颅面间充质细胞的电穿孔

摘要

颅面软骨在发育过程中与其他组织紧密接触，在活体动物中难以进行操作。我们正在利用电穿孔技术在颅面骨骼生长过程中递送分子工具，同时避免早期胚胎效应。该方法将使我们能够高效地验证候选分子 体内

摘要

电穿孔是一种在精确的时间点和特定位置将DNA及其他带电大分子高效导入组织的有效方法。例如，电穿孔已被成功用于研究神经和视网膜发育 非洲爪蟾，鸡和小鼠 ^1-10然而，需要注意的是，在所有这些研究中，研究人员并未以软组织为靶标。由于我们关注颅面发育，因此我们改进了一种方法以靶向面部间充质。

在查阅文献时，我们惊讶地发现，有关成功将基因转入软骨组织的报道极少。这些研究大多属于基因治疗领域，例如将siRNA或蛋白质递送至软骨细胞系，或应用于关节炎动物模型^11-13。在其他系统（如鸡或小鼠）中，对面部间充质进行电穿孔操作一直具有挑战性（个人通讯，伦敦国王学院颅面发育系）。我们推测，在Xenopus的前软骨及软骨组织中进行电穿孔可能效果更佳。在我们的研究中，我们发现，在发育早期阶段（28期），当面部原基仍由软组织构成、尚未发生软骨分化时，基因可高效转入面部软骨组织。

非洲爪蟾 是研究颅面发育的一个非常易于操作的脊椎动物体系。颅面结构在其中更易于观察 非洲爪蟾 比其他任何脊椎动物模型都更为显著，主要原因是 非洲爪蟾 胚胎体外受精，便于分析最早期的发育阶段，并支持以单细胞分辨率进行活体成像，同时可重复利用母体 ¹⁴在体外发育的脊椎动物模型中， 非洲爪蟾 在颅面部分析方面，比斑马鱼更有用，因为 非洲爪蟾 幼虫体型更大，更易于解剖，且面部发育区域比鱼类相应区域更便于成像。此外 非洲爪蟾 在进化上比斑马鱼更接近人类˜1亿年更近 ¹⁵最后，在这些阶段， 非洲爪蟾 蝌蚪具有透明性，同时表达荧光蛋白或分子可便于直观观察发育中的软骨。我们预期该方法将使我们能够快速高效地在活体中检测候选分子 体内 模型系统。

方案

第1A部分. 仪器设备

显微镜：配备低倍物镜的直立式体视解剖显微镜

• 电压/脉冲发生器： BTX ECM 830 方波电穿孔系统
• 拉针仪： P-87 微电极拉制仪（Sutter Instrument Company, CA）
• 操纵器： 粗调，或根据实验准备情况选用兼具粗调和微调功能的操纵器。
• 微电极夹持器： Fine Science Tools
• 电极： 自制
• 电穿孔室： 自制

L 形电极：

1. 剪取8 cm长的高纯度0.4 mm钨丝（Goodfellow），使用橡皮泥（我们使用Blu-Tack）在其中点固定一个1 ml注射器。使钨丝从注射器尖端露出4 cm，并在距末端1 cm处将尖端弯成L形（图1A）。
2. 修整尖端，使其末端长度为0.5 mm。此尖端即为电极终端。
3. 将多余的钨丝沿注射器平行引出，用于连接电脉冲发生器。
4. 重复上述步骤，制备一对电极。
5. 通过直流电缆将电极连接至方波脉冲发生器。

电穿孔室

1. 用约 5 mm 的无毒黏土铺满 90 mm 培养皿底部。
2. 向培养皿中加入电穿孔介质。
3. 使用 5 号钟表匠镊子雕刻出 T 形凹槽（图 2）。长槽尺寸约为 2 mm × 2 mm × 10 mm，短槽约为 2 mm × 2 mm × 5 mm。电穿孔培养皿可清洗后重复使用。

第1B部分. 试剂

DNA 或带电大分子

• 微量移液器：1 mm 宽、4 英寸长的硼硅酸盐玻璃毛细管（WPI，TW100-F）
• 培养基：正常两栖类培养基（NAM）
• >10 X 储存液：1100 mM NaCl，20 mM KCl，10 mM Ca(NO₃)₂•4H₂O，1 mM EDTA。
  • 高压灭菌后于 4 °C 保存。
  • 1 X NAM：由 10x 储存液稀释而成，用 0.1 mM NaHCO₃ 和 0.2 mM Na₃PO₄ 缓冲。
• Xenopus laevis 蝌蚪，28 期

DNA 制备：

1. 使用标准方案制备表达质粒。
2. 用无核酸酶的 H₂O 将 DNA 重悬至终浓度为 1 μg/μl。

* 我们在使用含有强CMV启动子的载体（如pCS2+ [16]）时已获得成功。进行谱系分析时，我们通常加入编码绿色荧光蛋白的DNA（pCS2+GFP），终浓度为0.1 μg/μl。[我们还测试了0.1–3 μg/μl范围内的DNA浓度。发现低于0.8 μg/μl的浓度标记细胞效率较低，而高于2 μg/μl的DNA浓度并不能提高电穿孔效率。]

吗啉代寡核苷酸制备：

（注意：MOs 需要进行荧光素标记（3'-羧基荧光素修饰）或其他带电修饰。）

1. 将吗啉寡核苷酸（MOs）（Genetools，www.genetools.com）用无核酸酶的 H₂O 溶解，配制成 2 mM 的储存液。
2. 将储存液分装后于 65°C 加热 5 分钟。
3. 用无核酸酶水稀释至终浓度为 0.5 mM。

