我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。
本文内容
摘要
摘要
本方法的总体目标是描述一种技术，用于使贴壁细胞经受层流条件，并评估其对可精确量化的流体剪切应力的响应1。
我们的流室设计和流路系统（图1）包含一个透明观察区域，可在流动开始前（图11A、B）、流动过程中不同时间点（图11C）以及流动结束后（图11D），用于检测细胞黏附并成像细胞形态。这些实验以人脐带血来源的内皮祖细胞（EPCs）和猪源性EPCs2,3为例进行说明。
该方法也适用于其他贴壁细胞类型，例如平滑肌细胞（SMCs）或成纤维细胞。
腔室及管路的所有部件均可通过蒸汽高压灭菌法轻松实现灭菌。与其他腔室（例如微流控腔室）相比，本装置可在流动实验结束后以无菌条件回收大量细胞（>100万个，具体数量取决于细胞大小），用于后续细胞培养或其他实验，如DNA或RNA提取、免疫组织化学（图11E）或扫描电子显微镜观察5。剪切应力可通过调节灌注液流速、流体黏度或通道高度与宽度进行调整。后者可在确保一维流动的前提下，减少所需流体体积或细胞数量。由于腔室高度不依赖垫圈的使用，因此无需在每次实验之间测量腔室高度，从而显著提高了多次实验的操作便捷性。此外，该管路设计还可方便地收集灌注液样本，用于分析和（或）定量检测细胞在流体剪切应力作用下分泌的代谢物，例如一氧化氮（图12）6。
方案
1. 内皮祖细胞的分离
- 在采集任何外周人血之前，须将您的研究方案提交至机构审查委员会（IRB）进行审核，并在获得批准后，取得志愿者捐献者的知情同意（外周血采集及内皮祖细胞分离已获杜克大学 IRB 批准，并完全符合美国有关保护人类研究参与者的法规要求）。
- 在使用动物来源的内皮祖细胞时，须确保您的研究方案已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。我们所有的猪实验均已获得杜克大学 IACUC 的批准，并按照人道护理的最高标准进行。
- 为分离内皮祖细胞，采用标准静脉穿刺技术，从已签署知情同意的志愿者捐献者采集 50 ml 外周血至含有抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖磷酸盐的采血袋中，随后以 1:1 比例用 Hank's 平衡盐溶液（不含 CaCl2、MgCl2、MgSO4）稀释，并等体积叠加于 Histopaque 上，形成清晰的分层。
- 离心（30 分钟，740 g，低刹车设置），收集单个核细胞（MNC）（即白膜层）。用含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬并洗涤 MNC 三次，每次 10 分钟，515 g，随后将细胞接种至两块 12 孔板中，加入完全 EPC 生长培养基（MCDB-131 培养基，含 5 ml 200 mM L-谷氨酰胺、10% FBS 及 EGM-2 SingleQuots），置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 前 7 天内每 24 小时缓慢更换一次培养基，之后每隔一天更换一次。通常在平均 14 天后，可根据其鹅卵石样形态识别出 EPC 克隆。当培养中的 EPC 覆盖 12 孔板表面积的 1/4 时，进行细胞扩增，并通过流式细胞术检测表面标志物 CD31 的表达以及 CD14 和 CD45 的缺失，以确认 EPC 身份，方法如前所述6。其他可进行的检测包括细胞形态学观察及 DiI-Ac-LDL 标记。
