激光轴突切断结合延时成像是一种灵敏的方法，可用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）中基因突变对轴突再生的影响。一种高质量但成本低廉的激光消融系统可轻松添加到大多数显微镜上。进行长达15小时的延时成像需要对线虫进行精细的固定处理。
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摘要
摘要
激光轴突切断结合延时显微成像是检测 C. elegans 轴突再生表型的一种敏感实验方法1。该实验的主要难点在于人们普遍认为实施激光消融系统所需的成本较高（25,000 至 100,000 美元）且需要专业技术2,3。然而，中等成本（<10,000 美元）的固态脉冲激光器在透明样本中即可实现稳定的激光消融效果，尤其适用于目标轴突靠近组织表面的情况。系统的搭建与光路校准可在一天内完成。聚焦聚光镜发出的光线至消融激光之间的光路为系统校准提供了便捷的参考指引。中间模块可移除所有光学元件，专用于激光消融，确保在激光消融过程中无需移动任何光学组件。中间模块中的二向色镜可实现成像与激光消融的同步进行。将激光光束与聚焦显微镜聚光镜发出的光束中心对齐，有助于系统的初始校准。通过多种透镜调节并扩束激光，使其充满所选物镜的后光圈。最终的校准与测试使用前表面反射镜玻璃片作为靶标进行。调节激光功率，使消融斑点达到最小尺寸（<1 µm）。通过精细调节最后一个运动学安装的反射镜，将消融斑点精确对准成像窗口中固定的十字叉丝中心。用于轴突切断的激光功率通常约为靶标玻璃片上产生最小消融斑点所需功率的 10 倍（具体数值可能因所用靶标不同而有所变化）。线虫可通过置于琼脂糖垫（或微流控芯片4）上实现固定，以便进行激光轴突切断和延时成像。琼脂糖垫可使用 10% 琼脂糖溶于平衡盐溶液中，经微波炉加热熔化后制备。取一滴熔化的琼脂糖置于载玻片上，再用另一张载玻片压平，形成厚度约为 200 µm 的垫片（相邻载玻片上粘贴一层定时胶带作为间隔物）。使用“Sharpie”笔帽切割出直径统一为 13 mm 的圆形琼脂糖垫。在垫片中央加入麻醉剂（1 µl，20 mM Muscimol）和微球（Chris Fang-Yen 个人交流）（1 µl，水中含 2.65% 聚苯乙烯，粒径 0.1 µm），随后放置 3–5 条线虫，并使其侧卧于左侧。加盖盖玻片后，使用凡士林密封盖玻片边缘，防止样品蒸发。
方案
1. 激光消融系统的构建
初始校准期间请佩戴激光安全护目镜，并遵循良好的激光安全操作规范。激光开启时，切勿通过目镜观察。
- 按照图1所示（另见示例2），将各组件布置在面包板上。用螺栓固定激光器（如有需要可使用垫高板）、棱镜支架立柱以及抬高的导轨支撑。
- 调整显微镜位置，使其与导轨轴线对齐。与显微镜聚光镜透射出的光束对齐。使用水平仪调节导轨高度，并利用可调光阑或固定在导轨上的透镜进行位置对准。光阑或透镜必须在导轨的两端均与聚光镜光束对齐。可使用实验室升降台辅助调节导轨高度。
- 将格兰-汤普森偏振器和半波片与激光光束对齐。此对准过程无需开启激光器，只需确保光束穿过两者且不触及边缘即可。旋转偏振器，使其朝向和位置便于设置光束吸收器（图1）。通过旋转半波片来调节激光功率。将各组件牢固固定在面包板上。
- 开启激光器，将脉冲频率设为100，工作模式设为连续模式，并通过半波片将功率调至最低。使用便利贴或镜头纸观察激光光束。
- 依次调节从激光器出发的运动学安装反射镜，使光束引导至安装在抬高导轨末端的反射镜。激光光束应大致对准各反射镜中心。反射镜与激光光束轴线的夹角应大致为45度（图1）。
- 粗略调节安装在棱镜顶部及导轨末端的运动学反射镜，使激光光束与显微镜透射光束中心对齐。通过在光路中插入纸张，可同时观察激光光束和显微镜透射光束。确保中间模块中的所有中性密度滤光片（ND滤光片）和光阑已移出或完全打开。
- 利用棱镜顶部和导轨末端反射镜的微调装置，精细调节激光光束，使其与透射光束中心精确对齐。将纸张靠近导轨上的反射镜，用顶部棱镜反射镜将激光光束对准透射光束中心；再将纸张置于显微镜端口附近，通过调节导轨末端反射镜使激光光束与透射光束中心对齐（图2）。
