本视频展示了三种视网膜形态计量学分析方法，包括测量内核层厚度、定量视网膜神经节细胞（RGCs）数量以及测量RGCs的大小。该技术可为形态计量学分析提供一种简单而科学的平台。
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摘要
摘要
视网膜切片的形态计量分析已被用于研究视网膜疾病。例如，在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的兴奋性毒性1、视网膜缺血-再灌注损伤2和青光眼3的大鼠模型中，视网膜神经节细胞层（RGCL）中的神经元细胞显著丢失。在经海人酸介导的谷氨酸兴奋性毒性大鼠眼中，胞二磷胆碱治疗可逆转内核层（INL）和内丛状层（IPL）厚度的减少4。在眼内压升高的眼中，不同药物治疗可观察到视网膜神经节细胞密度和胞体大小的改变3,5,6。因此，建立客观的视网膜形态计量分析方法，对于评估视网膜病理变化及治疗策略的有效性具有重要意义。
视网膜结构具有多层，视网膜中存在多种不同类型的神经元。视网膜的形态计量参数，如细胞数量、细胞大小以及各层厚度，比细胞培养系统更为复杂。早期，这些参数可借助其他商业成像软件进行检测。然而，所得数值通常为相对值，若需转换为精确数值，则可能需要进一步的准确计算。此外，细胞大小和形态的追踪在统计分析中可能不够准确和敏感，尤其是在慢性青光眼模型中。本方案所采用的测量方法提供了一种更精确且简便的操作方式，可直接报告线段的绝对长度和细胞的大小，并易于复制到其他文件中。例如，我们追踪内核层（INL）中最内侧和最外侧细胞核的边界形成一条线，然后利用软件绘制一个90度角以测量厚度。若无软件辅助，该线可能呈斜向，导致不同观察者之间视网膜厚度的变化无法重复。此外，还可对视网膜神经节细胞（RGCs）的数量和密度进行定量分析。本方案成功降低了视网膜特征定量过程中的变异性，提高了检测微小变化的敏感性。
本视频将演示视网膜切片的三种形态计量学分析方法，包括测量内核层（INL）厚度、定量视网膜神经节细胞（RGC）的数量，以及以绝对值测量RGC的大小。这三种分析均使用Stereo Investigator软件（MBF Bioscience — MicroBrightField, Inc.）完成。该技术可为形态计量学分析提供一个简便而科学的平台。
方案
1. 工具
显微镜，Nikon
Stereo Investigator，MBF Bioscience – MicroBrightField, Inc.
2. 准备
- 在进行任何形态计量分析之前，每份视网膜样本需切成4微米厚度，并进行苏木精-伊红（H&E）染色。
- 将视网膜切片分为4个区域——上方周边区域、上方中央区域、下方周边区域和下方中央区域。
- 确定区域后，在尼康明场显微镜下以10×40倍放大倍数获取每个区域的图像。
- 现在，我们即可开始分析视网膜的形态计量学参数。
3. 测量内核层厚度
- 在每个区域测量四次内核层（INL）厚度。每条测量线将从轮廓基线垂直延伸至内核层（INL）的外边界。
- 打开名为 Stereo Investigator 的软件，并从主工具栏中选择 40x 镜头。
- 在“文件”选项卡下选择“图像打开”。选择一张您希望分析的视网膜区域图像。
- 从主工具栏的下拉列表框中选择轮廓线类型，然后按下“自动移动”按钮。
- 在追踪窗口中右键单击，选择“简单点击追踪”。
- 沿内核层（INL）....
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讨论
1. 如何获得更精确的厚度测量结果？
单击“放大”按钮并在追踪窗口中左键单击，可以放大图像。此时可清晰看到内核层（INL）的边界。如果线条的端点未对准内核层（INL）的外边界，可在编辑模式下调整该线条。选择目标线条后，右键单击追踪窗口，选择“在选定轮廓中插入点”，在边界外侧添加一个新点，且该点应位于同一直线上。随后删除原始点，即可获得一条长度更准确的线段。
2. 如何保持橡皮筋呈90°角？
当显示角度的对话框弹出后，您必须在按“Enter”键的同时保持鼠标静止。然后，单击追踪窗口，以便绘制一条新线。
3. 活细胞与死细胞的形态有何不同？
形态大致呈圆形、细胞质和细胞核清晰可见的细胞被视为存活的视网膜神经节细胞（RGCs）；而相对较小且致密的细胞则被视为死亡细胞。
4. 本实验方案中，这些视网膜样本已进行H&E染.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本实验室的眼科研究工作得到美国健康助手基金会、杜鹃花（1972）基金以及香港大学小型项目基金（20097176185）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体学分析系统 | MicroBright Field | ||
| 显微镜 | Olympus Corporation | BX51 |
参考文献
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)–Induced Apoptosis in Rat Retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).
- Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. Apopto....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
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