在癌症的生产和检测活性氧（ROS）的

摘要

在这里，我们提出简单的方法来测试和评估细胞活性氧的存在。

摘要

活性氧分子，破坏DNA和RNA和氧化的蛋白质和脂质（脂质peroxydation）。这些反应的分子中含有氧和包括H _{2 O} 2（双氧水），NO（一氧化氮_），O ² - （氧化物阴离子），过氧亚硝基阴离子^（ONOO - ），hydrochlorous酸（次氯酸）和羟自由基^（OH - ） 。

氧化品种生产不仅病理情况下（癌症，缺血/再灌注，神经系统及心血管病症，传染性疾病，炎症性疾病，自身免疫性疾病等... ...），而且在非生理（病理）的情况下， ^如细 ​​胞的新陈代谢3 ^4。事实上，活性氧在许多细胞信号通路中发挥重要作用（增殖，细胞^{活化5，6，7}迁移等。） 。 ROS可以是有害的（然后被称为“氧化和nitrosative强调”）时，在细胞内的车厢和细胞产生高量一般回应ROS通过上调抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽（GSH），保护这些危险的自由基转换成无害的分子（即水）。维生素C和E也被形容为ROS的拾荒者（抗氧化剂）。

自由基是在³低量是有益的。巨噬细胞和中性粒细胞介导的免疫反应涉及NO的产生和释放，从而抑制病毒，病原体和肿瘤增殖^8。 NO还与其他ROS反应，因此，也有作为解毒剂（活性氧清除剂）的作用。最后船只上的任何行为，调节血液流量，这是非常重要的肌肉^{适应长时间运动} 9 ，10。一些出版物也表明，活性氧参与胰岛素SENSitivity ^11，12。

许多方法来评价ROS产生。在这篇文章中，我们提出了几个简单，快速，经济实惠的的检测;这些实验已经验证了许多出版物，通常用来检测在哺乳动物细胞中ROS或其影响。虽然这些化验检测多种活性氧，其他检测只有一个单一的活性氧。

方案

1。 ROS的检测，使用羧基- _H 2 DCFDA

羧基- H ₂ DCFDA非荧光，但是，当这种试剂氧化的活性氧的存在，成为绿色荧光。

1. 立即使用前，准备在无菌二甲基亚砜（DMSO）或100％的乙醇的新鲜原液的羧基- _H 2 DCFDA 。避免你的染料多个解冻/冻结周期。
2. 洗净细胞，与HEPES缓冲盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）删除原介质的痕迹。
3. 负载与染料的细胞（和控制染料，比照注意部分）。在这个实验中，我们使用的Jurkat，人白血病细胞株。使用常规培养基中的终浓度为1μm降低血清（2％），羧基_- H 2 DCFDA。
4. 孵育30分钟，在黑暗中的文化，在传统的孵化器（37℃，5％CO2）。丢弃所有未使用的染料解决方案。
5. 删除羧基- H ₂ DCFDA介质中的HBSS或PBS洗两次。从这一步，由轻保护您的细胞。
6. 加入新鲜的培养基中含有您的首选药物的羧基_- H 2 DCFDA加载细胞和孵化需要。对于这个例子，我们用H _{2 O} 2（0.03％），1个小时。
7. 评估立即流量使用FL1通道（绿色荧光），或荧光酶标仪或荧光显微镜流式细胞仪分析细胞的活性氧。可检测到使用适合绿色荧光的激发和发射波长的....

讨论

一些病理情况，如炎症性疾病，癌症，缺血/再灌注，如放疗或化疗治疗（即顺铂）诱导ROS的生产过剩。因此，检测和测量ROS水平是很重要的，在很多的基础，临床前和临床研究。但是，活性氧有很短的半衰期，可能是复杂的检测。在这里，我们建议经常使用，并免费在哺乳动物细胞中的激进生产检测被广泛接受的简单测试。

使用染料的检测协议允许实验者使用各种广泛使用?.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
5 - （和6） - 羧基-2'，7' -二氯荧光素二乙酸酯（羧基DCFDA）	分子探针	C369	控制
羧基- H 2 DCFDA	分子探针	C400
磺胺	西格玛	S9251 - 100G
N - 1 - napthylethylenediamine盐酸盐	西格玛	N9125 - 10G
亚硝酸盐标准	西格玛	237213 - 100G
GSH / GSSG - GLO含量	Promega公司	V6612	为了量化氧化，减少或氧化/还原型谷胱甘肽