胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

摘要

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。

摘要

小鼠是研究哺乳动物大脑发育的优良模式生物，因其具有丰富的分子和遗传数据。然而，发育中的小鼠大脑不便于进行操作和成像 体内 由于小鼠胚胎难以接触且不透明，因此胚胎脑组织的器官型切片培养被广泛用于研究小鼠脑发育。 体外. 离体 基因操作或转基因小鼠的使用可实现基因表达的调控，从而使神经元或胶质细胞的特定亚群被荧光蛋白标记。随后可通过延时成像技术观察标记细胞的行为。延时成像在研究晚期胚胎阶段大脑皮层发育过程中所涉及的细胞行为方面已取得显著成功。 ^1-2. 胚胎期脑区以外区域的类器官切片培养系统尚不完善，因此，描述神经元细胞迁移的大量延时成像数据仍局限于前脑区域 ^3,4目前尚不清楚在背侧脑中发现的发育原则是否同样适用于腹侧脑区。在腹侧脑中，神经元以神经元簇的形式组织，而非分层排列，并且通常需要经历复杂的迁移路径才能到达最终位置。腹侧中脑不仅是研究腹侧脑发育的良好模型系统，还包含多巴胺能神经元等与疾病过程相关的神经元群体。尽管在成年及衰老大脑中，多巴胺能神经元的功能与退化已被广泛深入研究，但这些神经元在分化和迁移阶段的行为仍知之甚少。 ⁵我们在此描述了从小鼠胚胎第12.5天（E12.5）腹侧中脑制备脑片培养的方法。此类脑片培养体系可能适用于连续数天监测多巴胺能神经元的发育过程 体外重点介绍在胚胎发育早期阶段制备脑切片的关键步骤，并讨论维持多巴胺能神经元正常发育所需的条件 体外我们还展示了延时成像实验的结果。在这些实验中，利用基于Cre/loxP的可诱导谱系示踪系统，以嵌合方式标记了腹侧中脑前体细胞（包括多巴胺能前体细胞）及其后代细胞。 ⁶.

方案

本实验方案的部分内容改编自 Daza et al., 2007 ⁷。

1. 准备工作

1. 可提前一天制备
   1. 制备 1X Krebs 缓冲液（1.5 L）： 126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄:H₂O、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、11 mM 葡萄糖、25 mM NaHCO₃；调节 pH 至 7.4。使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，并于 4°C 保存。
   2. 制备培养基（20 mL）：5 mL HBSS、9 mL 高糖 DMEM、850 μL 30 % 葡萄糖溶液、5 mL 马血清（终浓度 25 %）。加入 200 μL 100 倍青霉素/链霉素溶液。4°C 保存。
2. 开始解剖前准备
   1. 在 1X Krebs 缓冲液中配制 100 mL 4 % 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）：将溶液放入微波炉加热至琼脂糖完全溶解，随后置于 45 °C 水浴中保温。
   2. 用冰冻的 1X Krebs 缓冲液填满振动切片机的缓冲液槽，并启动冷却装置（保持 4°C）。将刀片固定在刀架上，并在切片区域准备好解剖刀、细毛刷和微型带孔勺，用于拾取脑片。准备盛有 1X Krebs 缓冲液的无菌培养皿（35 × 10 mm），用于收集切片，置于冰上保存。
   3. 在解剖区域准备好无菌培养皿（100 × 15 mm）用于组织解剖，小号无菌培养皿（35 × 10 mm）用于包埋，小剪刀、两把精细镊子（Dumont 5）、微型带孔勺、经火焰抛光且末端圆钝封闭的玻璃巴斯德移液管，以及 1 L 冰上预冷的 1X Krebs 缓冲液。所有解剖器械用 70 % 乙醇擦拭消毒。
   4. 向六孔板各孔中加入培养基（1.5 mL/孔），放入 37 °C 培养箱中预温。
   5. 准备另一六孔板，每孔加入 1.5 mL 无菌 1X Krebs 缓冲液和 15 μL 100 倍青霉素/链霉素溶液（100X）。在无菌条件下，将 Millicell 细胞培养插入式培养器放入各孔中。将该六孔板置于振动切片机旁，以便切片完成后立即转移脑片至滤膜上。

