使用恒定力轴向光镊拉伸短DNA序列

摘要

我们展示了使用恒力轴向光镊来研究短DNA分子的力学特性。通过轴向拉伸DNA，我们最大限度地减少了传统侧向操作中产生的空间位阻和人为假象，从而能够研究长度短至约100 nm的DNA分子。

摘要

对于拉伸轮廓长度小于一千碱基对的DNA，单分子技术存在诸多实验困难。然而，许多重要的生物学事件（如组蛋白结合以及蛋白质介导的DNA成环^1,2）正是发生在此长度尺度上。近年来研究表明，DNA的力学特性在DNA压缩包装形成核小体和染色质纤维等基本细胞过程中起着重要作用^3,4。因此，深入理解短片段DNA的力学性质显得尤为重要。本文中，我们提供了一种实用的单分子光镊技术操作指南，该技术由我们实验室开发，可用于研究轮廓长度短至数百个碱基对的DNA的力学行为。

拉伸短片段DNA的主要难点在于，传统的光镊通常被设计为在垂直于载物台的方向上施加力^5,6, （见图1）。在此几何构型中，当DNA长度为亚微米级时，微珠与DNA锚定的盖玻片之间的夹角变得非常陡峭。此时必须考虑轴向位置的影响，这可能带来技术上的挑战；并且由于延伸会使微球更靠近盖玻片，空间位阻效应随之增强。此外，由于微球具有不对称性，在光镊中微球旋转时，侧向延伸会在延伸过程中因反作用力方向的改变而产生不同程度的扭矩。

用于拉伸亚微米级DNA的替代方法面临着各自独特的障碍。例如，双光束光镊仅能拉伸长度接近光波波长的DNA，此时两个光镊之间以及微球间光散射引起的干涉效应会带来显著问题。若将其中一个光镊替换为微移液管，很可能也会遇到类似的挑战。虽然可以直接利用轴向势阱来拉伸DNA，但需要采用主动反馈系统以施加恒定的力，而该系统的带宽将非常有限，尤其是在低力条件下。

我们通过使用恒力轴向光镊直接将DNA从盖玻片表面拉开，从而规避了这些基本问题^7,8。该方法通过将微球捕获在光势场的线性区域实现，在此区域内光力保持恒定，其大小可通过调节激光功率进行调控。将微球限制在线性区域内，还可作为对DNA的全光学力钳，其在轴向上可延伸近350 nm。同时，我们通过精细调节载物台的位置，补偿热漂移和机械漂移，使粘附在盖玻片上的参考微球始终保持在同一位置和焦平面上，从而实现近乎无限长的观察时间。

方案

1. 镊子设置

1. 来自1064 nm激光器的光束被分成两束正交偏振的光束。其中一束用于操控生物分子，另一束用于校准目的（见图2）。
2. 操控光束的强度由声光偏转器（AOD）控制，而每束光的位置和焦点则分别由光束转向镜和光学望远镜独立控制。
3. 随后，两束光通过另一个偏振分束器重新合并，并通过最后一组伸缩式光学元件进一步调节，使光束略微超过显微物镜的后焦平面孔径。校准光束采用50%的过填充可形成紧密的光镊，而操控光束则采用稍小的因子（约20%），从而获得较浅的聚焦，转化为线性势阱中更大的可操作区域。光束由PlanApo 60x/1.4油浸显微物镜紧密聚焦到样品池上。
4. 该光镊系统与一台自制的明场显微镜结合，后者通过聚光镜将卤素灯的照明光聚焦到样品室。明场图像通过二向色镜与激光光分离，随后成像到两台CCD相机上。其中一台CCD作为主要的数据采集手段，可通过软件触发以实现精确的采样率；另一台CCD用于成像一个固定的参考微球，其位置作为反馈控制系统，以补偿显微镜的漂移。
5. 样品通过XY载物台相对于物镜进行粗调定位，随后可通过内置的三维压电载物台进行精确定位。
6. 前向散射和透射的激光由明场聚光镜收集，并聚焦到光电探测器上。所产生的信号通过100 kHz的抗混叠滤波器滤波，放大后由DAQ卡以200 kHz的频率采集。

