定向细胞自组装构建细胞来源组织环用于生物力学分析与组织工程

摘要

本文概述了一种通过细胞自组装构建细胞来源组织环的多功能方法。将平滑肌细胞接种至环形琼脂糖孔中，细胞可在7天内聚集并收缩，形成坚固的三维（3D）组织。毫米尺度的组织环适用于力学测试，并可作为组织组装的基本单元。

摘要

每年，数十万患者在美国接受冠状动脉旁路移植手术。¹ 其中约三分之一的患者由于疾病进展或既往已取材，缺乏合适的自体供体血管。血管组织工程的目标是为这些旁路移植物开发出合适的替代来源。此外，工程化血管组织还可作为活体血管模型，用于研究心血管疾病，具有重要价值。目前已探索多种有前景的血管组织工程方法，近年来许多研究集中于细胞为基础的方法的开发与分析。^2-5 本文中，我们介绍一种可使细胞快速自组装形成三维组织环的方法，该组织环可用于体外模拟血管组织。

为此，将平滑肌细胞悬液接种到圆底环形琼脂糖孔中。琼脂糖的非黏附特性可使细胞沉降、聚集并围绕孔中心的支柱收缩，从而形成一个完整的组织环^6,7。这些组织环可在收获前培养数天，用于力学、生理学、生物化学或组织学分析。我们已证明，这些由细胞衍生的组织环的极限抗张强度可达100–500 kPa⁸，高于类似培养周期下其他组织工程血管结构所报道的数值（<30 kPa）^9,10。我们的结果表明，可在较短时间内高效生成由细胞衍生的血管组织环，并为直接定量评估细胞及其分泌的细胞外基质（CDM）对血管组织结构与功能的贡献提供了可能。

方案

1. 细胞接种模具的制备

首先将一块厚度为1/2英寸的聚碳酸酯材料进行铣削加工，制备出15个具有圆底的环形孔，中心柱直径为2 mm。铣削出的通道深度为6 mm，宽度为3.75 mm。清洁并干燥聚碳酸酯模具，以去除铣削过程中产生的任何塑料碎屑。

按10:1（质量比）混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基料与固化剂，脱气以去除所有气泡，然后浇注到聚碳酸酯模具上。再次脱气以除去任何残留气泡，并在60°C烘箱中固化4小时。

固化后，小心地将PDMS模板从聚碳酸酯表面缓慢剥离，用肥皂和水清洗，并进行高压灭菌。同时，将含有2%琼脂糖（w/v）溶于杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的溶液进行高压灭菌。

将PDMS模板置于水平表面上，先用移液器将熔化的琼脂糖加入每个中心柱模具中，然后再注入其周围的空隙。让琼脂糖凝固（约15分钟），随后将模具倒置，使琼脂糖从PDMS上脱模。切除每个孔周围多余的琼脂糖，将琼脂糖孔放入12孔板中。

2. 细胞培养与环形接种

在琼脂糖模具的外围加入细胞培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM），注意不要覆盖模具顶部。将培养板放入培养箱中，平衡约15分钟，同时准备细胞。

当细胞融合度达到90%时，用胰蛋白酶消化大鼠主动脉平滑肌细胞（rSMCs），并重悬于浓度为5×10⁶ 个细胞/mL的溶液中。取100 μL细胞悬液，用移液器以环形运动方式加入每个环形琼脂糖小孔中，确保每个小孔均均匀覆盖细胞悬液。

确保培养箱的隔板水平，然后将培养板放入培养箱中，静置24小时，期间避免扰动。此后每两天更换一次培养基，通过吸去孔周围培养基的方式换液，并重新加入培养基，直至琼脂糖孔完全浸没。

3. 组织环的采集与厚度测量

培养结束时，通过将环从中心柱顶部滑动取下，从琼脂糖模具中取出环。

将环置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的小型培养皿中，使样本居中，并使用数字成像系统采集图像。

