胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

摘要

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。

摘要

小鼠是研究哺乳动物大脑发育的优良模式生物，因其具有丰富的分子和遗传数据。然而，发育中的小鼠大脑不便于进行操作和成像 体内 由于小鼠胚胎难以接触且不透明，因此胚胎脑组织的器官型切片培养被广泛用于研究小鼠脑发育。 体外. 离体 基因操作或转基因小鼠的使用可实现基因表达的调控，从而使神经元或胶质细胞的特定亚群被荧光蛋白标记。随后可通过延时成像技术观察标记细胞的行为。延时成像在研究晚期胚胎阶段大脑皮层发育过程中所涉及的细胞行为方面已取得显著成功。 ^1-2. 胚胎期脑区以外区域的类器官切片培养系统尚不完善，因此，描述神经元细胞迁移的大量延时成像数据仍局限于前脑区域 ^3,4目前尚不清楚在背侧脑中发现的发育原则是否同样适用于腹侧脑区。在腹侧脑中，神经元以神经元簇的形式组织，而非分层排列，并且通常需要经历复杂的迁移路径才能到达最终位置。腹侧中脑不仅是研究腹侧脑发育的良好模型系统，还包含多巴胺能神经元等与疾病过程相关的神经元群体。尽管在成年及衰老大脑中，多巴胺能神经元的功能与退化已被广泛深入研究，但这些神经元在分化和迁移阶段的行为仍知之甚少。 ⁵我们在此描述了从小鼠胚胎第12.5天（E12.5）腹侧中脑制备脑片培养的方法。此类脑片培养体系可能适用于连续数天监测多巴胺能神经元的发育过程 体外重点介绍在胚胎发育早期阶段制备脑切片的关键步骤，并讨论维持多巴胺能神经元正常发育所需的条件 体外我们还展示了延时成像实验的结果。在这些实验中，利用基于Cre/loxP的可诱导谱系示踪系统，以嵌合方式标记了腹侧中脑前体细胞（包括多巴胺能前体细胞）及其后代细胞。 ⁶.

方案

本实验方案的部分内容改编自 Daza et al., 2007 ⁷。

1. 准备工作

1. 可提前一天制备
   1. 制备 1X Krebs 缓冲液（1.5 L）： 126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄:H₂O、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、11 mM 葡萄糖、25 mM NaHCO₃；调节 pH 至 7.4。使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，并于 4°C 保存。
   2. 制备培养基（20 mL）：5 mL HBSS、9 mL 高糖 DMEM、850 μL 30 % 葡萄糖溶液、5 mL 马血清（终浓度 25 %）。加入 200 μL 100 倍青霉素/链霉素溶液。4°C 保存。
2. 开始解剖前准备
   1. 在 1X Krebs 缓冲液中配制 100 mL 4 % 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）：将溶液放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解，随后置于 45 °C 水浴中保温。
   2. 用冰冻的 1X Krebs 缓冲液填满振动切片机的缓冲液槽，并启动冷却装置（保持 4°C）。将刀片固定在刀架上，并在切片....

讨论

此处介绍的器官型脑片培养方法为短期研究提供了一个系统 体外 分析胚胎腹侧中脑中多巴胺能神经元的发育过程及其迁移与投射路径。我们发现，该实验方案中存在多个关键步骤，需谨慎操作，以获得能够支持腹侧中脑多巴胺能神经元正常发育的脑片。其中最关键的步骤是胚胎脑组织的解剖，该过程必须快速且精确。与制备成年脑片不同，必须使用配备冷却系统的振动切片机，并采用低频率结合高切速的参数，才能获得完整的E12.5胚胎脑片。此外，我们观察到脑片必须在水平面上进行切片，以便在包含腹侧中脑的同时，也将多巴胺能神经元投射的前脑靶区保留在切片内。我们还注意到，只有当前脑结构在切片中保持完整时，多巴胺能神经元才能形成正常的投射。在冠状切片中，前脑的靶区缺失，导致多巴胺能神经元异常投射至背侧中脑。

我们证明，按照本方案获得的脑片可在体外维持培养长达3天，且多巴胺能神经元能够保持其正常位置及前脑投射。此外，脑室区前体细胞的增殖能力在整个脑片中得以维持。然而，培养超过3天后，脑片的存活率显著下降。因此，来源于E12.5胚胎脑的脑片培养体系适用于研究多巴胺能神经元迁移与分化的早期阶段，但不适用于长期实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定试剂与设备列表
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
葡萄糖 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
马血清	Invitrogen	26050-088
DMEM（4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠）	Sigma-Aldrich	D6429-500
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403	配制 200 mM 储存液，于 -20°C 保存
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	15517-022
Millicell 插入式培养小室	EMD Millipore	PICMORG50
μ-dish 35 mm，低壁	Ibidi	80136
振动切片机	Microm International	HM 650V
剃须刀片	Plano GmbH	121-6
Histoacryl 组织胶	BRAU9381104	Braun Aesculap
带孔小勺，直径 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
镊子 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252 - 30
免疫染色所用抗体：
兔抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	AB152	稀释比例 1:500
小鼠抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	MAB318	稀释比例 1:500
小鼠抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	555627	稀释比例 1:200
兔抗活化型 Caspase-3 抗体	Cell Signaling Technology	9661	稀释比例 1:200
驴抗兔 IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	稀释比例 1:500
驴抗小鼠 IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	稀释比例 1:200