2. 将微珠表观尺寸校准至轴向位置

1. 将直径为 800 nm 的聚苯乙烯微球分散液加入样品腔⁹，分散液用磷酸盐缓冲液稀释。静置 10–15 分钟后，用缓冲液轻轻冲洗，以去除多余的微球。
2. 找到随机附着在盖玻片上的微球，调节样品腔的高度，使微球位于焦平面下方约 1 μm 处，以生成离焦图像。
3. 为测量图像的表观尺寸，首先在 LabView 中使用几何模式匹配功能确定微球的中心位置。
4. 接着，通过围绕每个横截面中心对 360° 进行平均，生成微球的径向强度分布曲线。该径向分布曲线在明场图像中对应一个亮环，可用二次函数拟合以确定亮度峰值。该峰值与中心之间的距离可作为微球表观尺寸的度量。
5. 利用已校准的压电载物台，逐步增加微球的轴向位置，并在每个轴向位置使用 CCD 相机采集图像。
6. 对每幅连续图像重复进行图像分析，以建立微球表观尺寸与其轴向位置之间的关联（见图 3）。该方法获得的轴向分辨率约为 1.4 nm⁷。

3. 绘制操控光束的光势能分布

1. 首先将操纵光束与校准光束进行共线对准。校准光束在物镜后孔径处的功率应约为 50 mW，而操纵光束应弱得多，例如 10 mW。
2. 关闭操纵光束，利用刚性更强的校准光束捕获一个自由的微球。
3. 现在打开操纵光束。由于操纵光束的强度远弱于校准光束，微球的轴向位置将发生轻微扰动。由此引起的轴向位置变化可通过离焦的明场图像进行测量，方法如前所述。
4. 关闭操纵光束，同时保持微球仍被校准光束捕获，通过调节望远镜透镜来改变校准光束的轴向焦点位置。然后重新打开操纵光束，测量微球的后续位移，并重复此过程。
5. 可将位移量 ΔX 对校准光束焦点的轴向位置作图。对应于微球最大位移的轴向位置即为光阱线性区域的中心（见图 4）。
6. 获得操纵光束的光学力随轴向位置变化关系的最后一步，需要精确测量校准光束的刚度。为此，在关闭操纵光束的情况下，通过调节望远镜透镜，将由校准光束捕获的微球移动至距表面约一微米的高度处。
7. 通过光电探测器测量透射光强度，记录微球的热轴向运动。
8. 该信号的自相关函数可拟合为单指数衰减函数，从而得到涨落的时间常数 τ_z。
9. 微球的流体动力学摩擦系数 ζ 可根据其接近表面的情况进行修正^5,10。校准光阱的刚度由此可表示为 κ_z = ζ / τ_z（见补充材料 A 和 B）。
10. 已知校准光阱的刚度后，即可将先前测得的轴向位移转换为作用力 ƒ_z = κ_z ΔX。对该曲线进行积分可得到操纵光束轴向光势的空间分布图（见图 4）。