- 在已对准的聚光镜与开放物镜转盘之间的光路中放置一张便利贴。应能看到透射光束中包含一个位于近中心的小激光光斑。利用导轨反射镜的微调装置将激光光束居中。使用夹具将显微镜固定到位。
步骤 1.9-1.12 为可选步骤，但在添加扩束透镜前评估对准和激光消融情况既简便又实用。
- 关闭激光器并启用机械安全快门。将50%分色镜从光路中移出。尽管无直接激光通过目镜，反射光仍可能非常强烈。安装用于精细校准的目标载玻片，并使用60倍油镜成像。对准载玻片上的划痕进行聚焦。在中间模块中插入ND4和ND8滤光片。
- 使用您的共聚焦激光扫描显微镜、转盘式显微镜或CCD相机系统对目标载玻片进行成像。将50%二向色镜旋转至激光光路中。 从此时起，当消融激光开启时，切勿通过目镜进行观察打开消融激光器，将模式设置为触发模式，频率设为100，脉冲数设为10。确保通过半波片将功率仍设置为最小值，然后打开机械安全快门。可同时进行成像和消融激光操作。
- 在对目标载玻片成像时，触发消融激光。检查目标载玻片上是否出现直径为1–10 μm的消融斑点。依次移除中性密度（ND）滤光片，直至观察到消融斑点。使用导轨镜将消融斑点调整至图像中心。随后应重新添加一片ND滤光片，以便后续通过半波片精细调节激光功率，从而获得理想的消融效果 <1 μm 消融点。成像分辨率应达到 0.2 μm/像素或更低，并精细调节消融点至图像中心（512×512 图像中的位置为 256,256）。
- 检查激光束的焦深和光轴。上下调节焦距1-2 μm，观察消融位置和消融斑点大小。若激光束轴向对准，则消融斑点位置不会移动。未校准的激光束会在数微米范围内（约从焦点顶部到底部3-5 μm）分散能量。
2. 添加透镜以扩束激光，使其充满物镜后光瞳，并调节会聚程度以控制焦点
- 该系统采用双开普勒式扩束镜将激光束扩展至充满物镜的后焦平面（10 mm）。将4片透镜安装到镜片架上，并固定在导轨上（L1f1+L2f2 和 L3f1'+L4f2'）。调节各透镜位置，使其均位于同一光轴上，并与激光束严格正交（图2）。
- 开启激光器，并将其调至最低功率和连续输出模式。使用白纸粗略调整每片透镜的光路对准，观察激光束及显微镜聚光镜透射的光束。关闭激光器并合上安全快门。
- 拆除显微镜一侧的夹具，将显微镜从激光光路中滑出。开启激光器，移除安全快门。
- 通过观察附近墙面的扩展激光束，进行透镜与激光束的精细对准。移动透镜时，光束应呈对称的扩展与收缩。调节最后两个运动学安装的反射镜以对准光束（图3）。
- 对准并扩展后的光束轮廓应呈圆形且亮度均匀（图3）。可在物镜后焦平面的预估位置放置便签纸，观察光束的大小与均匀性。
- 对于无限远光学系统，应将光束调节至零会聚状态。通过移动便签纸远离透镜并观察光束尺寸的变化，可估算会聚程度。关闭激光器并启用机械快门。
- 利用固定夹具将显微镜重新滑入激光光路，以确定正确对准位置。重新安装显微镜自由侧的夹具，但暂不拧紧。
- 开启激光器并移除安全快门。旋转物镜转盘至空位，在载物台上放置一张便签纸。应可见扩展且均匀的激光束与聚光镜透射光束中心重合（图4）。必要时可松开显微镜夹具，轻微移动显微镜以实现中心对准。
- 启用安全快门，将激光器设为触发模式。将60倍物镜转入光路，对靶标玻片表面的划痕成像。
- 移除安全快门，触发消融激光，并调节激光功率以获得最小消融斑点。消融斑点应呈圆形，且位于图像中心5–10 µm范围内。
- 通过调节运动学安装的导轨反射镜进行消融斑点的中心对准。需反复调节导轨上的反射镜和顶部棱镜系统反射镜，以同时实现消融斑点居中和保持光束轮廓均匀。
- 通过以1 µm步长系统性上下移动Z轴焦点并触发消融激光，评估激光的Z轴聚焦性能。扩展、对准并调整好会聚的光束应在图像焦点处消融最强，而在焦点上下1 µm处消融微弱或无消融（图5）。
- 通过移动开普勒望远镜中的透镜L3来调节扩展光束的Z轴焦点（图2）。
3. 激光轴突切断术与轴突再生的延时显微成像
