖（Xyl）测定：将 4 μl 样品转移至 384 孔板中，加入检测试剂后在 340 nm 处读取吸光度。空白对照为不含酶的反应混合液。
5. 数据分析
- 根据原始生物质中已知的葡萄糖（Glc）和木糖（Xyl）含量，将吸光度值转换为相应的Glc和Xyl产率百分比。将这些百分比作为响应值导入Design-Expert软件中。检查统计参数，确保满足构建稳健模型的标准。
- 通过实验验证最佳模型的预测结果。
6. 使用 GENPLAT 的代表性结果：
（1）由单一纯蛋白制备优化的混合物。 这些结果指明了哪些酶是重要的及其所需比例，同时也明确了哪些酶不重要。在T. reesei分泌组中丰度较高的某些蛋白（Nagendran 等，2009），例如 Cip1 和 Cip2，在氨纤维膨胀（AFEX）或碱性过氧化氢（AHP）预处理的玉米秸秆中葡萄糖（Glc）的释放过程中似乎不起作用（Banerjee 等，2010b）。相反，某些蛋白的作用出乎意料地重要。例如，糖苷水解酶家族 10 和 11 的内切型木聚糖酶对 Glc 的释放均至关重要，且一种木聚糖酶无法替代另一种（Banerjee 等，2010b,c）。Cel61A 是T. reesei分泌组中的一种次要蛋白，对 Glc 释放非常重要，但对木糖（Xyl）释放则无显著作用。有些酶对 Glc 和 Xyl 的释放均起重要作用，而另一些酶则仅对其中一种糖的释放是必需的（Banerjee 等，2010c）。
一种含有16种组分的合成混合物（每种组分浓度均为0.94 mg/ml，即非优化混合物）在AFEX预处理的DDG中释放了38%的可利用葡萄糖（Glc）。在相同的水解条件下，一种优化后的混合物（其中16种组分的浓度范围为0%至32%）释放了52%的葡萄糖（Glc）（图2）。该实验说明了构建确定性混合物的实用性。
（2）针对不同预处理/底物组合优化酶系混合物的构建。目前市售的纤维素酶制剂均为“通用型”产品。实际上，最佳酶系混合物取决于底物种类和预处理方式。同一种酶制剂（如 Accellerase 1000）在相同预处理方式下作用于不同底物，或在不同预处理条件下作用于同一种底物时，其水解产率存在差异（图1）。我们已利用 GENPLAT 平台针对多种预处理方法和多种原料优化了多种纯酶的组合（Banerjee 等，2010c）。图2展示了16种纯酶在AFEX预处理的玉米秸秆、AHP预处理的玉米秸秆以及AFEX预处理的干酒糟及其可溶物（DDG）中的最优酶比例差异。由于另外五种酶（Cel61B、AbfB、Cip1、Cip2 和 Cel12A）的最优比例被确定为0%，因此图2中仅显示了11种酶的比例（Banerjee 等，2010c）。
（3）新型酶的发现。由纯化蛋白质组成的优化混合物的构建是一个持续进行的过程。当新的蛋白质以纯化形式获得（来自商业来源、异源表达或纯化）后，可将其系统地添加到当前的优化组合中进行测试。若新发现的蛋白质有助于葡萄糖（Glc）或木糖（Xyl）的释放，则可将其纳入新的优化组合中。通过这种方法，GENPLAT 成为一个用于鉴定生物质降解新酶的平台。我们制备了在不同底物上培养的除T. reesei和A. niger以外的其他真菌的提取物。其中一种特定提取物在加入核心组合后显著提高了葡萄糖产量。经分离纯化，发现其有效成分为一种新型糖苷水解酶，该酶在任何商业化酶制剂中均不存在（Banerjee 和 Walton，未发表结果）。
（4）发现更优的酶。通过GENPLAT，我们已明确哪些酶在特定生物质降解过程中最为关键，从而更清楚地知道应重点改进哪些酶。可通过在自然界中筛选或利用蛋白质工程手段来获得这些关键酶的更优版本。（一种酶可能在多个方面优于其来自T. reesei的同源物，具体取决于所需特性，例如更高的比活性、更强的协同作用、更低的蛋白水解敏感性或更优的热稳定性）。GENPLAT为评估潜在更优酶提供了有意义的平台，因为它采用真实复杂的酶组合（这一点很重要，因为生物质降解中的酶并非单独发挥作用）以及接近实际的底物（这一点同样重要，因为使用纯纤维素或其他人工底物得到的结果可能不适用于天然木质纤维素材料）。
（5）商品酶的优化。在现实中，尚无法获得足量且高纯度的酶。在实现之前，乙醇生产商必须依赖于Accellerase 1000和Multifect Xylanase等商品化产品。然而，商品酶的混合物通常比单一酶制剂表现出更优的性能，而GENPLAT可用于设计多种商品酶的优化组合。图3展示了利用GENPLAT优化四种商品酶制剂混合物的过程。在AFEX预处理的DDG中，释放Glc的最优配比为：47% Accellerase1000、27% Multifect Pectinase、22% Novozyme 188和4% Multifect Xylanase（Banerjee等，2010c）。图3B显示了四种酶制剂在AFEX-DDG中Glc产率的差异；优化后的商品酶混合物所产生的Glc产率高于单独使用Accellerase1000、单独使用SpezymeCP，或一种含16组分的合成混合物。该实验还表明，这种16组分的合成混合物缺少一种或多种实现最佳Glc释放所需的酶，而这些酶存在于一种或多种商品酶制剂中。GENPLAT可用于鉴定此类组分。
图1. 目前尚无一种商用酶制剂能够对所有底物和所有预处理方式均达到最优效果。在相似的实验条件下（研磨粒径：0.5 mm；酶添加量：15 mg/g 葡聚糖；水解条件：48 小时，50°C），比较了五种底物和三种预处理方法。 A. 使用Accellerase 1000酶解不同经AFEX预处理的底物。 B. 使用Accellerase 1000酶解经三种不同方法预处理的玉米秸秆（参见Banerjee等，2010c）。