- 针对本文所述实验，将分离获得的 EPC 在 EPC 培养基中扩增，直至在 3 个 T-75 细胞培养瓶中接近汇合，培养条件为 37 °C、5% CO2 的湿润化培养箱。
2. 剪切应力计算
- 建议在制造腔室和通道之前进行这些计算，以充分了解可实现的条件。根据公式 11，基于希望施加到细胞上的剪切应力，计算灌注液在回路中的流速，
其中 Q 是所需的流速， τ 是作用在细胞上的切向目标剪切应力， w 是流室的宽度， h 是流室的高度，以及 μ 是灌注液（流动介质）的黏度。
- 所用培养基的典型黏度（μ）值为 0.9 cP（0.009 g cm-1 s-1）。如果需要，也可通过使用高分子量葡聚糖来提高黏度7。常用的靶向剪切应力（τ）值为 15 dynes/cm2（典型的动脉剪切应力）或 100 dynes/cm2（如需超生理剪切应力）。我们的流室通常宽度（w）为 1.9 cm，高度（h）范围为 166 - 267 μm。
3. 流动腔室的制备
- 使用6061铝合金矩形坯料切割腔室的顶板和底板，顶板尺寸为7英寸×2英寸×0.5英寸，底板尺寸为7英寸×2英寸×0.25英寸。
- 在顶板中央区域加工深度为0.125英寸的凹槽，两端各保留0.950英寸，形成宽1.375英寸、深0.3125英寸的流体储液区。
- 从底面钻出宽1/16英寸、长0.625英寸的槽孔，贯穿至进液端和出液端的储液区。
- 在每块顶板的末端，钻一个居中的10/32英寸（每英寸牙数，T.P.I.）螺纹孔，用于聚丙烯1/8英寸接头插入流体储液区；在进液端，另设一个带10/32英寸T.P.I.通孔的侧塞，用于安装聚丙烯1/8英寸接头。
- 从流体入口端到底板玻璃观察窗之间，将顶板底面以0.518度的角度进行锥形加工，以实现流体充分混合。
- 在底板上沿顶板观察窗对应位置切割出玻璃滑片观察窗，使用水族箱胶将玻璃滑片粘接至腔室内，固化时间不少于24小时。确保观察窗凹陷，以便75毫米×25毫米×1毫米的显微镜玻璃盖片能与腔体表面齐平贴合。
- 在顶板和底板底面周围加工O型圈凹槽，使两板间距为0.02英寸，并插入橡胶O型圈。
- 在顶板和底板上对应钻出10个8/32英寸T.P.I.螺纹孔，用于安装8/32英寸平头螺钉。
4. 流路装置组装
- 首先组装完整的流路系统，然后再进行灭菌处理。
- 通过1/8英寸接头将一段36英寸的硬管连接到脉动阻尼器的一端，另一端连接一段18英寸的软管。
- 在第4.2步所述的18英寸软管末端安装一个1/8英寸公鲁尔接头。将该公鲁尔接头与一个1/8英寸母鲁尔接头连接，并将母鲁尔接头连接至另一段新的18英寸软管。
- 在250 ml玻璃烧杯盖上钻三个孔以穿过管路。将一段1.5英寸的软管（作为通气口）插入其中一个孔，将硬管和软管的自由端穿过另外两个孔，插入250 ml玻璃瓶中（作为储液瓶）（图2）。确保硬管到达储液瓶底部（作为从储液瓶流出的管路）。
- 将上述部件在121 °C条件下通过蒸汽高压灭菌60分钟。同时对一个完整的流室、3段2英寸软管、1个1/8英寸公鲁尔接头和1个母鲁尔接头、4个½英寸和6个5/16英寸8-32平头螺丝、一对镊子、一块75 × 25 × 1 mm的玻璃载片（或其他所需细胞培养表面材料）以及2块外科手术巾进行高压灭菌。
- 将灭菌后的手术巾放入超净工作台内，将流路系统、流室、4个四通旋塞阀、1个单通旋塞阀以及第4.5步中所有已灭菌的部件放置于该无菌区域内。
- 现在使用无菌手套连接两个四通旋塞阀，并在开放的取样端口上安装盖帽。
- 拆下连接流路中两段软管的公母鲁尔接头，插入已连接的旋塞阀（图3）。
- 将插入储液瓶中的软管连接至一个30 ml注射器，并取出注射器活塞。向瓶中加入125 ml EPC培养基（图4）。