- 将10%琼脂糖（RPI分子生物学级EEO 0.1 A20090）在平衡盐溶液中微波加热至完全融化。使用时置于加热板上保持熔融状态，用于封片。
- 在载玻片上滴加一滴熔融琼脂糖，并用另一张载玻片将其压平，形成厚度约为200 µm的垫片（相邻载玻片上贴有一层“时间胶带”作为间隔物）。
- 使用“Sharpie”记号笔的笔帽切割出直径统一为13 mm的圆形琼脂糖垫片。
- 在垫片中央加入麻醉剂（1 µL 20 mM Muscimol）和微球（Chris Fang-Yen，个人交流）（1 µL 2.65% 聚苯乙烯，0.1 µm，溶于水），随后放置3–5条线虫，使其侧卧于左侧。加盖盖玻片，并用凡士林密封盖玻片边缘，防止样品蒸发（图6）。
- 每次实验开始前，按上述方法将消融激光对准十字准线，并启动激光安全快门。
- 移除激光对准靶标，使用合适的荧光标记对固定好的成年线虫目标神经元进行成像。以相似的放大倍数（0.2 µm/像素或更高）对轴突成像，并将其定位至十字准线下方（图7）。
- 打开激光安全快门，在成像的同时触发消融激光。触发激光后评估轴突状态，并缓慢增加激光功率直至轴突被切断。切割轴突所需的激光功率约为在对准靶标上形成消融点所需功率的10倍（约1 µJ/ns脉冲）。通常采用100次脉冲、2.5 kHz频率、功率设定为约0.27 mW（在样本位置使用Coherent FieldMaxII功率计测量，激光设为2500 Hz连续模式）进行切割。该消融激光功率设置可在后续实验中稳定用于轴突切割（图7）。
- 成功切断的轴突将出现约0.5–1 µm的断裂，但断裂两端荧光亮度无明显损失（图7）。若亮度显著降低或出现较大间隙（2–10 µm），通常表明空化气泡已对轴突以外区域造成广泛损伤。近端和远端轴突将在接下来的30分钟内分离，并形成回缩膨大（图8及视频）。
- 开始延时记录前，将已固定的线虫在显微镜载物台上平衡30分钟，以最小化因温度差异和琼脂糖收缩引起的漂移。
- 使用成像系统配套的软件设置延时成像参数。通常设置10–20个Z层（每层1 µm），分辨率为0.1–0.2 µm/像素，增益、针孔、扫描速度和成像激光功率的设定应保证在获得所需空间分辨率的同时最小化曝光。采样间隔通常为1–5分钟，持续约15小时，具体取决于所需的时序分辨率（图8及视频）。
- 使用NIS Elements或ImageJ软件将延时成像数据转换为视频。
4. 典型结果：
使用该系统的激光轴突切断术是一种可靠且常规的方法。图7所示结果具有代表性。采用本方案进行轴突再生的延时成像效果非常稳定。我们通常在单张载玻片上利用电动载物台对5条不同线虫中的最多5条轴突进行切断和成像。唯一的限制因素是采集每条轴突图像所需的时间；例如，若采集一条轴突的图像堆栈需要20秒，则每180秒采样一次时，最多可采集9条轴突（9个堆栈）。图8和图9所示示例为典型的代表性结果，约有10%的实验能达到此质量水平。其余实验虽能提供关于再生表型的有效数据，但因线虫在固定5–8小时后通常会出现微小的抖动，导致图像美观性较差。
图 1 激光烧蚀系统。532 nm 的 Nd:Yag 激光器安装在升高板上，使其与其他组件高度一致，并用螺栓固定在光学平台上。（光学隔离器为可选部件，可能并不需要）。Glan-Thompson 偏振器和半波片用于精确调节激光功率，二者均安装在精密校准的旋转支架上。设置光束挡板时需格外小心。角反射镜将激光束引导至下方的潜望镜反射镜，上方的潜望镜反射镜再将光束导向导轨反射镜。导轨安装在两个由杆支撑的平台之上。双伽利略透镜安装在滑动导轨支架上。请注意为烧蚀激光器增设的中间模块。通过移除光学隔离器和角反射镜，并将激光器、Glan-Thompson 偏振器和半波片重新定位至光学平台后边缘，可使系统结构更加紧凑。