图 2. 从经AFEX预处理的玉米秸秆（AFEX-CS）、碱性过氧化氢预处理的玉米秸秆（AHP-CS）或经AFEX预处理的干酒糟（AFEX-DDG）中释放葡萄糖（Glc）所需的11种酶的最佳比例。数据来自 Banerjee 等（2010c）。柱状图顶部的数字表示葡萄糖产率占生物质样品中总葡萄糖的百分比。
图 3. A. 使用 GENPLAT 系统优化四种市售酶制剂的混合比例，以从经 AFEX 预处理的 DDG 中释放葡萄糖（Glc）。Multifect Xylanase 的贡献最小（4%），因此未包含在本三元相图中。B. 在相同水解条件下（15 mg/g 葡聚糖酶量、48 小时、50°C），不同酶处理方式下 AFEX-DDG 的 Glc 产率。“四组分市售酶”所用比例依据图 3A 实验结果确定。
讨论
人们普遍认为，降低酶的成本对于发展经济可行的木质纤维素乙醇产业至关重要。目前市售的商品化酶制剂是多种蛋白质组成的复杂且成分不明确的混合物（Nagendran 等，2009），其主要针对酸预处理玉米秸秆进行优化。为了加快更优酶制剂的开发，多个实验室已建立了用于酶发现与表征的高通量平台。该领域的研究工作已引入了GENPLAT中也具备的一项或多项特性：酶液与生物质浆液的机器人分配、实验的统计学设计，以及葡萄糖（Glc）和木糖（Xyl）的自动化测定（Berlin 等，2007；Decker 等，2009；Kim 等，1998；King 等，2009）。GENPLAT在这些前期工作的基础上进一步拓展，最显著的改进在于可分析的酶混合物复杂性，从早期研究中最多6种组分提升至我们最新工作中超过16种组分（Banerjee 等，2010c）。GENPLAT的其他关键特征包括使用珠式混合室（桨叶储液槽），可在分配过程中保持秸秆浆液的悬浮状态；消化过程中的温和混合采用端对端旋转方式；以及葡萄糖（Glu）和木糖（Xyl）的自动化比色测定。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分由美国能源部大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室基础能源研究 DE-FC02-07ER64494）以及美国能源部基础能源科学办公室化学科学、地球科学与生物科学部授予的 DE-FG02-91ER200021 项目资助。我们感谢 John Scott-Craig 和 Melissa Borrusch 在材料和概念方面所做的贡献。
参考文献
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set. Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).
- Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations. Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).
- Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis. Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).
- Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. High throughput screening techniques for biomass conversion. Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).
- Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover. Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).
- Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family. Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).
- Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. Factorial optimization of a six-cellulase mixture. Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).
- King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts. Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).
- Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei. Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).
- Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates. Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).
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