胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

摘要

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。

摘要

小鼠是研究哺乳动物大脑发育的优良模式生物，因其具有丰富的分子和遗传数据。然而，发育中的小鼠大脑不便于进行操作和成像 体内 由于小鼠胚胎难以接触且不透明，因此胚胎脑组织的器官型切片培养被广泛用于研究小鼠脑发育。 体外. 离体 基因操作或转基因小鼠的使用可实现基因表达的调控，从而使神经元或胶质细胞的特定亚群被荧光蛋白标记。随后可通过延时成像技术观察标记细胞的行为。延时成像在研究晚期胚胎阶段大脑皮层发育过程中所涉及的细胞行为方面已取得显著成功。 ^1-2. 胚胎期脑区以外区域的类器官切片培养系统尚不完善，因此，描述神经元细胞迁移的大量延时成像数据仍局限于前脑区域 ^3,4目前尚不清楚在背侧脑中发现的发育原则是否同样适用于腹侧脑区。在腹侧脑中，神经元以神经元簇的形式组织，而非分层排列，并且通常需要经历复杂的迁移路径才能到达最终位置。腹侧中脑不仅是研究腹侧脑发育的良好模型系统，还包含多巴胺能神经元等与疾病过程相关的神经元群体。尽管在成年及衰老大脑中，多巴胺能神经元的功能与退化已被广泛深入研究，但这些神经元在分化和迁移阶段的行为仍知之甚少。 ⁵我们在此描述了从小鼠胚胎第12.5天（E12.5）腹侧中脑制备脑片培养的方法。此类脑片培养体系可能适用于连续数天监测多巴胺能神经元的发育过程 体外重点介绍在胚胎发育早期阶段制备脑切片的关键步骤，并讨论维持多巴胺能神经元正常发育所需的条件 体外我们还展示了延时成像实验的结果。在这些实验中，利用基于Cre/loxP的可诱导谱系示踪系统，以嵌合方式标记了腹侧中脑前体细胞（包括多巴胺能前体细胞）及其后代细胞。 ⁶.

方案

本方案的部分内容修改自 Daza 等, 2007 ⁷.

1. 准备工作

1. 可提前一天制备
   1. 配制 1X Krebs 缓冲液（1.5 L）： 126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄:H₂O、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、11 mM 葡萄糖、25 mM NaHCO₃；调节 pH 至 7.4。经滤膜（0.22 μm 孔径）过滤除菌后，于 4°C 保存。
   2. 配制培养基（20 mL）：5 mL HBSS、9 mL 高糖 DMEM、850 μL 30 % 葡萄糖溶液、5 mL 马血清（终浓度 25 %）。加入 200 μL 100X 青霉素/链霉素。4°C 保存。
2. 开始解剖前的准备工作
   1. 在 1X Krebs 缓冲液中配制 100 mL 4 % 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）：将溶液放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解，随后置于 45 °C 水浴中保温。
   2. 用冰冻的 1X Krebs 缓冲液填满振动切片机的缓冲液槽，并启动冷却装置（保持在 4°C）。将刀片固定在刀架上，并在振动切片机旁准备好解剖刀、细毛刷和微型带孔小勺用于拾取脑片。准备盛有 1X Krebs 缓冲液的无菌培养皿（35 × 10 mm）用于收集脑片，并置于冰上备用。
   3. 设置解剖区域：准备用于解剖的无菌培养皿（100 × 15 mm）和用于包埋的小型无菌培养皿（35 × 10 mm）、小剪刀、两把精细镊子（Dumont 5）、微型带孔小勺、经火焰抛光且顶端圆钝封闭的玻璃巴斯德移液管，以及 1 L 冰上预冷的 1X Krebs 缓冲液。所有解剖器械均用 70 % 乙醇擦拭消毒。
   4. 向 6 孔板各孔中加入培养基（1.5 mL/孔），并将 6 孔板置于 37 °C 培养箱中预热。
   5. 准备另一块 6 孔板，每孔加入 1.5 mL 无菌 1X Krebs 缓冲液和 15 μL 青霉素/链霉素（100X）。在无菌条件下，将 Millicell 细胞培养插件放入各孔中。将该 6 孔板置于振动切片机旁，以便切片完成后立即将脑片转移至滤膜上。

