本文提出了一些简单的方法，用于检测和评估细胞中活性氧的存在。
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摘要
摘要
活性氧包括多种能够损伤DNA和RNA，并氧化蛋白质和脂质（脂质过氧化）的分子。这些活性分子均含有氧，包括H2O2（过氧化氢）、NO（一氧化氮）、O2-（超氧阴离子）、过氧亚硝酸根（ONOO-）、次氯酸（HOCl）以及羟基自由基（OH-）。
氧化物质不仅在病理状态下产生（如癌症、缺血/再灌注、神经和心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病）， 1，自身免疫性疾病 2等…但也在细胞代谢等生理（非病理）情况下发生 3, 4。事实上，活性氧（ROS）在许多细胞信号通路（如增殖、细胞活化）中发挥着重要作用 5, 6迁移 7 等）。当细胞内区室中产生大量活性氧时，可能对细胞造成损害（此时称为“氧化和亚硝化应激”），细胞通常通过上调抗氧化物质来应对，例如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以及谷胱甘肽（GSH），这些物质通过将有害的自由基转化为无害分子（如水）来保护细胞。维生素C和E也被描述为活性氧清除剂（抗氧化剂）。
少量自由基对人体有益3。巨噬细胞和中性粒细胞介导的免疫反应涉及一氧化氮（NO）的生成和释放，NO可抑制病毒、病原体以及肿瘤细胞的增殖8。NO还可与其他活性氧（ROS）发生反应，因此也具有解毒作用（作为活性氧清除剂）。最后，NO作用于血管以调节血流，这对肌肉适应长时间运动至关重要9, 10。多项研究还表明，活性氧参与胰岛素敏感性的调节11, 12。
目前有多种方法可用于评估活性氧（ROS）的产生。本文介绍几种简单、快速且经济的检测方法；这些方法已被大量文献验证，并常规用于检测哺乳动物细胞中的活性氧或其效应。其中一些检测方法可识别多种活性氧，而另一些则仅针对单一活性氧。
方案
1. 使用羧基-H2DCFDA 检测活性氧
Carboxy-H2DCFDA 本身无荧光，但在活性氧（ROS）存在时，该试剂被氧化后会发出绿色荧光。
- 使用前立即配制新鲜的羧基-H储备液2将 DCFDA 溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）或 100% 乙醇中。避免染料反复冻融。
- 用HEPES缓冲盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除残留的原始培养基。
- 用染料（以及对照染料，参见注释部分）对细胞进行负载。在本实验中，我们使用了Jurkat细胞，一种人类白血病细胞系。使用羧基-H2终浓度为的DCFDA 1μM 在含低血清（2%）的常规培养基中
- 在常规培养箱中避光孵育培养物 30 分钟，37°C，5% CO₂）。弃去所有未使用的染料溶液。
- 去除羧基-H2含DCFDA的培养基中孵育，并用HBSS或PBS洗涤两次。从这一步开始，需避免细胞暴露于光照下。
- 向羧基-H中加入含有你所选药物的新鲜培养基2DCFDA 负载的细胞并按需要进行孵育。本示例中我们使用 H2O2 （0.03%）1小时。
- 通过流式细胞术（使用FL1通道，绿色荧光）、荧光酶标仪或荧光显微镜立即分析细胞以检测活性氧（ROS）。可采用适合绿色荧光的激发波长和发射波长检测荧光信号。
注意：对照组应包括负载羧基-H2DCFDA的未处理细胞和未染色的未处理细胞。已知羧基-H2DCFDA可用于检测过氧化物，但也可能被其他活性氧（ROS）氧化。该试剂还可能通过其他途径被修饰，因此实验中应包含对氧化不敏感的对照染料，例如5-(和6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（carboxy-DCFDA）。
2. 一氧化氮（NO）生成量的测定
您需要磺胺酰胺（Sulfanilamide）和N-1-萘乙二胺二盐酸盐（NED）溶液，以及亚硝酸盐标准品。该检测称为格里斯（Griess）检测。
NED 溶液：将盐酸萘乙二胺配制成 0.1% 的溶液，用无菌水稀释。磺胺溶液：将磺胺酰胺配制成 1% 的溶液，用 5% 磷酸稀释。亚硝酸盐标准品：将 0.1 M 的亚硝酸钠标准储备液用无菌培养基稀释至 100 μM，并在相同培养基中进行系列稀释。
储存条件：按照生产商的指示在室温下储存化学品。NED 和磺胺溶液在重新配制后，使用完毕应立即于 4°C 避光保存，最多可保存 3 个月。
