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方法文章

视网膜切片的形态计量分析

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DOI：

10.3791/3377

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2012年2月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Department of Anatomy, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Research Centre of Heart, Brain, Hormone and Healthy Aging, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 3State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences, The University of Hong Kong

本文内容

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摘要

本视频展示了三种视网膜形态计量学分析方法，包括测量内核层厚度、定量视网膜神经节细胞（RGCs）数量以及测量RGCs的大小。该技术可为形态计量学分析提供一种简单而科学的平台。

摘要

视网膜切片的形态计量分析已被用于研究视网膜疾病。例如，在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的兴奋性毒性1、视网膜缺血-再灌注损伤2和青光眼3的大鼠模型中，视网膜神经节细胞层（RGCL）中的神经元细胞显著丢失。在经海人酸介导的谷氨酸兴奋性毒性大鼠眼中，胞二磷胆碱治疗可逆转内核层（INL）和内丛状层（IPL）厚度的减少4。在眼内压升高的眼中，不同药物治疗可观察到视网膜神经节细胞密度和胞体大小的改变3,5,6。因此，建立客观的视网膜形态计量分析方法，对于评估视网膜病理变化及治疗策略的有效性具有重要意义。

视网膜结构具有多层，视网膜中存在多种不同类型的神经元。视网膜的形态计量参数，如细胞数量、细胞大小以及各层厚度，比细胞培养系统更为复杂。早期，这些参数可借助其他商业成像软件进行检测。然而，所得数值通常为相对值，若需转换为精确数值，则可能需要进一步的准确计算。此外，细胞大小和形态的追踪在统计分析中可能不够准确和敏感，尤其是在慢性青光眼模型中。本方案所采用的测量方法提供了一种更精确且简便的操作方式，可直接报告线段的绝对长度和细胞的大小，并易于复制到其他文件中。例如，我们追踪内核层（INL）中最内侧和最外侧细胞核的边界形成一条线，然后利用软件绘制一个90度角以测量厚度。若无软件辅助，该线可能呈斜向，导致不同观察者之间视网膜厚度的变化无法重复。此外，还可对视网膜神经节细胞（RGCs）的数量和密度进行定量分析。本方案成功降低了视网膜特征定量过程中的变异性，提高了检测微小变化的敏感性。

本视频将演示视网膜切片的三种形态计量学分析方法，包括测量内核层（INL）厚度、定量视网膜神经节细胞（RGC）的数量，以及以绝对值测量RGC的大小。这三种分析均使用Stereo Investigator软件（MBF Bioscience — MicroBrightField, Inc.）完成。该技术可为形态计量学分析提供一个简便而科学的平台。

方案

1. 工具

显微镜，Nikon

Stereo Investigator，MBF Bioscience – MicroBrightField, Inc.

2. 准备

  1. 在进行任何形态计量分析之前，每份视网膜样本需切成4微米厚度，并进行苏木精-伊红（H&E）染色。
  2. 将视网膜切片分为4个区域——上方周边区域、上方中央区域、下方周边区域和下方中央区域。
  3. 确定区域后，在尼康明场显微镜下以10×40倍放大倍数获取每个区域的图像。
  4. 现在，我们即可开始分析视网膜的形态计量学参数。

3. 测量内核层厚度

  1. 在每个区域测量四次内核层（INL）厚度。每条测量线将从轮廓基线垂直延伸至内核层（INL）的外边界。
  2. 打开名为 Stereo Investigator 的软件，并从主工具栏中选择 40x 镜头。
  3. 在“文件”选项卡下选择“图像打开”。选择一张您希望分析的视网膜区域图像。
  4. 从主工具栏的下拉列表框中选择轮廓线类型，然后按下“自动移动”按钮。
  5. 在追踪窗口中右键单击，选择“简单点击追踪”。
  6. 沿内核层（INL）的内边界绘制轮廓线。
  7. 绘制完成后，在追踪窗口中右键单击并选择“结束开放轮廓”。
  8. 在标记工具栏中选择一种标记，并在连接点处添加标记。
  9. 添加完所有标记后，取消选中标记工具栏中的标记图标。
  10. 将光标定位在其中一个标记的中心位置。