- 将一个无菌注射器滤器插入通气口（图4）。
- 将整个流路系统转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱中。
- 将硬管夹入适用于此类管路的滚轴泵头中（图5）。确保管路不与滚轴泵的安装轨道重叠。使用记号笔在管路从泵头两侧穿出的位置做标记。
- 确保所有旋塞阀均关闭通向取样端口的方向，并沿流路方向打开。启动泵，验证流动方向。灌注液应从玻璃储液瓶经硬管流入脉动阻尼器。
5. EPC 荧光标记
- 当流路系统升温至 37 °C 时，准备将细胞接种到载玻片上。注意：如果需要在不透明材料（例如钛，Ti）上观察细胞，则必须进行荧光标记。
- 通过将 50 μg 的 Cell Tracker Orange（CTO）粉末溶于 90 μl 二甲基亚砜（DMSO）中，配制 1 mM 的 CTO 储存液。配制过程中需避免光照（在通风橱操作时关闭光源）。
- 取 36 μl CTO 储存液加入 18 ml 无血清 MCDB-131 培养基中，稀释成 2 μM 的 CTO 工作液。
- 用 10 ml 不含钙、镁离子的 DPBS 对 3 个接近汇合状态的 T-75 细胞培养瓶中的内皮祖细胞（EPCs）进行冲洗。
- 向每个培养瓶中加入 6 ml 2 μM 的 CTO 工作液，在 37 °C 下孵育 15 分钟。随后用 10 ml 不含钙、镁离子的 DPBS 洗涤每个培养瓶两次。
- 向每个培养瓶中加入 4 ml 胰蛋白酶溶液，在 37 °C 下孵育 3 分钟，然后加入 8 ml 胰蛋白酶中和液进行中和。
- 以 600g 离心 5 分钟进行洗涤，弃上清后将细胞重悬于 5 ml EPC 培养基中。
6. 流动腔室组装前载玻片的细胞接种
- 可使用玻璃、钛或其他材料制成的载玻片，并可通过旋涂聚合物或添加金属层对载玻片表面进行修饰。将载玻片放入无菌的矩形四室细胞培养皿中（若需要聚苯乙烯表面，可使用组织培养滑片瓶）。计数细胞，并在5 ml EPC培养基中接种1.5 × 106 个细胞，培养6小时，以在开始流动时获得融合的细胞层（图11A）。
- 为检测细胞在流体剪切应力下的铺展和黏附情况，可在开始流动前仅让3 × 106 个细胞黏附15分钟（快速接种）（图11B）。
7. 流动腔室组装
- 使用无菌手套，将一段 2 英寸软管连接到 1/8 英寸雌性鲁尔接头上。将另一段 2 英寸软管连接到 1/8 英寸雄性鲁尔接头上。
- 将带有雌性鲁尔接头的 2 英寸软管连接至进液口，将带有雄性鲁尔接头的 2 英寸软管连接至出液口。在这两个鲁尔接头上均安装四通旋塞阀。将剩余的一段 2 英寸软管连接至除泡阱侧端接口，并安装一个单向旋塞阀（图 6）。
- 使用无菌镊子，从细胞培养容器中取出接种有细胞的载玻片（若使用载玻片培养瓶，则取出带载玻片的培养瓶），并将其放入流室底板的凹槽中。确保载玻片的细胞接种面朝上放置。
- 用移液器将 10 ml 预热的 EPC 培养基滴加到载玻片上。让培养基覆盖载玻片和流室，但不要使培养基溢出到底板的 O 形圈上。
- 将流室的顶板放置在底板上，对齐螺丝孔。在此过程中，保持两块板平行，以避免将气泡引入流室。
- 用螺丝将两块板固定在一起（使用自动电池驱动螺丝刀可加快此过程）。
- 打开连接在进液侧除泡阱端口的单向旋塞阀，使用 10 ml 注射器轻轻用 EPC 培养基冲洗进液管路，以去除进液除泡阱中的气泡。然后关闭该旋塞阀并盖上盖帽（图 7）。
- 现在打开出液口的四通旋塞阀，再次使用 10 ml 注射器轻轻将 EPC 培养基冲洗通过流室，以去除流室通道内的气泡。如果仍有较大气泡，可将流室的出液端抬高至 45° 角（图 8）。