- 将细胞接种于96孔板中，每种实验条件设三个复孔，并根据实验需求设置适当的对照组。
- 对细胞进行处理以诱导一氧化氮（NO）的产生。在本实验中，我们使用脂多糖（LPS）（100 ng/ml）和重组IL-4处理细胞。本方案中使用的细胞为RAW 264.7，一种小鼠巨噬细胞系（小鼠白血病单核巨噬细胞系）。
- 检测当天，将两种试剂恢复至室温。
- 离心收集细胞上清液，取50μl转移至新的96孔板中。对标准品储备液进行倍比稀释，制备标准曲线用各稀释孔。
- 向每个样品孔和对照孔中加入50μl磺胺溶液，并充分混匀。
- 在避光条件下室温孵育10分钟。
- 向每个样品孔和对照孔中加入50μl N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液，并充分混匀。
- 在避光条件下室温孵育10分钟。
- 立即使用酶标仪在波长520 nm至550 nm的滤光片下测定吸光度。
如果使用不同规格的培养板/培养皿，请对每种溶液和样品上清液使用等体积（1/1/1）添加量。
阳性孔中会出现紫色。通过标准品获得的结果可帮助您检查溶液的稳定性。
3. 活性氧作用的检测：氧化蛋白
检测活性氧（ROS）生成的另一种方法是通过检测蛋白质的氧化来观察其最终结果。事实上，ROS 会修饰谷胱甘肽（glutathione），这是一种在大多数细胞中表达的抗氧化剂，具有抵御 ROS 的保护作用。在被 ROS 氧化后，还原型谷胱甘肽（GSH）发生修饰，其半胱氨酸残基上的巯基（硫醇基团）通过二硫键与另一个谷胱甘肽分子连接，从而形成二聚体蛋白（氧化型谷胱甘肽 GSSG）。GSSG 可通过谷胱甘肽还原酶的作用重新转化为 GSH。GSSG/GSH 比值的升高反映了氧化应激水平。以下实验基于对这些氧化型蛋白的检测与定量。该方法并不特异性识别某一种 ROS，而是检测一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）及其他 ROS 的总体效应。本实验通过生物发光信号测定总氧化型（GSSG）和还原型（GSH）谷胱甘肽的含量。
- 将细胞以常规方法接种于96孔板（白色/透明，平底）中。在本实验中，我们对贴壁的Raw 264.7和A549细胞以及悬浮的Jurkat细胞每孔接种1×104个细胞。根据细胞大小，可适当调整接种数量。建议在检测前一天接种贴壁细胞，以便细胞充分贴附。应准备足够数量的孔，用于检测氧化和还原态蛋白，并设置“仅培养基”和未处理细胞作为对照。所有条件均需设置三个复孔。
- 按照所需时间用药物处理细胞。本实验中，Jurkat细胞和A549细胞分别用5 mM和2.5 mM的H2O2处理1小时，Raw 264.7细胞则用200 ng/ml的LPS处理16小时。在孵育期间，将所有试剂恢复至室温（RT）。所有试剂应在检测前不超过30分钟内配制。下表列出了每孔所需试剂的体积。进行检测前，应尽可能去除含有还原剂的培养基。
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | |||
| 总谷氨酸裂解 | 氧化型谷氨酸裂解 | 总谷氨酸裂解 | 氧化型谷氨酸裂解 | |
| NEM, 25mM | 无 | 0.5μl | 无 | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 μl | 1 μl | 1 μl | 1 μl |
| Passive Lysis Buffer, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| 蒸馏水 | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| 最终体积 每孔 | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- 移除贴壁细胞孔中的培养基。悬浮细胞孔中的培养基不要移除。
- 向相应的孔中加入还原型谷胱甘肽裂解试剂或氧化型谷胱甘肽裂解试剂，在室温下震荡5分钟。
- 加入荧光素生成试剂，室温孵育30分钟。
- 加入荧光素检测试剂，室温孵育15分钟。
- 使用酶标仪 luminometer，以每孔0.25-1秒的积分时间读取生物发光信号。
| 贴壁细胞 | 悬浮细胞 | |
| 每孔细胞数量 | 1x104 | 1x104 |
| 每孔细胞悬液+药物 | 100 μl，3.4 步骤前需移除 | 25 μl，无需移除 |