图2 使用双伽利略式扩束透镜将300 μm的TEM₀₀激光束扩展为直径10 mm、无收敛的均匀光束。在支撑导轨的平台之一下方放置一个实验室升降台，用于在准直过程中调节导轨高度。通过将L1透镜安装到导轨上，并以聚光镜光束作为准直参考，粗略调节导轨高度，使聚光镜光束与透镜中心对齐 两者 轨道的末端。这将确保轨道与显微镜的光轴平行。您可能需要先调整显微镜，使其光轴与轨道匹配。使用夹具固定显微镜的位置（见图1）。移除安装在轨道上的透镜。现在将激光束与聚光镜光束的中心对齐 两者 导轨末端。在光路中放置一张纸可方便地同时观察两束光。使用顶部的潜望镜反射镜将激光束与靠近导轨上反射镜处的聚光镜光束对齐。使用安装在导轨上的反射镜将激光束与导轨远端（最靠近显微镜处）的聚光镜光束对齐。然后按照图示将四个透镜全部安装到导轨上。导轨长度、透镜焦距及透镜排列方式将根据所用显微镜和实际装置的不同而有所变化。关键参数为激光束直径以及所选物镜后孔径的大小。无限远光学系统会将完全平行的激光束（零会聚）聚焦。L1与L2之间的距离应为两透镜焦距之和，即f1+f2；相应地，L3与L4之间的距离应为f1'+f2'。两组伽利略望远镜对之间的距离不关键。可通过微调L3的位置来控制光束的会聚程度。 <需要进行1 mm的调整，以将激光的焦点调节至成像焦点。务必从中间模块中移除光路中可能存在的所有透镜、滤光片、光阑等元件（或明确了解这些元件的作用，并相应调整系统参数）。
图 3 激光束通过双伽利略透镜的准直。从显微镜一侧移除显微镜夹具，使显微镜能够移出光路，但保留另一侧的夹具，以便显微镜可被精确地重新定位。注意激光安全。使用格兰-汤普森偏振器将激光功率调节至最低。打开激光器，观察激光束在墙上的光斑图样。可在墙上贴一张纸以帮助观察激光光斑。系统性地调节透镜的位置，以了解它们对光束尺寸和形态的影响。你应能看到类似图 A 所示的图样，即一个明亮的光斑偏心地位于较暗的光晕中。使用导轨安装的反射镜将强光斑调整至中心位置，如图 B 所示。现在使用顶部潜望镜安装的反射镜，使外围光强分布均匀。如果所有元件均已正确准直，则此时移动透镜时，光束应能对称地扩展和收缩。将透镜移回图 2 所示的起始位置。现在在物镜后孔径距离处截取光束，光束应呈圆形，至少足够大以充满后孔径，且亮度均匀。若光束稍大亦可接受，只要激光功率足以满足消融实验需求即可。通过比较物镜后孔径处与墙面处的光束直径，评估光束的会聚性。对于零会聚光束，两处的光束直径应相同。比例尺为 10 mm。
图 4 扩展激光束与聚光镜光束的对准。关闭激光器，使用夹具作为对准限位，将显微镜移回激光束路径中。打开、对准并使用物镜聚焦聚光镜光束。用胶带将纸张贴在目镜上，以防止任何人看到强烈的反射激光。旋转物镜转盘至空位。在载物台上放置一张纸以遮挡聚光镜光束。将激光器切换至连续模式并移除机械安全快门。此时应能看到部分激光透过显微镜。松开显微镜夹具，轻轻推动显微镜，使激光束与聚光镜光束对准。激光束应呈圆形且亮度均匀。必要时可调节导轨上的透镜。若对准正确，应能均匀地扩展和收缩激光束。可通过导轨上的反射镜将收缩后的激光束与最小尺寸的居中聚光镜光束对齐，然后将其扩展至所需大小。一旦通过导轨反射镜调整了收缩光束的位置，就需要重新调节顶部安装的潜望镜反射镜，以保持扩展光束的亮度均匀。若无法获得圆形且居中的激光束，则需返回之前的对准步骤重新操作。
图5 将消融点居中，并调整激光束的聚焦以达到最佳焦点。关闭激光并遮蔽光束。取下纸张，安装镜面目标载玻片（也可使用盖玻片上永久性记号笔墨作为目标）2）。使用60倍1.4数值孔径油镜在镜面表面成像并产生划痕）现在改用共聚焦显微镜或CCD对表面成像。 激光开启时请勿通过目镜观察打开激光器并移开快门。将激光器设置为触发模式、最低功率和100 Hz。触发约10个脉冲。应在视野中心10 μm范围内观察到直径为1–5 μm的消融点。若未观察到消融点，可将激光功率以5–10%为步长逐步增加。一旦识别出消融点，将其居中至视野中央。若观察的是512×512图像，则将十字线置于256, 256坐标处。若将激光光斑调整至中心，则在放大过程中其位置不会改变。使用导轨安装的反射镜将消融点移动至中心十字线位置。如上文图4所述，在移除物镜后观察光束，重新评估激光束的均匀性。通过顶部潜望镜安装的反射镜调节光束均匀性。重复评估消融点的位置。此为一个迭代过程，需反复进行，直至消融点居中且扩展后的光束均匀。若操作正确，消融点应呈圆形，如图中“Focus”处的消融点所示。接下来评估激光束在Z轴方向的聚焦情况。触发激光，在中心产生一个约1 μm的消融点。随后将载物片横向移动约5 μm，并将焦平面调至目标载物片表面下方1 μm处。使用与第一个消融点相同的激光参数触发激光。再将焦平面调至目标载物片表面上方1 μm处，重复操作。若激光束与成像焦点对齐，则应观察到与本图所示相似的图案。最大的消融点应对应于成像焦点，而焦点上方和下方的消融点应呈对称性缩小。调节透镜L3以对齐焦平面。将透镜L3远离显微镜移动会使光束更会聚，消融点将更靠近物镜。微调 <在焦点附近需要进行1 mm的调整。现在可以开始切割轴突。比例尺为1 μm。
