我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。
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摘要
摘要
本文介绍一种利用编码 Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，并在丁酸钠存在条件下，将人类成体成纤维细胞重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC）的实验方案1-3。我们采用该方法对来自弗里德赖希共济失调患者（Friedreich's ataxia patient，GM03665，Coriell 仓库）的晚期传代（>p10）人类成体成纤维细胞进行了重编程。该重编程方法包括一种高效转导流程，即在含有病毒的培养基中，通过反复离心促进成纤维细胞的病毒感染。重编程后产生的 hiPSC 克隆通过活细胞免疫染色检测多能细胞表面标志物 Tra-1-81 进行鉴定，随后从未重编程的成纤维细胞中分离，并进行手动传代4,5。这些 hiPSC 直接从重编程培养板转移至 Matrigel 包被的培养板中，在无饲养层条件下继续培养。自第一次传代起，hiPSC 克隆即表现出典型的人胚胎干细胞（hES）样形态。采用本方案，超过 70% 被筛选出的克隆可成功扩增并建立稳定的细胞系。所建立的 hiPSC 细胞系表达典型的多能性标志物，包括表面标志物 TRA-1-60 和 SSEA-4，以及核内标志物 Oct3/4、Sox2 和 Nanog。 本方案已使用来自弗里德赖希共济失调患者及健康对照个体6的人类成体成纤维细胞、人类新生儿成纤维细胞以及人类角质形成细胞进行建立和验证。
方案
1. 病毒制备与转导
- 将Phoenix Ampho细胞以约7-8×106个/10 cm培养皿的密度接种于10 ml DMEM培养基中（DMEM高糖培养基，含10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺，不含抗生素），放入37°C、5% CO2的培养箱中过夜培养。
- 次日，使用12 μg编码Oct3/4、Sox2、Klf4、c-myc或GFP基因的质粒（Addgene质粒编号分别为17217、17218、17219、17220）和35 μl Fugene 6试剂对Phoenix细胞进行转染。将转染混合物配制于500 μl DMEM培养基中（DMEM高糖培养基，含2 mM L-谷氨酰胺，不含胎牛血清和抗生素），室温孵育20分钟。随后轻柔地将DNA复合物滴加至含有70–80%融合度Phoenix细胞的10 cm培养皿中。
- 转染后6–8小时更换培养基，加入含青霉素和链霉素的DMEM培养基（DMEM高糖培养基，含10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺）。
- 之后每隔12小时收集含病毒的培养上清共4次，合并所有收集液，并用0.45 μm滤器过滤以去除脱落细胞和碎片（含病毒颗粒的培养基可在冰箱中保存2周而不丧失感染活性，但不建议冷冻）。
- 进行逆转录病毒转导前24小时，将冻存的人成体成纤维细胞（第10代，Coriell Laboratories）从冻存库中取出并接种。将细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板（预先包被明胶）中，培养基为DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素及非必需氨基酸。
- 次日，将成纤维细胞培养基更换为来自Phoenix细胞的含病毒颗粒的培养基。向6孔板每孔加入含病毒的培养基（Oct4、Sox2、Klf4和c-myc各1 ml，共4 ml），并补充6 μg/ml多聚素（polybrene），随后在20°C下以1600×g离心1小时。转导约12小时后，将病毒培养基更换为成纤维细胞常规培养基。每隔24小时重复一次病毒感染和离心操作，共进行3次。
- 末次感染后继续用DMEM培养基培养成纤维细胞48小时。通过平行转导表达GFP的逆转录病毒培养基来检测感染效率。图1展示了离心辅助的逆转录病毒感染人成纤维细胞的效率。
2. 重编程
- 在明胶处理的6孔板中，以约2×105个细胞/孔的密度接种经γ射线照射的MEF饲养层细胞，使用成纤维细胞生长培养基进行培养。次日，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化感染的人成纤维细胞，并以约1.2×104个细胞/孔的密度接种至成纤维细胞生长培养基中。
- 次日将培养基更换为hES培养基（DMEM/F12，20% Knockout血清替代物，非必需氨基酸，青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，0.1 mM β-巯基乙醇，20 ng/ml基础成纤维细胞生长因子（bFGF）），重编程最初7天额外添加0.5 mM丁酸钠。每日更换培养基。
- 每日观察转导细胞的形态学变化。转导后的成纤维细胞接种至饲养层细胞后约5–10天，将开始出现类似hiPS细胞的克隆。接种至MEF饲养层细胞后约14–28天，hiPSC克隆即可进行分离。
3. 人诱导多能干细胞克隆的分离
- 在挑取hiPSC克隆前一天，用γ射线照射的MEF饲养层细胞（约每孔4×104个细胞）接种于24孔板中，并加入成纤维细胞生长培养基。在此阶段，也可将hiPSC克隆转移至无饲养层体系，使用Matrigel包被的培养板和mTeSR1培养基进行培养。
