Method Article

视网膜节的形态分析

DOI:

10.3791/3377

⸱

February 19th, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Department of Anatomy, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Research Centre of Heart, Brain, Hormone and Healthy Aging, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 3State Key Laboratory of Brain and Cognitive Sciences, The University of Hong Kong

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该视频演示了三种类型，其中包括视网膜内的核层厚度测量，定量视网膜神经节细胞（RGCs）的数量，并测量视网膜神经节细胞的大小，形态分析。该技术可以提供一个简单，但科学的形态分析的平台。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已被用于检查视网膜疾病视网膜节的形态分析。举例来说，神经细胞均显着失去了在大鼠模型中视网膜神经节细胞层（RGCL）与N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体诱导的兴奋1，视网膜缺血再灌注损伤的2和3青光眼。 INL和内网状层（IPL），厚度减少了与胞二磷胆碱治疗老鼠的眼睛红藻酸介导的谷氨酸4逆转。修改RGC的密度和体躯大小不同的药物治疗，升高眼内压3,5,6眼睛观察。因此，有客观分析视网膜morphometries的方法可能是在评价视网膜病变和治疗策略的有效性具有十分重要的意义。

视网膜结构是多层次和几种不同类型的神经元EXIST在视网膜上。视网膜细胞数量，细胞的大小和不同层的厚度，如形态参数是比细胞培养系统更复杂。在早期，这些参数可以使用其他的商业成像软件检测。该值通常是相对值，和不断变化的精确值，可能需要进一步的精确计算。此外，细胞大小和形态的跟踪可能不准确，灵敏的统计分析不够，特别是在慢性青光眼模型。在本协议所使用的测量提供了一个更精确和更容易的方式。与细胞的大小和行的绝对长度可以直接和容易被复制到其他文件。例如，我们追踪内层和最外层的INL在核边缘，形成一条线，然后使用该软件绘制成90度角来衡量的厚度。虽然没有软件的帮助，也许斜行和视网膜厚度的变化可能个别观察员之间不重复的。此外，视网膜神经节细胞的数量和密度也可以量化。该协议成功的减少在定量的视网膜功能的变异，增加检测微小变化的敏感性。

这部影片将展示三种类型的视网膜节的形态分析。它们包括测量的INL厚度，定量视网膜神经节细胞的数量和绝对值测量视网膜神经节细胞的大小。这三种分析进行与立体声调查（医疗保险基金生命科学 - 公司MicroBrightField）。该技术可以提供一个简单，但科学的形态分析的平台。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。工具

显微镜，尼康

立体声调查，医疗保险基金的生物科技公司 - MicroBrightField

2。准备

  1. 任何形态分析工作之前，每个视网膜样本是在4微米厚的切片，经过H＆E染色。
  2. 视网膜节分为4个区域 - 上周边地区，中部地区上，较低的周边地区，中部地区较低。
  3. 后定义的区域，每个区域的图像尼康明亮的光束显微镜10x40倍率下获得。
  4. 现在，我们已经准备好来分析视网膜的形态。

3。 INL的厚度测量

  1. 四，在每个地区的INL厚度的测量，测量。四行将来自轮廓基线垂直的INL的外部边界。
  2. 打开称为立体声调查软件，并选择从主工具栏的40X镜头。
  3. 选择"文件"选项卡下的"图片打开"。选择所需的视网膜区域，你想分析的图像。
  4. 从主工具栏的下拉列表框中选择轮廓线的类型，并按下"自动移动"按钮。
  5. 在跟踪窗口中右键单击，选择"简单的点击跟踪"。
  6. 沿边境的INL内绘制的等高线。
  7. 当绘制完成后，在跟踪窗口右击并选择"结束开放轮廓"。
  8. 选择一个标记"工具栏上的标记，并在交接点添加标记。
  9. 后加入所有的标记，在标记栏取消标记图标。
  10. 游标放置在中心的标志之一。

figure-protocol-1

  1. 选择"快速测量角度"下的"工具"选项卡。

figure-protocol-2

  1. 在跟踪窗口中单击右键，取消选择"连续"选项。
  2. 首先标记的中心，这是相邻线段结束选定的标记来衡量一个角度。

figure-protocol-3

  1. 然后，将鼠标移动到中心有关的标记，并再次单击。
  2. 延长橡皮筋线的INL的外部边界。
  3. 调整角度，直到达到90°。

figure-protocol-4

  1. 留在单击所需的位置。角度测量显示一个对话框会弹出后点击。
  2. 按"Enter"键，同时按住鼠标仍然。

figure-protocol-5

  1. 左键点击跟踪窗口，使绘制一条线，从一端到新选定的结束。
  2. 在跟踪窗口中右键单击并选择"结束开放轮廓"。

figure-protocol-6

  1. 在完全相同的方式如前所述，绘制在不同位置的其他线路。
  2. 画线后，选择"编辑"模式，并相应地重命名4线段。
  3. 按"轮廓测量"按钮，可以得到四个测量。
  4. 选择这4个测量通过点击"复制到剪贴板并粘贴到电子表格。
  5. 选择"另存为"选项卡下的"文件"。跟踪数据可以保存为一个数据文件。