图 6 用于激光轴突切断和延时成像的线虫固定。将 10% 琼脂糖溶于生理盐水中，加热至完全融化。取少量液滴置于玻璃载玻片上，再用另一张载玻片压平，形成平整的琼脂糖垫。通过在两张相邻载玻片边缘粘贴胶带控制垫层厚度。琼脂糖垫静置约 1 分钟使其凝固，随后将两张载玻片分开。使用“Sharpie”笔帽作为模具，切割出直径约 13 mm 的均匀琼脂糖垫（Fang-Yen 个人交流）。在琼脂糖垫中央加入 1 µL 10 mM Muscimol 和 1 µL 微珠（microspheres）。将线虫加入该 2 µL 液滴中，并在加盖玻璃盖玻片前调整其方向。最后，用注射器（20–25 号针头）将凡士林涂抹于盖玻片边缘，以密封样本。
图7 秀丽隐杆线虫（C. elegans）中激光轴突切断的典型结果。图A显示了在激光轴突切断前后不久的完整轴突。通常产生的断裂间隙约为0.5–1 µm。图B显示了对一条轴突进行激光切断，而距离约1 µm的邻近轴突未受损伤。激光参数设置为约10%功率（在2500 Hz下平均0.3 mW），共发射100次脉冲。比例尺为5 µm。
图 8．典型的野生型 L4 再生过程。该时间序列展示了轴突消融及随后的延时记录，用于观察轴突再生。在激光切断轴突后 0 分钟时，可见回缩球结构。至 138 分钟时，回缩球已回撤至最远端，并开始进行重塑。在轴突主干上可观察到零星的膜突起（微棘或丝状伪足）（箭头指示，138 和 324 分钟）。在 360 分钟时，右侧断端延伸出一个形态完整且致密的生长锥。至 414 分钟时，两个断端均已形成生长锥。最初类似胚胎期的生长锥在向背侧神经索延伸过程中逐渐变得营养不良（414、519 和 597 分钟）。这些营养不良的生长锥在到达背侧神经索之前停滞（960 分钟）。箭头标示近端断端及生长锥位置。箭头指示沿近端轴突主干的膜突起。比例尺：20 µm。
视频 1. 野生型轴突再生的动态影像。该视频对应图 8 中所示的时间点。按照本实验方案所述方法将线虫固定后，每 3 分钟对轴突成像一次，持续约 10 小时。在每个时间点采集 Z 层扫描图像（20 层，每层 1 µm），并通过最大投影算法（NIS Elements）合并为单张图像。点击此处观看视频。
讨论
已有若干文献对使用不同激光系统进行激光显微手术进行了良好论述3,5-11。飞秒红外激光是亚细胞水平激光消融的“金标准”12，若与成像设备联用则尤为便利，但其成本通常过高，不适合个人用户。如果由于成像深度要求而需要使用飞秒红外激光对样品进行成像，则进行激光轴突切断术时可能也需要该设备。对于透明组织，若目标轴突位于表面下30-50 µm范围内，使用蓝光和绿光脉冲激光（能量约20 µJ/脉冲），并通过高数值孔径的浸液物镜聚焦，通常可实现有效切割。与飞秒激光相比，纳秒和皮秒激光造成的旁侧损伤更大，尤其当目标轴突深度增加时更为明显。C. elegans具有透明性，所有轴突均位于表面下20-30 µm范围内。我们常规切割距离表面5 µm以内的运动神经轴突，也已轻松完成位于神经环内、距角质层表面约20 µm的轴突切割。我们发现，在成年线虫体径范围内，轴突切割的深度极限约为30-50 µm。可以预期，本文所述的激光消融系统适用于多种满足透明性和目标轴突深度要求的样品制备。然而，尽管飞秒红外激光在理论上具有优势，纳秒和皮秒波长为355 nm和532 nm的激光在C. elegans中的轴突切断效果却同样出色，这一点仍略显意外6,13。我们未观察到使用纳秒440 nm、纳秒532 nm或飞秒红外激光进行激光轴突切断后，在轴突再生反应方面存在任何差异。