- 将所有四通旋塞阀的连接口盖上盖帽并关闭。将组装好的流路系统连同流室一起移入培养箱中（图 9）。
- 暂停流路系统的泵。将流路系统中的旋塞阀沿流动方向关闭，以防止泄漏并保持流室内无菌。将流室从超净工作台转移至流路系统，将流室连接到流路系统上。打开旋塞阀使流动方向通畅，重新启动流泵。确保灌注液按正确方向流动。调节流速至所需的剪切应力。
- 在流动实验过程中，可将流室从流路系统中断开，以便通过明场或荧光显微镜观察细胞。为此，需在旋塞阀与旋塞阀的连接处断开流室与流路系统的连接。为保持流室的无菌状态，在将流路系统从培养箱中取出前，应沿流动方向关闭流路系统和流室上的旋塞阀，并为所有旋塞阀盖上盖帽（图 9）。
8. 灌注液样本采集
- 为便于收集灌注液样本进行分析（例如一氧化氮合成），首先暂停泵的运行。
- 关闭靠近脉动阻尼器的旋塞阀。取下其保护帽，并将小规格注射器（如 3 ml 注射器）插入取样口。保留帽盖，并将其倒置放置，以防污染。
- 关闭朝向流动腔室方向的旋塞阀，保持取样口和管路朝向脉动阻尼器的方向开放。
- 从管路中抽取所需体积的样本（如 150 μl）。在拔出注射器前，先关闭朝向取样口的旋塞阀。将灌注液样本存入已标记的样品瓶中，并于 -80 °C 冷冻保存（用于后续时间点的一氧化氮测定）。
- 重新盖上取样口帽盖，并在开始流动前确保所有旋塞阀均处于开放状态。
9. 典型结果
采用我们的快速接种方法，可将人血液来源的内皮祖细胞接种到钛片上，孵育15分钟，即可在15 dynes/cm2的生理（动脉）剪切力下牢固黏附。
如图10所示，在15 dynes/cm2的流体剪切应力作用下，内皮祖细胞（EPCs）的铺展面积从接种后立即测量的210 ± 11.4 μm2，增加至3小时后的657 ± 39.1 μm2，并在24小时后进一步增至1152 ± 55.3 μm2（各组间差异具有统计学显著性，p < 0.0001，单因素方差分析）。伴随着细胞面积的增加——可通过透明培养室使用光学显微镜或荧光显微镜成像观察——根据公式2计算的细胞圆度6
在接种后立即为 878 x 10-3 ± 5.9 x 10-3，经相同流体剪切应力作用 3 小时后降至 671 x 10-3 ± 19.2 x 10-3，48 小时后进一步降至 526 x 10-3 ± 19.2 x 10-3（各组间差异具有统计学意义，p < 0.0001，单因素方差分析）。
图11D 显示，在15 dynes/cm2的流体剪切应力作用48小时后，内皮祖细胞（EPCs）沿流动方向排列并定向，而相比之下，在静置接种6小时后，细胞呈随机分布，如图11A所示。
我们的方法还允许在预定的时间点获取灌注液样品，用于分析和/或定量分泌的细胞代谢物。作为代表性示例，我们在图12中展示了猪内皮祖细胞（EPCs）在48小时流动实验期间亚硝酸盐（NO2-）的生成情况。我们直接测定了不同时间点从流动回路中收集的培养基样品中一氧化氮（NO）的主要氧化产物亚硝酸盐，将其作为NO的替代标志物；结果显示，在15 dynes/cm2 6的条件下，每1×106个细胞在6小时、12小时、24小时和48小时的亚硝酸盐含量分别为12.0 nmol、13.1 nmol、16.3 nmol和24.6 nmol。
图 1. 流路组件及流动实验的示意图。(A) 未安装流动室的流路组件。图中包括储液罐、脉冲阻尼器、硬质管路、软管、四通旋塞阀及连接的鲁尔接头，以及空气过滤器。(B) 通过硬质管路段将流动室连接至流动泵头。(C) 将接种EPC的载玻片插入流动室底板。(D) 安装流动室后的完整流路组件。
图 2. 完全组装好的用于灭菌的流动回路。