  1. 选择"文件"选项卡下的"图片打开"。选择所需的视网膜区域，你想分析的图像。
  2. 选择轮廓线从主工具栏的下拉列表框的类型。
  3. 沿神经纤维层（NFL）的边界绘制的等高线。
  4. 结束追查选项"年底开放轮廓"。
  5. 在每年年底，添加一个标记线的一角，并在尖端附近的位置。
  6. 取消标记"工具栏上的标记图标。
  7. 将光标定位在尖端标志的中心。
  8. 选择"工具"选项卡下的"快速测角"。
  9. 在跟踪窗口中单击右键，取消选择"连续"选项。
  10. 调整橡皮筋线，并测量90°角。
  11. 按"Enter"键后，弹出一个对话框。
  12. 左点击ţ他跟踪窗口，使一个新的线可以垂直尖端延长。
  13. 画出另一个新生产线的另一端​​，在完全相同的方式。
  14. 创建两个边界内的视网膜神经节细胞的数量计算。
  15. 选择一个边界为排除细胞接触不计入。
  16. 选择一个标记类型和重视每一个活细胞。
  17. 选择死细胞类型的另一个标志。
  18. 各类型放置标记的数量将相应标记工具栏旁边的标记图标显示。
  19. 选择编辑模式，并拿起轮廓基线。右键单击在跟踪窗口和重命名行。
  20. 轮廓基线的长度可以按"等​​高线测量"按钮。
  21. 细胞的数量，然后可以表示每毫米的长度。
  22. 选择"另存为"选项卡下的"文件"。 "跟踪和标记数据可以保存为一个数据文件。

5。测量的研资局的细胞的细胞大小

  1. 选择"文件"选项卡下的"图片打开"。选择所需的视网膜区域，你想分析的图像。
  2. 在活细胞中的变焦和选择的轮廓线，从主工具栏的下拉列表框的类型。
  3. 沿细胞周长绘制的等高线。
  4. 在大约最后，右击跟踪窗口，并选择"结束接近轮廓"。
  5. 细胞的面积将显示在项目区的轮廓测量对话框。

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Discussion

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1。如何获得更精确​​的厚度测量？

您可以放大图像，通过点击"放大"按钮，并留在跟踪窗口点击。 INL的边界可以清楚地看到。如果线的一角，是不是在外部边界的INL的，我们可以调整行的编辑模式下。有关行采摘后，右击跟踪窗口，选择"插入点在选定的轮廓"。有一点可以添加外部边界，而加点应该是在同一直线上。然后，你必须删除原有的点和线可以得到一个更精确的长度。

2。如何保持90°的橡皮筋线？

之后会弹出一个对话框显示的程度，你必须仍然按住鼠标的同时按下"Enter"键。然后，左单击跟踪窗口，可以得出这样一个新行。

3。怎样活细胞和死çELLS的样子吗？

在大致圆形，细胞质和细胞核清楚地观察到这些细胞被认为是活的视网膜神经节细胞。那些可比小和简明的细胞被认为是死细胞。

4。那些视网膜标本进行染色，H＆E在当前协议。这是可以测量荧光染...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

眼科研究在本实验室工作的支持，杜鹃（1972）美国卫生署助理基金会，捐赠基金，香港大学专业进修学院的小项目基金（20097176185）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
试剂名称 类型 公司 目录编号
立体声调查医疗保险基金生命科学分析软件 MicroBright场
显微镜奥林巴斯BX51 奥林巴斯公司 BX51

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
  2. Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).
  3. Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).
  4. Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats. Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).
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  6. Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

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Tags

Retinal MorphometryInner Nuclear Layer ThicknessRetinal Ganglion Cell CountRetinal Ganglion Cell SizeStereo Investigator SoftwareImage Analysis ProtocolBrightfield MicroscopyH E StainingRetinal Layer TracingCell Morphometry Measurement

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