2. 胚胎大脑的解剖与包埋

1. 使用异氟烷麻醉怀孕雌性小鼠，并通过颈椎脱位处死小鼠（胚胎应处于E12.5阶段）。用镊子提起子宫，将其从母鼠体内取出。用另一把镊子将子宫系膜从子宫上分离。将子宫置于冰上预冷的1×Krebs缓冲液中。用精细镊子分离子宫肌层、Reichert膜和卵黄囊，从而暴露胚胎。将胚胎从子宫中取出，放入盛有无菌1×Krebs缓冲液的独立培养皿中。
2. 在体视显微镜下解剖脑组织。解剖时，首先剪下胚胎头部。用精细镊子穿过头部（眼睛水平位置）固定头部。用另一把镊子小心去除皮肤和颅骨。用镊子轻轻抬起完整脑组织，转移至盛有无菌1×Krebs缓冲液的培养皿中。解剖过程中必须保持脑组织整体结构的完整性，因为脑组织损伤会在振动切片机切片时引发问题（如组织破碎）。
3. 将脑组织在4%低熔点（LMP）琼脂糖中洗涤一次。每次将2–3个脑组织置于新鲜的4% LMP琼脂糖中包埋。将包埋皿尽可能水平地放置于冰上。使用火焰抛光圆头的巴斯德移液管轻轻托起脑组织，直至琼脂糖底部完全凝固。脑组织应平稳地水平沉降，与琼脂糖块底部平行。
4. 待琼脂糖完全凝固（约3分钟后），修整脑组织周围的琼脂糖，并将琼脂糖块粘附于振动切片机的样品台。粘贴时，需确保脑组织腹侧与平台平行，以便进行水平切面切片。

3. 振动切片机切片

1. 使用剃须刀片进行切片。为获得完整的切片，在切片过程中必须将温度维持在 4°C。
2. 以 50 Hz 的频率、1.1 mm 的刀片振幅和 25 mm/sec 的速度切取 300 μm 厚的水平切片。
3. 使用细毛刷将切片推入微型带孔勺中，以收集脑切片，并将其转移至含有无菌冰冻 1X Krebs 缓冲液的培养皿中。选择包含腹侧中脑组织的切片（见图 1）。在 E12.5 小鼠脑中，仅有一个 300 μm 厚的水平切片包含腹侧中脑组织，其中包括多巴胺能神经元。

4. 脑片培养

步骤 4.2-4.5 应在无菌条件下进行。

1. 将脑切片转移至六孔板中的Millipore细胞培养膜插件上，孔中预先加入1×Krebs缓冲液（见步骤1.2.5）。使用迷你带孔小勺（Fine Science Tools）和细毛刷进行切片转移。每个膜上最多可放置3个切片。
2. 将带有脑片的膜转移至含有培养基的六孔板中（见步骤1.2.5）。膜的上表面不应被培养基覆盖。脑片从下方获取培养基，从上方接触空气。
3. 将六孔板放入含5% CO₂的培养箱中₂ 在 37 °C切片在解剖操作开始后2小时内必须放入培养箱中。制备时间过长可能导致切片存活率下降。
4. 切片可在体外培养最多3天。在第2天更换50%的培养基^nd 天

5. 时间序列成像

1. 在开始延时成像前，将脑片在培养箱中恢复 4-5 小时。
2. 进行延时成像时，将脑片保留在膜插件上，并将插件转移至一个 35 mm 的 Ibidi μ-皿中（皿底由高光学质量材料制成）。
3. 向皿中加入 1 mL 培养基和 1.5 μL 抗坏血酸（200 mM）。抗坏血酸可保护脑片免受光毒性损伤。
4. 延时成像期间，将脑片置于 37 °C、5 % CO2 的环境培养箱中孵育。