2. 胚胎大脑的解剖与包埋

1. 使用异氟烷麻醉一只怀孕的雌性小鼠，并通过颈椎脱位处死小鼠（胚胎应处于E12.5阶段）。用镊子提起子宫，将其从母体中取出。用另一把镊子将子宫旁的子宫系膜分离。将子宫置于冰上预冷的1× Krebs缓冲液中。用精细镊子将子宫肌层、Reichert膜和卵黄囊从胚胎上小心分离，取出胚胎，并将分离后的胚胎放入盛有无菌1× Krebs缓冲液的另一个培养皿中。
2. 在体视显微镜下解剖脑组织。解剖时，首先切断胚胎头部，用精细镊子穿过头部（眼睛水平位置）固定头部。用另一把镊子小心去除皮肤和颅骨，再用镊子轻轻抬起整个脑组织，转移至盛有无菌1× Krebs缓冲液的培养皿中。解剖过程中必须保持脑组织的完整性，因为脑组织的损伤会在振动切片机切片时导致组织撕裂等问题。
3. 将脑组织在4%低熔点（LMP）琼脂糖中洗涤一次。每次将2–3个脑组织包埋于新鲜的4% LMP琼脂糖中。将包埋用的培养皿尽可能水平地放置于冰上。使用火焰抛光圆头的巴斯德移液管轻轻托起脑组织，直至琼脂糖底部完全凝固。脑组织应平放，与琼脂糖块底部保持水平。
4. 待琼脂糖完全凝固（约3分钟后），修剪脑组织周围的琼脂糖，并将琼脂糖块粘附至振动切片机的样品台。粘附时，需确保脑组织的腹侧与平台平行，以便后续以水平切面进行切片。

3. 振动切片机切片

1. 使用剃刀进行切片。为获得完整的切片，在切片过程中必须将温度保持在 4°C，这一点至关重要。
2. 以 50 Hz 的频率、1.1 mm 的刀片振幅和 25 mm/sec 的速度切取 300 μm 厚的水平切片。
3. 使用细毛刷将切片推入微型带孔小勺中，以收集脑切片，并将其转移至含有无菌冰冻 1X Krebs 缓冲液的培养皿中。选择含有腹侧中脑组织的切片（见图 1）。在 E12.5 小鼠脑中，仅有一个 300 μm 厚的水平切片包含腹侧中脑组织，其中包括多巴胺能神经元。

4. 切片培养

步骤 4.2-4.5 应在无菌条件下进行。

1. 将脑切片转移至六孔板中的Millipore细胞培养膜插件上，孔中预先加入1×Krebs缓冲液（见步骤1.2.5）。使用迷你带孔小勺（Fine Science Tools）和细毛刷进行切片转移。每个膜上最多可放置3个切片。
2. 将带有脑片的膜转移至含有培养基的六孔板中（参见第1.2.5步）。膜的上表面不应被培养基覆盖。脑片从下方获得培养基，从上方接触空气。
3. 将六孔板放入含5% CO₂的培养箱中₂ 37℃ °C. 在解剖操作开始后的2小时内，必须将脑片放入培养箱中。制备时间过长可能导致脑片存活率下降。
4. 切片可在体外培养最多3天。在第2天更换50%的培养基^nd 天

5. 时间序列成像

1. 在开始延时成像前，将脑片在培养箱中恢复 4-5 小时。
2. 进行延时成像时，将脑片保留在膜插件上，并将插件转移至一个 35 mm 的 Ibidi μ-培养皿中（培养皿底部由高光学质量材料制成）。
3. 向培养皿中加入 1 mL 培养基，并添加 1.5 μL 抗坏血酸（200 mM）。抗坏血酸可保护脑片免受光毒性损伤。
4. 延时成像期间，将脑片置于 37 °C、5 % CO2 的环境培养箱中孵育。