固态355 nm紫外激光器的成本与532 nm半导体泵浦被动调Q固态激光器大致相同，但需要更高的功率或能够高效透过更短波长的光学元件。大多数光学元件的设计旨在对可见光范围（400–700 nm）的光实现良好性能。355 nm激光器具有一些优势6，例如降低等离子体阈值、实现更小的光斑尺寸，并且长通二向色镜可高效地将全部消融激光导向目标，同时允许在不损失样品信号的前提下同步成像GFP。蓝光440 nm激光器则保留了使用可见光激光器的优势（与标准光学元件兼容性好且更安全）。然而，目前同等功率下，DPP调Q固态440 nm激光器的成本是355 nm或532 nm激光器的三倍。如果我们正在为C. elegans设计一套新系统（其目标深度极小），我们将选择紫外透射镜头（在355 nm处透光率为50–70%的40X 1.3na油镜，成本约3000美元）以及输出为5–10 µJ/脉冲、重复频率1–20 kHz的355 nm激光器。
轴突消融被认为是由等离子体形成所致。更短的脉冲可在较低功率下产生等离子体阈值，且等离子体体积更小6。目标是通过将脉冲能量调节至最低功率，产生体积最小且持续时间最短的等离子体。较大且持续时间较长的等离子体会生成空化气泡，从而损伤周围细胞。我们通常发现，以最高频率（即 2.5 kHz）使用约 50–100 次脉冲进行消融可获得最佳效果。这表明，通过一系列脉冲可逐步累积损伤，从而更精确地控制损伤范围。如果激光光束准直和扩束准确，此处描述的激光消融系统具有较高的容错性。我们在成年线虫中进行轴突切割时，起始激光功率为 10%（在 2500 Hz 下测得平均功率为 0.3 mW，估计单脉冲能量为 1 uJ），在不超过 14% 功率的情况下即可实现局限性损伤较小的切割。在 15–39% 激光功率下可观察到更大范围的损伤，但只有当功率超过 40%（在 2500 Hz 下测得平均功率约为 1 mW）时，线虫才会因产生大型空化气泡及角质层损伤而发生爆裂。
Steinmeyer 等人于2010年发表的论文2是构建激光消融系统的优秀参考资料。Leon Avery 也提供了一个基于低成本氮气337 nm激光器的激光消融系统的实用描述，并给出了许多实用建议（elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/）。在设计您自己的系统时，应首先与显微镜供应商代表沟通，以确定如何将消融激光引导至显微镜物镜。您的显微镜应安装在隔振平台上（如 Newport、TMI 或 Thor 品牌）。带光具座顶板的平台最为理想，但坚固的钢制顶板也可配合磁性定位器使用。在直立式显微镜上配备专用的中间模块较为理想，因为所有光学元件均可保持固定位置。然而，使用相机端口（倒置显微镜）或连接到落射荧光端口的“合束器”可能更经济且方便。您需要了解拟使用物镜的后孔径尺寸及其在消融激光波长下的透射率。选定激光器（例如 Crylas、TEEM、Crystal 或 CRC）后，应联系 Thor 或 Newport 公司，以获取有关选择合适光学元件、硬件及安全设备的帮助。我们选择采用双伽利略式光束扩束器以节省空间，但也可选用更简单的开普勒式扩束器（f2/f1 = 扩束倍率）。定制的光束扩束器成本最低，但 Newport、Thor 以及多家激光器制造商也提供高质量的商用光束扩束器。一些激光器制造商还提供手动或电子控制的衰减器，可能更具成本效益并节省空间，但其灵活性不如格兰-汤普森偏振器和半波片。您还需确定如何控制激光器。可设计基于 LabView 的控制器，使用商用 TTL 信号发生器，或采用激光器公司提供的软件。请与具体的激光器制造商讨论各种选项。
我们提供的硬件列表仅作为一般性参考。该系统在添加到我们现有的成像系统时，成本约为15,000美元。您所在机构的物理系通常会有人员愿意提供有关安全操作自由光束激光器的实践指导。
最近已有关于C. elegans固定和延时成像的替代方法的描述。14
故障排除