* 测试了 0.1–1 mM MO 溶液。0.5 mM MO 溶液已足以对多种间充质细胞进行电穿孔。

微量移液器

1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（直径1 mm，长4英寸，WPI编号TW100-F）制备微电极。用拉针仪制备具有8–12 mm长锥形部分和尖细末端的微电极。
2. 用镊子从尖端起约2 mm处夹碎尖端，形成锯齿状断裂。

培养基

1. 孵育培养基：用1x储存液配制新鲜的3/4正常两栖类培养基（NAM），加入0.025 mg/ml的庆大霉素。
2. 电穿孔培养基：配制方法同上，加入0.1%苯佐卡因（Benzocaine，Sigma，06950）。

2. 电穿孔

微量移液器设置

1. 用微量移液器吸取约 1 μl 注射溶液。
2. 将微量移液器固定在显微操作仪上，并连接至显微注射仪（Picospritzer II）。
3. 将微量移液器与桌面呈 50° 角放置。
4. 设定注射压力为 20 PSI。
5. 校准微量移液器，使每次脉冲注射量为 30 nl。

蝌蚪制备

1. 将28期的Xenopus幼体置于电穿孔培养基中孵育5分钟，以进行麻醉。
2. 将已麻醉的蝌蚪转移至盛有电穿孔培养基的电穿孔室中。将胚胎置于长槽内，使头部位于T型连接处，背侧朝下，腹侧暴露。头部应略高于尾部。
3. 使用镊子，用周围的塑泥轻轻固定蝌蚪。注意：若蝌蚪未被固定，其可能在电穿孔过程中抽搐并接触电极，此时应弃用该蝌蚪，因其面部组织将受到严重损伤。

电穿孔

1. 将微量移液器尖端插入胶腺后方并进入面部间充质。
2. 向间充质中注射 30 nl 溶液。
3. 撤回微量移液器。
4. 迅速将电极尖端与胚胎头部平行对齐（图 3）。
5. 施加 8 次 50 ms、20 V 的方波脉冲。
6. 撤回电极。
7. 用镊子小心地将蝌蚪从孔中释放，并转移至 3/4 NAM、0.025 mg/ml 庆大霉素中。
8. 蝌蚪可在 3/4 NAM、0.025 mg/ml 庆大霉素中孵育过夜或更长时间。
9. 24 小时后通过荧光显微镜筛选电转效率高的胚胎。

3. 代表性结果：

使用荧光分子可方便地筛选电穿孔的胚胎。图4显示了在14.5°C下孵育的、电穿孔后约12小时、48小时和96小时的典型MO电穿孔蝌蚪群体。通过荧光显微镜观察，可在电穿孔后立即检测到MO信号，且该信号在电穿孔后数天内持续存在。根据我们的经验，荧光在46期（约5天后）仍可微弱观察到。在软骨组织中，荧光在分化开始后（约42期）显著减弱；然而，在咽部内胚层等其他细胞类型中，MO荧光仍保持较强信号。荧光显微镜显示，寡核苷酸被整合至包括软骨在内的多种颅面组织中。寡核苷酸的荧光信号常可在头部两侧的组织中观察到，这可能是由于注射液在电穿孔前迅速扩散至疏松的颅面间充质所致。

图 1 自制电极。将L形钨丝使用无毒黏土或橡皮泥固定在1 ml注射器上。（A）电极末端长度为5 mm。（B）成对安装电极，使末端相互平行。通过直流电缆将电极连接至脉冲发生器。

图 2 电穿孔腔室。（A）在直径90 mm的培养皿中用黏土衬底，加入培养液，并用5号钟表镊雕刻出T形腔室。（B）长臂尺寸为2 mm × 2 mm × 10 mm，短臂为2 mm × 2 mm × 5 mm。胚胎头部置于T形连接处，腹面朝上。

图3 电穿孔操作流程示意图。将28期蝌蚪置于电穿孔室中，腹面朝上。将微移液管插入胶质腺下方的面部间充质组织中，进行注射。移出微移液管后，将L形电极平行置于头部两侧。施加8次50毫秒、20伏的方波脉冲。撤回电极。将蝌蚪培养至所需发育阶段。利用荧光显微镜观察吗啉寡核苷酸（MOs）或绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。

图 4 电穿孔后 12 小时（A）、48 小时（B）和 96 小时（C）的代表性蝌蚪（分别为阶段 30、34 和 44）。（A"–B"）在阶段 30 和 34 时，可在颅面间充质中观察到荧光标记的吗啉代寡核苷酸（MO）。在阶段 44 时，软骨中可检测到荧光信号（箭头，C'–C"）。肠道具有强烈的自发荧光。

讨论

在本视频中，我们展示了通过电穿孔介导将基因递送至非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪面部间充质的可行性。利用该方法，我们可以绕过基因功能操作在早期发育阶段产生的影响，从而在较晚的时间点靶向特定组织。我们的研究表明，颅面间充质细胞的异质性群体均可被影响，使我们能够追踪电穿孔细胞的谱系，并研究目标蛋白的细胞自主性需求。结合活体成像技术，我们可以利用该方法在颅面发育过程中随时间推移研究基因功能。这一新方法凸显了非洲爪蟾（Xenopus）在器官发生研究中的可操作性。我们预期该方法也可广泛适用于其他组织的形态发生与分化研究。