6. 代表性结果

图1展示了从E12.5小鼠脑组织制备脑片器官型培养的过程。图2显示了来自E12.5小鼠脑的水平方向脑片器官型培养物（急性切片及培养数天后的切片）。作为对照，展示了发育阶段相当的冷冻脑切片。中脑多巴胺能神经元通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色进行可视化。这些中脑多巴胺能神经元向端脑内的靶区发出投射。这些投射在E12.5开始形成，并在随后的几天内向端脑延伸。我们认为，端脑投射的发育是培养中多巴胺能神经元正常发育的良好指标。在水平脑片中，中脑多巴胺能神经元向其正确的端脑靶区延伸投射。在体外培养3天（DIV）后，或当端脑靶区受损时，会出现异常投射并延伸至背侧中脑。图3展示了E12.5中脑冠状切片的示例。通过TH免疫染色标记的多巴胺能神经元向背侧中脑发出异常投射。图4展示了对器官型脑片培养物中增殖、坏死和凋亡细胞的分析。BrdU免疫染色用于标记增殖细胞，结果显示在培养1天（DIV）后细胞可在培养条件下增殖。在4 DIV后，细胞增殖减少。在3 DIV后，腹侧中脑的许多细胞发生坏死（碘化丙啶染色）和凋亡（cleaved caspase-3免疫染色）。图5展示了在急性脑片中通过延时成像实验监测YFP标记神经元的迁移路径。

图1. 器官型脑片培养制备流程示意图。使用振动切片机对E12.5胚胎期小鼠脑组织进行切片，获得厚度为300 μm的水平脑片。(A) E12.5小鼠脑的矢状面示意图，标示了切片位置。含多巴胺能神经元的区域以粉红色表示，其投射路径以蓝色表示。(B) 从背侧至腹侧可获得的三片脑片示意图，均包含前脑（Fb）和中脑（Mb）。注意仅其中一片脑片（b）含有多巴胺能神经元。可通过脑室位置以及中脑与前脑组织的连续性（箭头所示，将b切片与a和c切片比较）来识别合适的脑片。含多巴胺能神经元的区域以粉红色标示，含多巴胺能前体细胞的区域以绿色标示，蓝色箭头表示正在发育的神经投射。(C) 含多巴胺能神经元的脑片被置于膜插件上进行培养。缩写：vMb，腹侧中脑；dMb，背侧中脑；Hyp，下丘脑；Hb，后脑。

图2. 中脑多巴胺能神经元在脑片器官型培养中的投射依赖于前脑的完整性。使用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学标记多巴胺能神经元。（A）急性脑片（0 DIV），显示中脑腹侧区多巴胺能神经元的正常位置。白色箭头指示右上角插图中高倍放大所示区域。此时向前脑的投射尚未形成。培养1天后（1 DIV），向前脑的投射开始形成；在2–3 DIV时，投射已延伸至前脑。白色箭头指示插图中白色框内高倍放大所示的胞体位置。黄色箭头突出显示完整脑片中正常的投射路径，该路径在插图（黄色框）中以高倍放大显示。当前脑受损时，出现异常投射。红色箭头指示投射至中脑背侧的异常纤维，该结构在插图（红色框）中以高倍放大显示。损伤部位以红色星号标示。培养3天后（3 DIV），大多数脑片（n=5/7）均出现朝向中脑背侧的异常投射。（B）不同发育阶段小鼠水平冷冻脑切片上的TH免疫染色，用于展示多巴胺能投射的发育过程 体内白色箭头指示插图中高倍放大图像（白色框）所示细胞体的位置。黄色箭头标示插图中高倍放大图像（黄色框）所示突起的位置。冷冻切片的层面选择为与器官型脑片培养的层面尽可能一致。注意单个冷冻切片（12 μm）并不代表整个器官型切片300 μm）。因此，在E13.5和E14.5时期观察到的投射均来自切片 120 μm 位于含有细胞体的切面（黄色星号）的腹侧。

图 3. 以酪氨酸羟化酶（TH）染色的中脑冠状切片培养物，作为多巴胺能神经元的标记。（A-C）分别培养 1、2 或 3 天后的切片。多巴胺能神经元向背侧中脑发出异常投射（红色箭头）。箭头指示多巴胺能神经元胞体的位置。