静态平衡分析；显微镜图像带光标；细胞结构定位；研究工具。

  1. 在“工具”选项卡下选择“快速测量角度”。

组织学图像分析软件中显示角度测量的显微镜界面。

  1. 在追踪窗口中右键单击，并取消选中“连续”选项。
  2. 测量角度时，首先单击标记点中心位置，该标记点应紧邻已选作线段端点的标记。

组织学分析，显微镜图像，软件界面，细胞测量，数字病理学。

  1. 然后，将鼠标移动到目标标记的中心位置，再次点击。
  2. 将橡皮带线延伸至内核层（INL）的外边界。
  3. 调整角度直至达到 90°。

显微镜图像分析；神经元测量；立体观测仪；角度计算；研究工具。

  1. 在所需位置单击鼠标左键。单击后将立即弹出显示角度测量值的对话框。
  2. 按“Enter”键，同时保持鼠标不动。

使用数字显微镜软件进行组织学切片分析，展示体视学测量过程。

  1. 单击追踪窗口，使线条从一端绘制到新选定的端点。
  2. 在追踪窗口中右键单击，并选择“结束开放轮廓”。

显微图像分析，Stereo Investigator 软件，轮廓追踪示意图。

  1. 以与之前所述完全相同的方式，在不同位置绘制其余的线条。
  2. 完成所有线条绘制后，选择编辑模式，并相应地重命名4个线段。
  3. 通过点击“轮廓测量”按钮，可获得四项测量数据。
  4. 选择这四项测量数据，然后点击“复制到剪贴板”将其粘贴至电子表格中。
  5. 在“文件”选项卡下选择“另存为”，可将描记数据保存为数据文件。

4. 视网膜神经节细胞数量的定量分析

  1. 在“文件”选项卡下选择“打开图像”。选择一张您希望分析的视网膜区域图像。
  2. 从主工具栏的下拉列表框中选择轮廓线类型。
  3. 沿神经纤维层（NFL）的边界绘制一条轮廓线。
  4. 使用“结束开放轮廓”选项结束追踪。
  5. 在每一端，于线的尖端处添加一个标记，并在靠近尖端的位置再添加一个标记。
  6. 取消选择标记工具栏中的标记图标。
  7. 将光标定位在尖端标记的中心位置。
  8. 在“工具”选项卡下选择“快速测量角度”。
  9. 在追踪窗口中右键单击，并取消选中“连续”选项。
  10. 调整橡皮筋线，测量出 90° 的角度。
  11. 当弹出对话框后，按下“Enter”键。
  12. 左键单击追踪窗口，使一条新线能够从尖端垂直延伸。
  13. 以完全相同的方式在另一端绘制另一条新线。
  14. 由此创建两条边界，在此范围内的RGC数量将被计数。
  15. 选择其中一条边界作为排除线，任何接触该线的细胞不计入总数。
  16. 选择一种标记类型，并为每个活细胞添加一个标记。
  17. 为死亡细胞选择另一种类型的标记。
  18. 所放置的每种类型标记的数量将相应地显示在标记工具栏的标记图标旁。
  19. 选择编辑模式并拾取轮廓基线。在追踪窗口中右键单击并重命名该线。
  20. 通过点击“轮廓测量”按钮可获得轮廓基线的长度。
  21. 随后可将细胞数量表示为每毫米长度上的数目。
  22. 在“文件”选项卡下选择“另存为”。追踪数据和标记数据可保存为一个数据文件。

5. 测量视网膜神经节细胞的细胞大小

  1. 在“文件”选项卡下选择“图像打开”。选择一张您希望分析的视网膜区域的图像。
  2. 放大活细胞，并从主工具栏的下拉列表框中选择轮廓线类型。
  3. 沿细胞的周长绘制轮廓线。
  4. 接近结束时，右键单击轨迹窗口并选择“结束闭合轮廓”。
  5. 细胞的面积将在轮廓测量对话框的“面积”项下列出。

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讨论

1. 如何获得更精确的厚度测量结果？

单击“放大”按钮并在追踪窗口中左键单击，可以放大图像。此时可清晰看到内核层（INL）的边界。如果线条的端点未对准内核层（INL）的外边界，可在编辑模式下调整该线条。选择目标线条后，右键单击追踪窗口，选择“在选定轮廓中插入点”，在边界外侧添加一个新点，且该点应位于同一直线上。随后删除原始点，即可获得一条长度更准确的线段。

2. 如何保持橡皮筋呈90°角？

当显示角度的对话框弹出后，您必须在按“Enter”键的同时保持鼠标静止。然后，单击追踪窗口，以便绘制一条新线。

3. 活细胞与死细胞的形态有何不同？

形态大致呈圆形、细胞质和细胞核清晰可见的细胞被视为存活的视网膜神经节细胞（RGCs）；而相对较小且致密的细胞则被视为死亡细胞。

4. 本实验方案中，这些视网膜样本已进行H&E染...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本实验室的眼科研究工作得到美国健康助手基金会、杜鹃花（1972）基金以及香港大学小型项目基金（20097176185）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
立体学分析系统MicroBright Field
显微镜Olympus CorporationBX51

参考文献

  1. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
  2. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
  3. Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
  4. Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
  5. Hernandez, M., Urcola, J. H. Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments. Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).
  6. Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

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