图3. 灭菌后包含旋塞阀的组装流路。
图 4. 向玻璃储液瓶中加入 125 ml EPC 培养基。
图 5. 流路已夹紧在流泵头中，准备插入流室。
图6. 上腔室板组件。
图 7. 使用 EPC 培养基冲洗气泡捕集器，以去除腔室进液侧的气泡。
图 8. 用 EPC 培养基冲洗腔室，以去除载玻片及腔室流出侧的气泡。
图 9. 流动实验过程中已插入流动室的完整组装流动回路。
图10. EPC面积（μm2）随着流动实验时间的推移而增加。
图11. (A) 接种于纤连蛋白包被的玻片上培养6小时后的HUCB EPCs在100倍放大下的光学显微镜图像。B) 用 CTO 标记的 HUCB EPCs 在灌流前 15 分钟快速接种至钛片上，通过荧光显微镜以 100 倍放大倍数观察。C) 与 (B) 中相同的Ti载玻片，经100 dynes/cm²剪切力作用3小时后的HUCB EPCs2 并通过透明腔室以100倍放大倍数进行成像。注意细胞在流动3小时后出现铺展，但仍呈随机排列方向。（D同一张Ti载玻片在100倍放大倍数下观察，经48小时流动暴露后的结果。EPCs以CTO标记，细胞核经流动处理后用Hoechst染料（蓝色）染色。注意细胞沿流动方向排列。E) 48小时、15 dynes/cm²流体剪切力作用后，用于与Ti表面比较的猪EPCs2 剪切应力暴露下的细胞。细胞边界用抗PECAM染色（绿色），细胞核用Sytox Orange核酸染色。注意细胞沿流动方向排列。
图12. 该图表展示了猪EPCs在48小时流动条件下一氧化氮（NO）的生成情况。作为NO的主要氧化产物，亚硝酸盐（NO2-）被用作替代指标，通过在流动过程中不同时间点采集的培养基样本进行测定以反映NO水平。
图13. 流动腔室由铝合金6061矩形材料制成，顶部组件（A）尺寸为0.5" × 2" × 7"，底部组件（B）尺寸为0.25" × 2" × 7"。顶部组件的底面用于O形圈接触的表面被加工至0.45"，以确保密封时的平整度。顶部组件中心区域被铣出0.125"深的凹槽，两端各保留0.95"，形成尺寸为0.3125" × 1.375"的流体储液区。顶部组件的储液区加工有3/8-24 T.P.I.螺纹，深度为0.25"，用于安装螺纹不锈钢堵头。在底面加工有尺寸为1/16" × 0.625"的槽，贯穿至储液区。进液侧堵头设有10/32"通孔，用于连接聚丙烯1/8"接头，再连接至止流夹。每个单元端部中央设有10/32 T.P.I.螺纹孔，深度为0.25"，用于安装聚丙烯1/8"接头，位于0.45" × 2"的端面上。两端通过底部螺纹孔下方0.07"的通孔贯穿至储液区。顶部组件底面设有一段宽0.6875"、从中心向左侧槽（LH槽）倾斜0.518度的锥面，延伸距离为1.460"。该锥面过渡至一段宽0.6875"、深0.0118"、距玻璃（或其他表面，如钛片）凹槽端部0.590"的平面区域。当载片安装到位后，该平面必须与玻璃（或其他表面，如钛片）表面齐平。锥面与平面区域均经过抛光处理。载片表面比底部表面低0.0118"。该0.0118"的凹陷从载片延伸至右侧（RH）端的储液槽。O形圈槽围绕槽和载片完整布置，O形圈槽与载片之间保留0.020"的原始表面。顶部和底部组件均钻有十个孔。顶部组件设有8/32 T.P.I.沉头平头螺钉的通孔。底部组件的孔位置与顶部对应，加工为8/32 T.P.I.螺纹孔。底部组件设有一块透明玻璃观察窗，与表面齐平，位于细胞培养表面的玻璃载片（或钛片）上方。该组件设有O形圈槽，环绕顶部组件的槽，其宽度使得底部载片与内侧O形圈槽之间保留0.04"的原始表面。顶部组件使用的O形圈为红色硅胶AS568A标准，Dash编号044；底部组件为Dash编号046。请点击此处查看图13的放大版本。