最难且最关键的一步是将居中扩束后的光束与显微镜的光轴对齐。在通过伽利略式扩束透镜实现光束居中和扩束后，应尽量在使用转向镜进行最终中心对准时，先将光束对准至显微镜光轴5 µm以内。过度依赖转向镜来对准光束会导致光束在扩束系统中偏离轴线。务必格外小心，可使用合适的中性密度（ND）滤光片衰减激光束，并直接在反射靶（前表面反射镜）上观察激光束的光斑轮廓。可轻微移动显微镜，以精确地将光束中心置于60倍物镜的视场中央（若上下方向无法居中，则需调节导轨高度）。利用光束轮廓可精确对齐显微镜光轴，使光束居中、呈圆形且“发散”对称。若发散不对称，表明显微镜光轴未完全对准（或导轨不水平）。最后，调节透镜L3，观察光束是否均匀且对称地扩展和收缩。将显微镜精确聚焦于靶表面，再调节L3使激光束聚焦至最小光斑。此时通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）或CCD系统成像，应可发现激光束位于中心5 µm范围内，且消融光斑的Z轴聚焦位置偏差在1 µm以内。
如果你发现线虫总是被“炸开”，或持续产生较大的空化气泡来切断轴突，问题很可能出在消融激光的精细校准上。请确保消融光斑最小（<500 nm）时位于Z轴焦平面内（通过L3透镜调节会聚），并准确对准XY方向的参考标记点（通过最后一个运动学安装的反射镜进行调节）。
靶向更靠近表面的轴突所需的激光功率较低。同样，与在成年个体中靶向相同轴突相比，对较小的动物（L1和L2阶段）进行轴突切断所需的激光功率也较低。
如果野生型轴突未发生再生或轴突出现漂白现象，应尝试降低成像激光功率或减少采样频率。如果线虫死亡或状态不佳，请以1%为梯度逐步降低琼脂糖的浓度。在固定线虫后，请确保不再移动盖玻片，因为在使用高浓度琼脂糖和微球时，移动盖玻片常会导致线虫死亡。
如果蠕虫在延时成像过程中发生破裂或死亡，原因可能是：1. 琼脂糖浓度过高。2. 消融激光对角质层造成损伤。3. 封片后盖玻片发生移动。如果问题是由于角质层受损所致，则仅会影响经消融激光照射过的已封片蠕虫。
如果线虫在延时成像过程中活动过多，可尝试以0.5%为梯度逐步增加琼脂糖的浓度。健康线虫中的健康轴突始终处于“活跃”状态，并表现出稳定的荧光水平。若观察到荧光信号或活动性突然下降，则表明线虫正在死亡或已经死亡。出现多个串珠状或断裂的轴突是线虫即将死亡或已死亡的明确征象。
如果在整段时间序列成像过程中难以使轴突始终保持在焦平面内，可能存在多种不同问题。首先，可通过在玻璃载玻片上对惰性样品进行持续10小时的成像来检查载物台的漂移情况。数微米的漂移可能源于热不稳定，但超过5 µm的漂移通常与显微镜的机械问题有关。更常见的问题是样品安装不当。在开始时间序列成像前，应让已安装的线虫在显微镜载物台上平衡30分钟。检查您的凡士林密封在成像过程中是否出现泄漏。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国家科学基金会、麦克奈特神经科学捐赠基金、克里斯托弗和戴娜·里夫基金会以及阿梅里塞慈善基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 备注（可选） |
| 535 nm 激光器 | Crylas | FDSS532Q3 | （TEEM、Crystal 和 CRC 也提供可比激光器） |
| 所有光学元件和硬件 | （Thor 提供可比的光学元件和硬件） | ||
| SUPREMA 光学支架，1.0 英寸直径 | Newport Corp. | SS100-F2KN | 2 |
| 1" 直径立柱，1" 高度 | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" 直径立柱叉 | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| 消色差零级波片，½ 波延迟，400–700 nm | Newport Corp. | 10RP52-1 | 1 |
| 旋转台，1" 孔径 | Newport Corp. | RSP-1T | 1 |