6. 代表性结果

图1展示了从E12.5小鼠脑制备脑片器官型培养的过程。图2显示了来自E12.5小鼠脑的水平脑片器官型切片（急性切片及培养数天后的切片）。作为对照，展示了处于相应发育阶段的冷冻脑切片。中脑多巴胺能神经元通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色进行可视化。这些中脑多巴胺能神经元向端脑内的靶区发出投射。这些投射在E12.5开始形成，并在随后的几天内逐渐延伸至端脑。我们认为，端脑投射的发育是体外培养中多巴胺能神经元正常发育的良好指标。在水平切片中，中脑多巴胺能神经元向其正确的端脑靶区延伸投射。在体外培养3天（3 DIV）后，或当端脑靶区受损时，会出现异常投射并延伸至中脑背侧。E12.5中脑冠状切片的示例见图3。通过TH免疫染色标记的多巴胺能神经元向中脑背侧发出异常投射。图4展示了对器官型脑片培养物中增殖、坏死和凋亡细胞的分析结果。通过BrdU免疫染色标记增殖细胞，结果显示在培养1天（1 DIV）后，细胞在培养条件下仍能增殖；但在培养4天（4 DIV）后，增殖活性降低。在培养3天（3 DIV）后，腹侧中脑区域大量细胞发生坏死（碘化丙啶染色）和凋亡（cleaved caspase-3免疫染色）。图5展示了在急性切片中通过时间推移成像实验监测YFP标记神经元的迁移路径。

图1. 器官型脑片培养制备示意图。使用振动切片机对E12.5小鼠脑进行切片，获得300 μm厚的水平脑片。（A）E12.5小鼠脑的矢状面示意图，标示了切片位置。含多巴胺能神经元的区域以粉红色表示，其投射纤维以蓝色表示。（B）从背侧至腹侧可获得的三个包含前脑（Fb）和中脑（Mb）的脑片示意图。注意仅其中一个脑片（脑片b）含有多巴胺能神经元。可根据脑室位置以及中脑与前脑组织的连续性（箭头，比较脑片b与脑片a和c）来确定合适的脑片。含多巴胺能神经元的区域以粉红色标示，含多巴胺能前体细胞的区域以绿色标示，蓝色箭头表示正在发育的神经投射。（C）含多巴胺能神经元的脑片被置于膜插件上进行培养。缩写：vMb，腹侧中脑；dMb，背侧中脑；Hyp，下丘脑；Hb，后脑。

图2. 中脑多巴胺能神经元在脑片器官型培养中的投射依赖于前脑的完整性。采用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学标记多巴胺能神经元。（A）急性脑片（0 DIV），显示多巴胺能神经元在腹侧中脑的正常位置。白色箭头指示插图中高倍放大的区域。此时向前脑的投射尚未发育。培养1 DIV后，向前脑的投射开始形成；在2–3 DIV时，投射已延伸至前脑。白色箭头指示插图中高倍放大图像（白色边框）所示的细胞体位置。黄色箭头突出显示完整脑片中正常的投射，插图（黄色边框）为高倍放大图像。在前脑受损的脑片中出现异常投射。红色箭头指示投射至背侧中脑的异常纤维，插图（红色边框）为高倍放大图像。损伤部位以红色星号标记。培养至3 DIV时，大多数脑片（n=5/7）均出现朝向背侧中脑的异常投射。（B）不同发育阶段小鼠水平冷冻脑切片的TH免疫染色，用于显示多巴胺能投射的发育过程 体内白色箭头指示的是插图中（白色框内）高倍放大所示细胞体的位置。黄色箭头标示的是插图中（黄色框内）高倍放大所示突起的位置。冷冻切片的层面选择为与器官型切片培养物的层面尽可能一致。注意单个冷冻切片（12 μm）并不代表整个器官型切片（300 μm）。因此，在 E13.5 和 E14.5 观察到的投射位于第 120 号切片上 μ比含有细胞体的切片（黄色星号）更偏腹侧。

图3. 以酪氨酸羟化酶（TH）染色的中脑冠状切片培养，作为多巴胺能神经元的标记。（A-C）培养1、2或3天后的切片。多巴胺能神经元向中脑背侧发出异常投射（红色箭头）。箭头指示多巴胺能神经元胞体的位置。

图4. 中脑类器官切片培养中的细胞增殖与细胞活力。（A）通过在培养基中加入BrdU（50 ng/mL，Sigma）孵育18小时以标记增殖细胞，随后对切片进行BrdU免疫染色。在培养1天后（DIV），BrdU标记的细胞位于脑室区（红色箭头所示）。在培养4天后，增殖细胞分布更为弥散，脑室区结构不再明显。（B）通过在培养基中加入碘化丙啶（1 μg/μL，Sigma）孵育2小时以标记坏死细胞，并通过荧光显微镜观察。在培养1天后，腹侧中脑（vMb）未见明显坏死，但在背侧中脑和前脑区域可见大量碘化丙啶标记的细胞。在培养3天后，腹侧中脑的细胞活力下降。比例尺：500 μm。（C）通过cleaved caspase-3免疫染色标记凋亡细胞。在培养1天或2天时，仅有少量多巴胺能神经元（TH）发生凋亡。在培养3天后，多巴胺能神经元开始出现凋亡。中间和右侧图像是左侧图中框选区域的高倍放大图像，高倍图像为14–16帧z轴层扫图像的最大强度投影，使用Zeiss Apotome系统以每0.5 μm采集一张图像。