讨论
我们的流体回路和流动腔室可使贴壁细胞（例如内皮祖细胞，EPCs）暴露于特定的流体剪切应力下。由于腔室的顶部和底部均为透明材质，因此可实时通过腔室直接观察细胞的黏附和形态，也可在流动实验结束后拆卸腔室进行观察。此时，可在无菌条件下收集细胞，用于重新接种，或提取其 DNA 或 RNA 等，以进行后续分析。
为实现层流，腔室的设计必须满足若干条件。
首先，流动必须是层流，可通过计算其雷诺数（Re）来验证，雷诺数是惯性力与黏性力的比值。（若黏性力占主导，则Re较小，流动为层流或“充分发展流”——通常当Re < 2300时如此；若惯性力占主导，流动将变得越来越无序，直至形成湍流，通常当Re > 4000时即为此情况。）我们可根据公式38计算Re，
其中ρ为流体密度，Q为流速，μ为黏度，w和h分别为腔室的宽度和高度，Dh为水力直径，其定义见公式48，
我们三个流室的高度范围为166 - 267 μm，在计算得到15 dynes/cm2剪切应力的流速下，雷诺数范围为13.9 - 34.6。在计算得到100 dynes/cm2剪切应力的流速下，流室的雷诺数范围为90.4 - 234。所有这些雷诺数均远低于2300，符合层流条件。
其次，为了使速度场和剪切应力沿流动通道方向的距离无关（即充分发展），从流体入口到载玻片的距离必须大于入口段长度Le。这可通过根据公式59计算入口段长度来满足。
对于上述列出的数值，入口段长度范围为 0.01 至 0.25 cm。
第三，为了确保横向方向上的流速和剪切应力与一维通道流的值（ΔPh/2L）相比无明显变化，高宽比 h/w 必须远小于1。当二维流动条件下的平均壁面剪切应力达到一维流动条件下壁面剪切应力的95%时，h/w 必须等于0.10；当二维流动条件下的壁面剪切应力达到一维流动条件下的97.5%时，h/w 必须等于0.05。本研究所设计的流动腔室宽度为1.7 cm，高度为166–267 μm，满足上述标准。
如果入口处不存在横向压力梯度，则压力仅沿流动方向发生变化。可通过在流动路径中使用染料或示踪粒子来评估这一情况。此外，对于稳态流动实验，需在流动回路中插入脉动阻尼器。该装置可消除由蠕动泵在回路中引起的大部分脉动，从而使我们能够近似满足稳态流动的假设条件。需要注意的是，所使用的脉动阻尼器应与回路中的泵和管路相兼容，以便有效消除蠕动泵在特定频率下所产生的输出流动脉动。在本演示中，当脉动阻尼器安装在排液管路中，并与任意一款 Masterflex L/S 系列泵（0 - 600 转/分钟）及 I/P 26 管路配合使用时，Masterflex L/S 脉动阻尼器可实现层流流动。对于脉动流动，可使用可编程泵来生成不同的波形。
对于脉动流，可以使用可编程泵来生成各种波形。
此外，该回路设计使得可在不同时间点轻松收集灌流液样品，而不会污染细胞或流动培养基。在本示例中，NO 的浓度2- 采用 Ionics/Sievers 一氧化氮分析仪（NOA 280，Sievers Instruments，Boulder，CO）通过化学发光法测定，方法如前所述10用于亚硝酸盐分析的还原剂为乙酸中的碘化钾（14.5 M 乙酸和 0.05 M KI），该还原剂具有将亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO）的还原电位，但不足以还原氮的其他高价氧化物（如硝酸盐），因此对亚硝酸盐具有相对特异性。亚硝酸盐的总生成量通过生成浓度与回路总体积的乘积计算，并根据取样过程中损失的体积进行校正。6.