| 1" 直径立柱，1" 高度 | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" 直径立柱叉 | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Glan-激光方解石偏振器，430–700 nm | Newport Corp. | 10GL08AR.14 | 1 |
| 偏振器旋转支架 | Newport Corp. | RM25A | 1 |
| ¼" 间隔件，用于 1" 直径立柱 | Newport Corp. | PS-0.25 | 1 |
| ½" 高度，1" 直径立柱 | Newport Corp. | PS-0.5 | 1 |
| 叉式接头，1" 直径立柱 | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| 光束吸收器 | Newport Corp. | PL15 | 1 |
| 显微镜物镜支架 | Newport Corp. | LH-OBJ1 | 1 |
| 1" 直径立柱，1" 高度 | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" 直径立柱叉 | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| 高能量 Nd:YAG 激光反射镜，25.4 mm 直径，45°，532 nm | Newport Corp. | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA 光学支架，1.0 英寸直径，通孔安装 | Newport Corp. | SN100C-F | 2 |
| 高精度旋钮调节螺钉，12.7 mm 行程，100 TPI | Newport Corp. | AJS100-0.5K | 4 |
| 螺纹适配器，¼-20 外螺纹，8-32 内螺纹 | Newport Corp. | SS-1-B | 2 |
| 1.5 英寸直径杆用夹具 | Newport Corp. | 340-RC | 2 |
| 杆，14 英寸（35.5 cm）高 | Newport Corp. | 40 | 1 |
| X26 用导轨滑座，方形，40 mm 长 | Newport Corp. | CN26-40 | 4 |
| 钢制导轨，384 mm（15"）长 | Newport Corp. | X26-384 | 1 |
| 1.5 英寸直径杆用平台 | Newport Corp. | 300-P | 2 |
| 杆，14 英寸（35.5 cm）高 | Newport Corp. | 40 | 2 |
| 平凹透镜，12.7 mm 直径，-25 mm 有效焦距，430–700 nm | Newport Corp. | KPC025AR.14 | 2 |
| 平凸透镜，25.4 mm 直径，50.2 mm 有效焦距，430–700 nm | Newport Corp. | KPX082AR.14 | 1 |
| 平凸透镜，25.4 mm 直径，62.9 mm 有效焦距，430–700 nm | Newport Corp. | KPX085AR.14 | 1 |
| 固定透镜支架，0.5" 直径，1.0" 光轴高度 | Newport Corp. | LH-0.5 | 2 |
| 固定透镜支架，1.0" 直径，1.0" 光轴高度 | Newport Corp. | LH-1 | 2 |
| 0.1 μm 微球 | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| 琼脂糖 | Research Products International Corp. | A20090 | EEO 有影响 |
| 蝇蕈醇 | Sigma-Aldrich | M1523 |
参考文献
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