4. 拉伸 DNA 样品

1. 安装含有表面固定的 DNA 分子（< 1 kbp）的样品室⁹，在观察明场图像的同时，通过调节望远镜将操控光束的焦点略微置于未拉伸的微球上方。然后调节载物台的位置，直至其中一个微球被捕获。
2. 大致将微球定位在光镊 XY 平面的中心位置。在 LabView 中生成一系列方波信号并发送至声光偏转器（AOD），以周期性地开启和关闭激光束。仔细控制激光强度和开启时间，以防止样品室过热。通常使用约 2 mW 的激光功率（在物镜后孔径处测得），并发送持续 200 ms（开启）和 500 ms（关闭）的脉冲信号。发送至 AOD 的方波信号幅值应约为 0.5 V。
3. 观察激光反复开启和关闭时微球的运动情况，注意激光是否诱导微球运动出现特定方向性。通过压电载物台在 X 和 Y 方向上反复调节微球位置，使微球在 XY 平面上的随机运动呈现各向同性，尽管在激光开启时其运动明显受限。
4. 接下来，对微球在 Z 方向进行对齐。再次以脉冲方式开启和关闭激光束，同时实时测量微球的轴向位移。将载物台调节至线性响应区域的中心位置，即 Z 方向位移最大的点。
5. 在 Z 方向完成精确对齐后，必须检查光镊在 XY 平面是否仍处于中心位置。若 XY 对齐已发生变化，则必须重复 XY 和 Z 方向的对齐步骤，直至微球在三个轴向上均被正确居中。
6. 为拉伸 DNA，通过向 AOD 发送电压信号，以 0.025 V 为步长，将激光强度从 0 V 逐步增加至 0.5 V。在每个步骤中，以 100 fps 的速率记录 400 帧图像，并对这些图像进行平均以获得轴向位移。
7. 现在可绘制力-伸展曲线，并将其拟合至修正的蠕虫状链模型（WLC 模型）¹¹（参见补充材料 B）。

5. 代表性结果：

我们展示了两种DNA序列的力-延伸曲线：一段1298 bp和一段247 bp的序列，后者是我们能够可重复拉伸的最短序列。对于较短的DNA片段，传统的蠕虫状链（Worm-Like Chain, WLC）模型无法完全解释其力-延伸关系，因为在这些长度尺度下，必须考虑由边界约束引起的有限尺寸效应和零力延伸。因此，力-延伸测量数据需采用改进的WLC模型进行拟合，该模型以有效 Persistence length 和零力延伸作为拟合参数，详见补充材料。对于较长的双链DNA轮廓长度，有效 Persistence length 即为标称 Persistence length˜50 nm）时，可忽略其零力延伸。然而，当轮廓长度变短时，有效持久长度会显著低于50 nm，此时DNA即使在零外力下也表现出明显的延伸。

两种序列的力-伸长曲线数据及其相应的拟合结果如图5所示。根据修正的蠕虫状链（WLC）模型拟合，我们确定1298 bp DNA的有效持久长度为35 nm，247 bp DNA为25 nm。为便于说明，此处展示的是每种序列的单次力-伸长曲线测量结果。在实际操作中，应多次重复测量，并获得平均结果及相应的标准误差。还需注意的是，每次获得曲线后，必须确保微球仍处于捕获状态，并准确定位于线性响应区域内；否则，需按照本方案中先前所述的方法重新调整微球位置。

图1 轴向光镊原理。（左）传统的光镊在焦点附近捕获微粒，然后将微珠沿盖玻片侧向移动以施加张力。（右）在轴向光镊中，微球被捕获在远离焦点的位置，即光势的线性区域。在此构型中，聚合物在一定伸展范围内保持恒定张力。此外，增加激光强度可使微球沿轴向移动。

图 2 轴向光镊的示意图。 激光（1064 nm Nd:YVO₄）通过偏振分束器（PBS）被分成两束光。操控光束穿过声光偏转器（AOD），而校准光束则可通过望远镜透镜独立调节。随后，两束光通过另一个PBS重新合并，并由高数值孔径（N.A.）物镜聚焦到样品上。同时，用于追踪微球的明场照明光穿过样品后，经红外（IR）滤光片过滤，再由两个CCD相机成像，其中一个用于采集数据，另一个则参与反馈控制系统。

图3 轴向位置校准。 为校准轴向位置，我们在物镜载物台处于不同轴向位置时，采集固定在样品室盖玻片上的微珠的离焦图像。微球的尺寸由其中心与微球图像周围亮环峰值强度位置之间的距离确定。插图展示了径向强度分布，可用于确定微珠的尺寸。