使用图像分析程序进行边缘检测，并在其圆周的4个位置（上、下、左、右）测量环的厚度。计算每个独立环的平均厚度值（t），并利用该值计算横截面积（2π(t/2)²）。

4. 环形试件的力学测试

将拉伸试验机（Instron EPS 1000）置于水平位置。安装一个1N ±1mN的载荷传感器和定制的细丝夹具（通过弯曲不锈钢丝制成）。

将环形样品安装在两根细金属丝夹具上。拉伸夹具直至样品上施加了5 mN的去皮载荷。输入横截面积（根据厚度测量值计算得出），并记录标距长度。

在零载荷与50 kPa应力之间以10 mm/min的速率对环形试样进行8次预循环。第八次预循环结束后，以10 mm/min的速率拉伸至断裂。断裂定义为相邻两次测量之间载荷下降40%。对于每个环形试样，测量其极限抗拉应力（UTS）和断裂应变，并根据采集的数据计算最大切线模量（MTM）。

5. 组织环组装以构建组织管

使用直径为5 cm的聚碳酸酯圆盘加工定制试管架，圆盘上设有矩形切口（2 cm × 3 cm）。在这些圆盘上钻出带螺纹的孔，以便将两个支架旋紧固定在一起。将定制试管架进行高压灭菌，然后转移至生物安全柜中，放入一个空的培养皿内。

使用手术剪将直径为1.9 mm的硅胶管两端以一定角度剪切，形成斜面边缘，然后对硅胶管进行高压灭菌。在硅胶管灭菌的同时，向培养皿中加入培养基。

从琼脂糖小孔中取出环状物，并将其放入含有培养基的培养皿中。将经高压灭菌的硅胶管也放入同一培养皿中，以润湿备用。

使用镊子将硅胶管的斜面端插入环的中心，然后轻轻将环滑入硅胶管上。重复此操作，直至获得所需数量的环。通过沿管子两个方向依次轻推，使各环相互接触。该方法适用于仅培养一天后收获的环。

安装好环状支架后，将硅胶管对齐置于聚碳酸酯支架内，并将支架的两部分拧紧固定。将支架放入100 mm的培养皿中，加入55 mL培养基。在整个培养期间，每3天更换一次培养基。

为移除组织管，需先将硅胶管从聚碳酸酯支架上取下，然后用镊子将组织管从硅胶管上滑下，放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。

6. 代表性结果：

当正确执行该方案时，细胞会在24小时内聚集形成组织环，其内径等于相应模具柱的直径。组织环的边缘通常外观光滑，且（若在水平表面上培养）在整个圆周上厚度均匀。这些组织环易于操作，可从培养孔中取出，用于后续的力学和组织学分析（参见 Gwyther et al., 2011⁸）。组织环的形态、基质成分以及力学特性会因接种细胞的数量和类型而异。

表1展示了由不同细胞类型、接种条件和培养时间制备的组织环的代表性结果。由5×10⁵个rSMCs形成的2 mm内径组织环，其极限抗张强度（UTS）高于我们先前报道的由6.6×10⁵个rSMCs制备的2 mm组织环⁸。与大鼠细胞类似，人源平滑肌细胞（hSMC）可迅速聚集形成组织环，在培养仅14天后即含有大量胶原（数据未显示）。人源间充质干细胞（hMSC）也能聚集并形成结构完整的环状组织，但缺乏足够的机械强度，在单轴拉伸测试的初始预循环阶段即发生断裂。

	n	细胞数量	厚度（mm）	培养时间（天）	UTS（kPa）	MTM（kPa）	断裂应变（mm/mm）
rSMC 环	6	660,000	0.94±0.12	14	97±30	497±91	0.50±0.08
rSMC 环	4	500,000	0.53±0.02	7	113±8	189±15	0.88±0.05
hSMC 环	3	750,000	0.51±0.05	14	160±30	270±20	0.92±0.08
hMSC 环	3	750,000	0.40±0.07	14	N/A	N/A	N/A

表1。显示由不同细胞类型、接种浓度和培养时间生成的2 mm环的培养参数和力学性能的表格。

图1. （A）组织环生成过程示意图。（B）定制的聚碳酸酯模具，带有铣削加工的环形孔，中心柱直径为2 mm。（C）从聚碳酸酯模具上剥离后的PDMS模板。（D）在带有2 mm中心柱的琼脂糖模具中培养的聚集性组织环。（E）置于PBS中的2 mm直径组织环。比例尺 = 6 mm（B、C），2 mm（D、E）。