图 4. 中脑类器官切片培养中的细胞增殖与细胞活力。（A）通过在培养基中加入 BrdU（50 ng/mL，Sigma）孵育 18 小时标记增殖细胞，随后对切片进行 BrdU 免疫染色。培养 1 天后，BrdU 标记的细胞位于脑室区（红色箭头所示）。培养 4 天后，增殖细胞分布更为弥散，脑室区结构不再明显。（B）通过在培养基中加入碘化丙啶（1 μg/μL，Sigma）孵育 2 小时标记坏死细胞，并通过荧光显微镜观察。培养 1 天后，腹侧中脑（vMb）无明显坏死，但在背侧中脑和前脑可见大量碘化丙啶标记的细胞。培养 3 天后，腹侧中脑的细胞活力下降。比例尺：500 μm。（C）cleaved caspase-3 免疫染色以显示凋亡细胞。在培养 1 或 2 天时，仅有少量多巴胺能神经元（TH）发生凋亡。培养 3 天后，多巴胺能神经元开始出现凋亡。中间和右侧图像是左侧图中框选区域的高倍放大图像。高倍图像为 14–16 层 z 轴堆叠图像的最大强度投影。图像使用 Zeiss Apotome 系统以每 0.5 μm 采集一层获取。

图5. 急性脑片中YFP标记神经元的迁移路径。（A） 用于YFP标记神经元延时成像的水平脑片。成像前脑片孵育5小时。细胞标记采用可诱导的Cre/loxP系统⁶. Shh^CreER 小鼠 ⁸ 和 ROSA^{loxP-STOP-loxP-EYFP} 报告基因小鼠 ⁹ 使用了ROSA报告等位基因（以及EYFP表达），该等位基因在表达CreER（即Shh表达细胞）的细胞中发生重组，但仅在给予他莫昔芬（Tamoxifen，Sigma）后被诱导。在此示例中，于E8.5时期向孕鼠给予他莫昔芬（3 mg/40 g体重）。该实验设计主要导致中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞及其后代被标记^10,11 比例尺： 500 μm（B）在急性脑片中标记YFP神经元的迁移路径。使用蔡司Axio-Observer显微镜（物镜：EC PlnN 10x /0.3），每30分钟采集一次YFP标记的命运图谱神经元的时间推移图像，总时长为5小时30分钟。脑片置于环境培养室（Pecon Incubator XLS1）中孵育。 37 °C 并供应5% CO₂₂ 成像过程中，细胞的初始位置用红色箭头标记，迁移后的位置用红色星号标记。

讨论

此处介绍的器官型脑片培养方法为短期研究提供了一个系统 体外 分析胚胎腹侧中脑中多巴胺能神经元的发育过程及其迁移与投射路径。我们发现，该实验方案中存在多个关键步骤，需谨慎操作，以获得能够支持腹侧中脑多巴胺能神经元正常发育的脑片。其中最关键的步骤是胚胎脑组织的解剖，该过程必须快速且精确。与制备成年脑片不同，必须使用配备冷却系统的振动切片机，并采用低频率结合高切速的参数，才能获得完整的E12.5胚胎脑片。此外，我们观察到脑片必须在水平面上进行切片，以便在包含腹侧中脑的同时，也将多巴胺能神经元投射的前脑靶区保留在切片内。我们还注意到，只有当前脑结构在切片中保持完整时，多巴胺能神经元才能形成正常的投射。在冠状切片中，前脑的靶区缺失，导致多巴胺能神经元异常投射至背侧中脑。

我们证明，按照本方案获得的脑片可在体外维持培养长达3天，且多巴胺能神经元能够保持其正常位置及前脑投射。此外，脑室区前体细胞的增殖能力在整个脑片中得以维持。然而，培养超过3天后，脑片的存活率显著下降。因此，来源于E12.5胚胎脑的脑片培养体系适用于研究多巴胺能神经元迁移与分化的早期阶段，但不适用于长期实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定试剂与设备列表
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
葡萄糖 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
马血清	Invitrogen	26050-088
DMEM（4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠）	Sigma-Aldrich	D6429-500
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403	配制 200 mM 储存液，于 -20°C 保存
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	15517-022
Millicell 插入式培养小室	EMD Millipore	PICMORG50
μ-dish 35 mm，低壁	Ibidi	80136
振动切片机	Microm International	HM 650V
剃须刀片	Plano GmbH	121-6
Histoacryl 组织胶	BRAU9381104	Braun Aesculap
带孔小勺，直径 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
镊子 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252 - 30
免疫染色所用抗体：
兔抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	AB152	稀释比例 1:500
小鼠抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	MAB318	稀释比例 1:500
小鼠抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	555627	稀释比例 1:200
兔抗活化型 Caspase-3 抗体	Cell Signaling Technology	9661	稀释比例 1:200
驴抗兔 IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	稀释比例 1:500
驴抗小鼠 IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	稀释比例 1:200