图4 光学势能图谱的原理。 为了绘制操控光束的光学力分布，测量其在较强校准光束中对被捕获微球所诱导的轴向位移。确定该位移达到最大值的线性区域中心。通过对光学力随轴向位置变化的曲线进行积分，可得到光学势能。

图5 力-伸长曲线。 图中显示了由轴向光镊拉伸的一段随机的双链DNA（长度分别为1298 bp和247 bp，插图）的实验数据。数据点拟合至式（3）的修正WLC模型（实线），得到的有效持久长度分别为：1298 bp片段为34 nm，247 bp片段为25 nm。

讨论

传统的光镊依赖模拟或计算机控制的反馈系统，以对折射性物体施加恒定的力。这些主动反馈系统在样品发生突然伸展变化的情况下难以正常工作，例如蛋白质结合到DNA上，或分子马达沿纤维快速步进时。近年来已开发出多种施加恒定力的被动方法。其中一种方法用于实现RNA聚合酶在碱基对分辨率下的步进解析，该方法基于高斯激光束光学势的线性区域进行操作¹²。我们已将该方法改进，用于短生物分子的操作，构建了恒力轴向光镊系统。

轴向光镊可用于研究传统光学方法难以操控的短片段DNA。该技术已被用于研究长度仅数百个碱基对的短DNA分子的弹性⁸，并探测弹性张力对蛋白质介导的DNA成环过程的影响^13,14。在较短的尺度上，由氢键和堆叠能差异引起的序列依赖性效应可能显著影响DNA的弹性特性。轴向光镊是揭示这些序列依赖性对DNA弹性影响的理想工具¹⁵。此外，轴向光镊还将成为研究DNA在单个组蛋白周围缠绕行为的灵敏工具，并可用于探测任何快速行进的分子马达的活性，有望成为单分子研究工具箱中一种有价值的新型技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备	公司	货号	评论
Nd:YVO4 激光器	Spectra Physics	T40-Z-106C
声光偏转器	IntraAction	DTD-274HA6
显微镜物镜	Olympus	PlanApo	60X，数值孔径 1.4
压电平台	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ 轴平台
CCD相机	PixeLink	PL-A741
光电探测器	电光技术	ET-3020
聚苯乙烯微球	Spherotech	SVP-08-10	800 nm，链霉亲和素包被
抗地高辛	罗氏	11333089001	来自绵羊
引物	MWG操纵子	定制寡核苷酸	一条引物：生物素，另一条：地高辛
PCR试剂	New England Biolabs	TAQ 聚合酶，dNTPs
盖玻片	Fisher Scientific
缓冲液用其他化学品	Fisher Scientific
补充材料
A. 流体动力摩擦系数–高效
用于测定流体动力学摩擦系数 c–微球在表面附近的系数可采用以下展开式5,10:
其中引入了以下简写形式：
摩擦系数–效率根据流体黏度定义 η 以及微球的半径，微球中心位于某一距离处 η 表面之上。当展开至约十项时，该级数和收敛性良好。
B. 轴向位置对刚度标定的影响
捕获阱刚度的校准需在标定精度与捕获阱实际使用的轴向位置之间进行权衡。标定精度随距表面距离的增加而提高，因此通常在距表面约800-1000 nm处进行校准，该位置高于实际实验条件下的使用位置。
C. 修正的蠕虫状链（WLC）模型
力-延伸曲线可拟合到一个修正的WLC模型，该模型考虑了在零光力条件下的体积排斥效应，具体如下：
其中 Fopt 是光力， xo 是一个用于零力伸长的拟合参数，xopt 是在受力下的延伸， l 是DNA的轮廓长度，以及l*p 是用于拟合的第二个参数 "有效" 持久长度 Fwlc 由通常的WLC模型给出11 其中 ε 是DNA的相对延伸率。