以下步骤对于成功实施流式实验至关重要：
- 在建立流动系统时，应尽量避免气泡的形成，因为气泡可能将细胞从其表面撕脱。为避免此问题，在将流动室的上部放置到下部时应格外小心，最佳操作方式是保持上下两部分相互平行，并一次性平稳地将上部压下，过程中不再调整。这样，流动通道中可能存在的微小气泡或漂浮气泡将被引导至铝制外壳两端的气泡捕获区。
- 必须确保储液罐中的出流管延伸至罐底。否则，当灌注液液面略低于管口时，空气可能被吸入从储液罐通向流动室的管路中。
- 研究人员应熟悉泵的流动方向，以防止启动流动时泵意外反向运行，否则会导致空气被吸入回路和流动室中。
- 为避免泡沫形成（由血清中变性蛋白引起），建议将从流动室通向储液罐的管路末端置于储液罐内灌注液液面上方约2.5厘米处。但保持管口高于液面有助于在实验过程中确认液体是否正常流入储液罐。
- 在拧紧流动室各部件时，应一手牢固握住外壳，另一手操作电动螺丝刀。请注意，电动螺丝刀的运转会产生扭矩，当螺丝拧紧时可能导致流动室突然旋转。
- 为防止回路中产生压力波而使细胞从表面脱落，启动流动前应确保所有旋塞阀均处于打开状态。
- 对于较长时间的流动实验（> 48小时），我们建议使用更坚硬且更具弹性的管路插入泵头，以防止管路破裂。
- 由于泵头滚轮调节不当，管路可能在泵头内部发生“迁移”。因此，我们建议密切注意管路在泵头中的固定情况，并用记号笔在管路两端做标记，以便在实验过程中轻松发现管路是否被“拉入”或移位。
- 每次开始灌注前，务必仔细检查回路和流动室的每一个连接点，以防止因连接不良导致灌注液泄漏。这一点对于脉动阻尼器的进流和出流接头尤为重要！
- 若使用荧光标记，请注意限制光照暴露时间。
我们流动腔的一个可能局限性在于，其高度由铝材上加工出的通道高度固定。然而，这一设计的优点是无需在每次实验前校验和调整通道高度，从而只需将泵的流速调节至目标值即可简化剪切应力的计算。根据您的研究目标，可能需要在不提高泵速的情况下增加剪切应力。在此情况下，我们建议提高灌注液的黏度，例如向培养基中添加葡聚糖11。
流动回路的一个可能局限性是所用培养基体积较大，这在尝试定量细胞代谢物的极低浓度时可能会带来问题。尽管此处未展示，但通过使用更小的储液罐和脉动阻尼器，并缩短管路长度和减小管径，可显著减小回路体积。
此外，还有多种其他可商业获得的系统可用于在培养细胞中施加流体剪切应力。基于微流控的系统，例如 Fluxion 公司的 BioFlux 系统，能够通过将溶液加载到作为这些通道输入和输出储液池的孔板中，实现对不同微流控通道内细胞的同时分析12,13,14。然而，这些微流控系统及其他类似系统不兼容标准显微镜载玻片，且无法回收足够数量的细胞用于后续实验，例如 RT-PCR 或 Western Blot。此外，这些系统操作性较差，成本至少为 40,000 美元，根据配套设备的不同，总费用可能超过 100,000 美元。
Flexcell International Corporation 提供的两种微流体系统——Flexcell Streamer 系统和 FlexFlow 系统——已成功用于在流体流动条件下研究内皮细胞15,16,17、人纤维环细胞18以及成纤维细胞19。另一种通过 GlycoTech 提供的系统已被用于研究肿瘤细胞黏附20和白细胞黏附21至内皮单层细胞。
Streamer 系统可同时对多张载玻片施加相同的剪切应力，但其缺乏观察窗口，且与我们的设计不同，无法实现对流动条件下细胞的实时观察。
FlexFlow 系统具有观察窗，但需要使用直立显微镜，而这种显微镜可能并非大多数实验室的标准配置。此外，将细胞包被的盖玻片放入流动室时，FlexFlow 系统要求将其倒置。这使得无法在不透明表面（例如我们研究中所展示的钛涂层玻璃）上观察荧光标记的细胞。最后，该系统需要专门购买配套的盖玻片，且整体设备价格高达数千美元，与 Flexcell Streamer 系统相当。
GlycoTech 提供圆形和平行板式矩形流动室，其成本显著较低，但由浇铸丙烯酸材料制成，无法像我们的流动室一样方便地进行蒸汽高压灭菌。值得注意的是，其他已有报道可高压灭菌的流动室因需要特殊显微镜镜头而显得不实用22,23。GlycoTech 系统在上下板之间使用硅橡胶垫圈，该垫圈在反复使用后厚度会发生变化，从而导致流动室高度随时间改变（制造商建议每使用十次后更换新的垫圈）。我们的铝制流动室内置O型圈，可确保上下板完全贴合，从而保证实验间流动室高度恒定。最后，许多流动室设计（包括 GlycoTech 流动室）需要真空泵来实现无泄漏密封，而我们的设计则无需此装置。
尽管此处未展示，整个流动实验过程中可将流室置于显微镜下，以实现对细胞黏附和/或行为的实时成像。如需如此，建议在流室下方使用加热灯或加热垫，以维持灌注液温度在37 °C。此外，若不希望对细胞、代谢物或研究性药物或试剂进行“循环”使用，则可用注射泵替代滚压泵24。