图 2. 单轴拉伸试验获得的典型应力-应变曲线图。

讨论

近年来，人们对基于细胞或“无支架”的组织工程技术产生了日益增长的兴趣，以解决基于支架的组织工程方法存在的一些局限性。由于细胞来源的组织由细胞及其产生的基质构成，因此其本身具有更高的细胞密度，不含外源性材料，并且可以完全由人源细胞和蛋白质制成。由人源细胞制备的血管移植物在无外源性支架的情况下即可获得显著的机械强度（例如，爆破压力可达3400 mmHg，而人隐静脉为1600 mmHg）¹²。尽管基于细胞的血管组织在细胞密度和机械强度方面表现更优，但目前大多数制备方法（如“基于片层的工程化”^3,4,12 或“生物打印”^5,13）需要漫长的培养周期（>3个月）或用于构建三维组织的专用设备。本文所述的细胞来源组织环方法能够在短时间内无需专用设备的情况下，实现细胞快速自组装，形成坚固的三维组织结构。

本方案详细描述了我们开发的用于制备内径为2 mm的大鼠平滑肌细胞来源组织环的方法。在本示例中，组织环培养了7天（随后再额外培养7天以实现环融合和管状结构形成）。然而，大鼠（以及人类）平滑肌细胞形成的2 mm组织环在接种细胞后仅一天即可从孔中取出，且已具备足够的结构完整性，可用于操作（例如转移至硅胶管上）。此外，通过简单改变原始聚碳酸酯模具中柱体的直径，利用该方法还可制备具有不同内径（2、4和6 mm）的结构完整的组织环⁸。我们最近还改进了聚碳酸酯模具的设计，使单个多孔琼脂糖腔室中可一次性浇铸五个2 mm的接种孔，该设计减少了聚二甲基硅氧烷（PDMS）和琼脂糖的用量，并可完全容纳于6孔板中的一个孔内（数据未显示）。通过修改聚碳酸酯模具的计算机辅助设计（CAD）文件参数，可轻松调整柱体直径、接种孔宽度、圆底曲率半径、接种孔数量或接种孔深度等各项参数。最后，单个聚碳酸酯模具可用于制备数量不受限制的PDMS模板，每个PDMS模板均可清洗、高压灭菌并重复使用数十次。

除了改变组织环的大小外，我们还利用多种不同类型的细胞制备了组织环，包括：原代大鼠平滑肌细胞（Cell Applications，R354-05）、原代人冠状动脉平滑肌细胞（Lonza，CC-2583）、原代人皮肤成纤维细胞¹¹（由伍斯特理工学院生物医学工程系George Pins博士慷慨提供）、大鼠肺成纤维细胞（RFL-6，ATCC CCL-192）以及间充质干细胞（Lonza，PT-2501）。上述每种细胞类型均能围绕中心支柱聚集并收缩，形成组织环；但不同细胞类型所形成的构建物在细胞排列方式、细胞外基质（ECM）组成及力学性能方面存在差异。每种细胞类型的接种参数需根据细胞大小及其聚集能力通过实验经验确定。因此，尽管这种细胞来源的组织环制备系统具有极高的通用性，但在使用不同细胞类型时，该方案可能需要进行轻微调整，以实现最佳的组织形成效果。

组织环几何结构便于通过单轴拉伸试验轻松加载并评估组织材料的力学特性，如上所述。此外，使用血管环段测量血管收缩及生理功能已有大量先例。初步研究表明，细胞来源的组织环可安装于丝状肌动描记装置上，用于测定其药理反应性及收缩力生成能力（数据未显示）。总体而言，快速制备自组装细胞环以进行组织学、力学、生理学和生物化学分析的能力，提示这一技术可能成为研究健康与疾病状态下血管组织结构与功能的有力新工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	道康宁公司	Sylgard 184
琼脂糖	龙沙公司	50000
DMEM 培养基	美迪泰克公司	15-017-CV
胎牛血清（FBS）	PAA 实验室	A05-201
青霉素/链霉素	美迪泰克公司	30-002-CI
数字成像系统	DVT 公司	Model 630
单轴测试仪	Instron 公司	ElectroPuls E1000
边缘检测软件	DVT 公司	Framework 2.4.6