| 还原型谷胱甘肽裂解试剂 | 50 μl | 25 μl |
| 氧化型谷胱甘肽裂解试剂 | 50 μl | 25 μl |
| 荧光素生成试剂 | 50 μl | 50 μl |
| 荧光素检测试剂 | 100 μl | 100 μl |
4. 代表性结果：
图1 使用羧基-H2DCFDA染料检测活性氧（ROS）。经H2O2处理的Jurkat细胞（人白血病细胞系）与未处理细胞进行比较。活性氧（ROS）可诱导羧基-H2DCFDA发生修饰，产生绿色荧光，通过流式细胞术检测到该荧光信号。与对照组（使用氧化不敏感染料染色的H2O2处理细胞，以及使用羧基-H2DCFDA染色的未处理细胞）相比，H2O2处理组细胞的荧光峰发生偏移。结果证实了处理组细胞中存在活性氧（ROS）。
图2 使用Griess试剂检测NO。将RAW 264.7细胞（小鼠巨噬细胞）用LPS和IL-4处理。与未处理的对照组细胞相比，处理组细胞中NO的生成显著增加。
| 细胞系 | 未处理 | 处理后 |
| Raw 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
表1 蛋白质经活性氧介导氧化的检测。RAW 264.7 细胞经 LPS 处理，Jurkat 细胞和 A549（人肺癌）细胞经 H2O2 处理。结果以还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值表示。与未处理的对照细胞相比，处理细胞中谷胱甘肽（GSH）/（GSSG）比值更低，表明处理细胞中的蛋白质氧化程度更高。
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讨论
多种病理状况（如炎症性疾病、癌症、缺血/再灌注损伤）以及某些治疗手段（如放射治疗或化疗，即顺铂）均可诱导活性氧（ROS）的过度产生。因此，在许多基础研究、临床前研究和临床研究中，检测和测定ROS水平具有重要意义。然而，ROS的半衰期极短，检测较为困难。本文介绍几种常规使用且被广泛认可的检测哺乳动物细胞自由基生成的简单方法。
使用染料的检测方案可使实验人员采用多种广泛可用的方法（如显微镜、流式细胞术、酶标仪等）….) 来检测活性氧（ROS）的存在。流式细胞术和显微镜技术可提供有关细胞活力以及无ROS、低ROS和高ROS产生细胞所占百分比的信息。显微镜还可提供ROS对细胞形态和细胞黏附影响的相关信息。使用酶标仪进行检测主要获得定量数据。Griess法检测一氧化氮（NO）具有定量性，但无法提供所研究细胞形态或黏附状态的任何信息。在小鼠细胞中，NO的检测相对简单。然而，在人源样本中NO含量较低，因此在检测过程的每一步都必须更加谨慎，并设置适当的对照。蛋白质氧化检测用于评估被研究细胞所产生的所有ROS的总体效应；此处获得信号强度代表了ROS的生成量。H₂O₂的检测2...
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披露
本出版物得到了普洛麦格（Promega）的支持。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（CA142664）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-(和-6)-羧基-2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（carboxy-DCFDA） | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | 对照 |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| 磺胺 | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| 盐酸萘乙二胺 | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| 亚硝酸盐标准品 | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo 检测试剂盒 | Promega Corp. | V6612 | 用于定量氧化型、还原型或氧化/还原型谷胱甘肽 |
参考文献
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