图5. 急性脑片中YFP标记神经元的迁移路径。（A） 用于YFP标记神经元延时成像的水平脑片。成像前脑片孵育5小时。细胞标记采用可诱导的Cre/loxP系统⁶。Shh^CreER 小鼠⁸ 与 ROSA^{loxP-STOP-loxP-EYFP} 报告小鼠⁹ 被用于实验。ROSA报告等位基因的重组（及EYFP表达）仅在表达CreER（即表达Shh的细胞）且给予他莫昔芬（Sigma）后被诱导。本示例中，于胚胎发育第8.5天（E8.5）向孕鼠给予他莫昔芬（3 mg/40 g体重）。该实验设计主要实现对中脑腹侧多巴胺能神经元前体及其后代细胞的标记^10,11。比例尺：500 μm。（B）急性脑片中YFP标记神经元迁移路径的追踪。在Zeiss Axio-Observer显微镜（物镜EC PlnN 10x /0.3）上，每30分钟采集一次YFP标记的命运图谱神经元的延时图像，总时长为5小时30分钟。成像期间，脑片置于环境培养室（Pecon Incubator XLS1）中，维持37 °C并供给5 % CO₂。细胞的起始位置以红色箭头标示；迁移后的位置以红色星号标示。

讨论

此处介绍的器官型脑片培养方法为短期研究提供了一个系统 体外 分析胚胎腹侧中脑中多巴胺能神经元的发育过程及其迁移与投射路径。我们发现，该实验方案中存在多个关键步骤，需谨慎操作，以获得能够支持腹侧中脑多巴胺能神经元正常发育的脑片。其中最关键的步骤是胚胎脑组织的解剖，该过程必须快速且精确。与制备成年脑片不同，必须使用配备冷却系统的振动切片机，并采用低频率结合高切速的参数，才能获得完整的E12.5胚胎脑片。此外，我们观察到脑片必须在水平面上进行切片，以便在包含腹侧中脑的同时，也将多巴胺能神经元投射的前脑靶区保留在切片内。我们还注意到，只有当前脑结构在切片中保持完整时，多巴胺能神经元才能形成正常的投射。在冠状切片中，前脑的靶区缺失，导致多巴胺能神经元异常投射至背侧中脑。

我们证明，按照本方案获得的脑片可在体外维持培养长达3天，且多巴胺能神经元能够保持其正常位置及前脑投射。此外，脑室区前体细胞的增殖能力在整个脑片中得以维持。然而，培养超过3天后，脑片的存活率显著下降。因此，来源于E12.5胚胎脑的脑片培养体系适用于研究多巴胺能神经元迁移与分化的早期阶段，但不适用于长期实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定试剂与设备列表
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
葡萄糖 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
马血清	Invitrogen	26050-088
DMEM（4.5 g/L 葡萄糖，含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠）	Sigma-Aldrich	D6429-500
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403	配制 200 mM 储存液，于 -20°C 保存
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	15517-022
Millicell 插入式培养小室	EMD Millipore	PICMORG50
μ-dish 35 mm，低壁	Ibidi	80136
振动切片机	Microm International	HM 650V
剃须刀片	Plano GmbH	121-6
Histoacryl 组织胶	BRAU9381104	Braun Aesculap
带孔小勺，直径 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
镊子 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252 - 30
免疫染色所用抗体：
兔抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	AB152	稀释比例 1:500
小鼠抗酪氨酸羟化酶抗体	EMD Millipore	MAB318	稀释比例 1:500
小鼠抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	555627	稀释比例 1:200
兔抗活化型 Caspase-3 抗体	Cell Signaling Technology	9661	稀释比例 1:200
驴抗兔 IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	稀释比例 1:500
驴抗小鼠 IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	稀释比例 1:200