还可以将不同标记的细胞流经贴壁细胞，例如将荧光标记的血小板流经融合生长的内皮祖细胞（EPC）层（采用Achneck等人6,25描述的血小板检测方法），以评估在流体剪切应力条件下的细胞间相互作用。我们的流动腔室结合了其他现有流动腔室的多种优点，例如灌注液取样口和观察窗，并具有一个重要优势，即可兼容倒置或正置显微镜。该腔室可完全高压灭菌，允许在恒定腔室高度下重复实验，且无需使用真空泵即可实现密封防漏。
披露
本视频文章的制作与免费访问由 Cole-Parmer Instrument Co. 赞助。
致谢
作者谨此感谢生物医学仪器与机械加工车间的 Joe Owen 在流动室部件的加工与组装过程中所付出的不懈努力，以及徕卡显微系统公司的 Matt Maudsley 在通过流动室成像细胞技术方面提供的协助。我们衷心感谢杜克大学灌注服务部的 Kevin Collins 和生物医学工程系的 Steve Wallace 博士在流动回路设计方面提出的宝贵建议。此外，我们还要感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目对 Alexandra Jantzen 的资助，以及美国国立卫生研究院（NIH）通过资助项目“自体EPC衬层改善循环辅助装置生物相容性”（项目编号：RC1HL099863-01）所提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10 ml 注射器 | Cole-Parmer | 07940-12 | |||||||||||||
| 单向旋塞 | Cole-Parmer | 30600-00 | |||||||||||||
| 30 ml 注射器 | BD Biosciences | 309650 | |||||||||||||
| 四通旋塞 | Cole-Parmer | 30600-04 | |||||||||||||
| 铝合金 | N/A | 6061 | |||||||||||||
| 细胞培养皿（4孔，矩形） | 赛默飞世尔科技公司 | 267061 | |||||||||||||
| 细胞示踪橙染料 | 英杰公司 | C34551 | |||||||||||||
| DMSO | Research Organics | 2162D | |||||||||||||
| DPBS (-/-) | 英杰公司 | 14190-144 | |||||||||||||
| EGM-2 单次添加试剂盒 | 龙沙公司 | CC-4176 | |||||||||||||
| 雌性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 纤维连接蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895-2MG | |||||||||||
| 带盖玻璃瓶（250 ml） | Cole-Parmer | 硬质管路 | Cole-Parmer | HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |||||||||
| Histopaque | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |||||||||||||
| H–chst 染色液 | Sigma-Aldrich | H6024 | |||||||||||||
| Hyclone FBS | 赛默飞世尔科技公司 | SH30071.01 | |||||||||||||
| L-谷氨酰胺 | 龙沙公司 | 17-605E | |||||||||||||
| 雄性鲁尔接头 | Cole-Parmer | MCDB-131, 1X 培养基 | Cellgro | 15-100-CV | |||||||||||
| 带凸缘聚丙烯接头 | Cole-Parmer | O型圈 | N/A | AS568A | |||||||||||
| 脉冲阻尼器 | Cole-Parmer | 泵驱动装置（Masterflex L/S 变速经济型驱动器） | Cole-Parmer | 泵头（Masterflex 易装泵头） | Cole-Parmer | 滑块 | Cole-Parmer | 软管 | Cole-Parmer | 注射器滤器 | Cole-Parmer | Sytox Orange 核酸染料 | 英杰公司 | S-11368 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | 龙沙公司 | CC-5012 | |||||||||||||
| 胰蛋白酶中和液 | 龙沙公司 | CC-5002 | |||||||||||||
参考文献
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