本文提出了一些简单的方法，用于检测和评估细胞中活性氧的存在。
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本文内容
摘要
摘要
活性氧包括多种能够损伤DNA和RNA，并氧化蛋白质和脂质（脂质过氧化）的分子。这些活性分子均含有氧，包括H2O2（过氧化氢）、NO（一氧化氮）、O2-（超氧阴离子）、过氧亚硝酸根（ONOO-）、次氯酸（HOCl）以及羟基自由基（OH-）。
氧化物质不仅在病理状态下产生（如癌症、缺血/再灌注、神经和心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病）， 1，自身免疫性疾病 2等…但也在细胞代谢等生理（非病理）情况下发生 3, 4。事实上，活性氧（ROS）在许多细胞信号通路（如增殖、细胞活化）中发挥着重要作用 5, 6迁移 7 等）。当细胞内区室中产生大量活性氧时，可能对细胞造成损害（此时称为“氧化和亚硝化应激”），细胞通常通过上调抗氧化物质来应对，例如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以及谷胱甘肽（GSH），这些物质通过将有害的自由基转化为无害分子（如水）来保护细胞。维生素C和E也被描述为活性氧清除剂（抗氧化剂）。
少量自由基对人体有益3。巨噬细胞和中性粒细胞介导的免疫反应涉及一氧化氮（NO）的生成和释放，NO可抑制病毒、病原体以及肿瘤细胞的增殖8。NO还可与其他活性氧（ROS）发生反应，因此也具有解毒作用（作为活性氧清除剂）。最后，NO作用于血管以调节血流，这对肌肉适应长时间运动至关重要9, 10。多项研究还表明，活性氧参与胰岛素敏感性的调节11, 12。
目前有多种方法可用于评估活性氧（ROS）的产生。本文介绍几种简单、快速且经济的检测方法；这些方法已被大量文献验证，并常规用于检测哺乳动物细胞中的活性氧或其效应。其中一些检测方法可识别多种活性氧，而另一些则仅针对单一活性氧。
方案
1. 使用羧基-H2DCFDA 检测活性氧
Carboxy-H2DCFDA 本身无荧光，但在活性氧（ROS）存在时，该试剂被氧化后会发出绿色荧光。
- 使用前立即配制新鲜的羧基-H储备液2将 DCFDA 溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）或 100% 乙醇中。避免染料反复冻融。
- 用HEPES缓冲盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除残留的原始培养基。
- 用染料（以及对照染料，参见注释部分）对细胞进行负载。在本实验中，我们使用了Jurkat细胞，一种人类白血病细胞系。使用羧基-H2终浓度为的DCFDA 1μM 在含低血清（2%）的常规培养基中
- 在常规培养箱中避光孵育培养物 30 分钟，37°C，5% CO₂）。弃去所有未使用的染料溶液。
- 去除羧基-H2含DCFDA的培养基中孵育，并用HBSS或PBS洗涤两次。从这一步开始，需避免细胞暴露于光照下。
- 向羧基-H中加入含有你所选药物的新鲜培养基2DCFDA 负载的细胞并按需要进行孵育。本示例中我们使用 H2O2 （0.03%）1小时。
- 通过流式细胞术（使用FL1通道，绿色荧光）、荧光酶标仪或荧光显微镜立即分析....
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讨论
多种病理状况（如炎症性疾病、癌症、缺血/再灌注损伤）以及某些治疗手段（如放射治疗或化疗，即顺铂）均可诱导活性氧（ROS）的过度产生。因此，在许多基础研究、临床前研究和临床研究中，检测和测定ROS水平具有重要意义。然而，ROS的半衰期极短，检测较为困难。本文介绍几种常规使用且被广泛认可的检测哺乳动物细胞自由基生成的简单方法。
使用染料的检测方案可使实验人员采用多种广泛可用的方法（如显微镜、流式细胞术、酶标仪等）….) 来检测活性氧（ROS）的存在。流式细胞术和显微镜技术可提供有关细胞活力以及无ROS、低ROS和高ROS产生细胞所占百分比的信息。显微镜还可提供ROS对细胞形态和细胞黏附影响的相关信息。使用酶标仪进行检测主要获得定量数据。Griess法检测一氧化氮（NO）具有定量性，但无法提供所研究细胞形态或黏附状态的任何信息。在小鼠细胞中，NO的检测相对简单。然而，在人源样本中NO含量较低，因此在检测过程的每一步都必须更加谨慎，并设置适当的对照。蛋白质氧化检测用于评估被研究细胞所产生的所有ROS的总体效应；此处获得信号强度代表了ROS的生成量。H₂O₂的检测2.......
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披露
本出版物得到了普洛麦格（Promega）的支持。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（CA142664）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-(和-6)-羧基-2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（carboxy-DCFDA） | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | 对照 |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| 磺胺 | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| 盐酸萘乙二胺 | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| 亚硝酸盐标准品 | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| GSH/GSSG-Glo 检测试剂盒 | Promega Corp. | V6612 | 用于定量氧化型、还原型或氧化/还原型谷胱甘肽 |
参考文献
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythem....
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