- 在分离hiPSC克隆前，移除MEF培养板中的成纤维细胞生长培养基，并用PBS洗涤MEF以去除残留的FBS。随后，每孔加入0.5 ml hES培养基（若为Matrigel包被的孔，则使用mTeSR1培养基），并添加10 μM ROCK抑制剂Y276327,8。
- 如有必要，在超净台内的显微镜下使用21号针头去除hiPSC克隆周围的成纤维细胞（见图2A-C）。用PBS冲洗培养板，然后加入含有Tra-1-81 StainAlive特异性抗体（1:200，Stemgent）的新鲜hES培养基。30分钟后，更换为含10 μM ROCK抑制剂的新鲜hES培养基。在荧光显微镜下观察培养板，并使用物镜标记Tra-1-81阳性克隆（见图2D）。
- 在超净台内的显微镜下，使用21号针头将Tra-1-81阳性的hiPSC克隆切割成若干小块（见图2E和F）。
- 使用移液器（P200）将hiPSC克隆片段转移至含有MEF或Matrigel的24孔板的各个孔中。避免转移非hiPS细胞。将培养板置于37°C、5% CO2的培养箱中，使hiPSC克隆贴壁24–36小时。
- 每天更换hES培养基或mTeSR1培养基（适用于在Matrigel上生长的克隆）。在初次转移至24孔板后48小时，可观察到具有正确hES样形态的hiPSC克隆。
- 每6–8天手动传代一次hiPSC克隆，依次转移至12孔板，随后转移至6孔板。
- 在完成克隆扩增并建立hiPSC细胞系后，通过免疫细胞化学方法检测多能性标志物TRA-1-60、SSEA-4、Oct3/4、Sox2和Nanog的表达情况（见图3）。通过核型分析和畸胎瘤形成实验评估所获细胞系的基因组完整性和分化潜能6,9。
4. 代表性结果
使用含逆转录病毒的培养基进行高效转导对于成功重编程至关重要。建议在每次重编程实验中，全程采用表达GFP的病毒进行转染/感染操作，以监测转导效率，如图1所示。根据文献10所述方法，通过非浓缩病毒培养基转导人成纤维细胞所测定的表达GFP病毒的滴度，通常在每毫升0.5–5 × 107 病毒颗粒（vp/ml）范围内。
成纤维细胞在末次感染后仅2天即可出现形态变化。在将人成纤维细胞接种至MEF饲养层细胞之前，应小心地对其进行计数。建议以三种不同密度接种细胞（每孔6×103、1.2×104、2.5×104，接种于6孔板的单个孔中），因为不同细胞系具有不同的生长特性，而接种密度对重编程效率至关重要。在重编程初期使用丁酸钠处理7至14天，可使hiPSC形成效率提高约5倍。通常情况下，尤其是当感染后的成纤维细胞以较高密度接种时，成纤维样细胞可能过度生长，覆盖整个培养皿并遮盖hiPSC克隆，如图2A所示。此时，可小心地将成纤维细胞层剥离并移除，以暴露hiPSC克隆（图2B）。随后，应使用hES培养基冲洗hiPSC克隆，并用Tra-1-81抗体进行染色。根据所用成纤维细胞的不同，约有20%–40%呈现iPSC样形态的克隆无法被Tra-1-81抗体染色。已鉴定的hiPSC克隆可在接下来的12–24小时内从培养板中转移。长时间孵育将导致hiPSC迅速分化。克隆可通过手动传代方式接种至MEF饲养层细胞或Matrigel包被的培养板上。扩增后建立的hiPSC克隆应通过免疫细胞化学（ICC）检测多能性标志物的表达，如图3所示。此外，对所获得的iPS细胞系进行详细的分子表征还应包括：利用RT-PCR分析多能性基因的表达、检测多能性基因启动子区域的DNA去甲基化状态，以及分析转基因沉默情况9。
图1. 利用表达GFP的逆转录病毒测定病毒转导效率。 （A, B）来源于弗里德赖希共济失调症患者（GM03665，Coriell 仓库）的人成体成纤维细胞，在连续两次感染GFP逆转录病毒培养基后进行观察。（C, D）人成纤维细胞使用同一批GFP逆转录病毒培养基感染，随后将6孔板直接离心1小时（1600g）。感染后48小时拍摄图像。
图2. hiPSC克隆的鉴定与分离。 （A）含有hiPSC并被成纤维细胞包围的培养板的相差显微图像。细胞在hES培养基中培养21天。（B, C）去除周围成纤维细胞层后的同一hiPSC克隆。（D）通过Tra-1-81表面标志物抗体进行活细胞染色，鉴定正确重编程的hiPSC克隆，随后用无菌针切割（E, F），并转移至24孔板的不同孔中。
图3. 通过免疫细胞化学检测确定hiPSCs中多能性特异性标志物Oct3/4、Nanog、Sox2、SSEA4和Tra-1-60的表达。
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讨论
研究人类疾病，特别是神经系统疾病和神经退行性疾病，一直面临巨大挑战，其主要原因在于难以获得合适的人源细胞模型。将易于获取的体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），并进一步将其分化为多种细胞类型的技术，为构建遗传性疾病的细胞模型提供了可能。此外，iPSCs 在再生医学的未来发展中具有广阔前景。因此，建立并优化可靠、高效且安全的体细胞重编程至多能性的方法至关重要。
从治疗应用的角度来看，开发不引起宿主基因组足迹突变的安全诱导多能干细胞（iPSC）生成方法至关重要。目前已有多种不向重编程细胞基因组引入永久性改变的体细胞重编程方法，例如转染附加体型载体、使用可切除转座子、腺病毒感染以及直接递送mRNA或蛋白质11-15。然而，这些无转基因方法的重编程效率较低，且依赖于被重编程体细胞的特性、类型和年龄。因此，这些方案并不适用于常存于细胞库中的高代次、成年体细胞的重编程。此外，为了能够对多个iPSC系进行详细表征，建立人类疾病的新模型，并开展高通量药物筛选，采用病毒载体递送转录因子的体细胞重编程是一种可行的策略。迄今为止，已有超过20项研究报道了利用患者特异性iPS...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由弗里德赖希共济失调研究联盟、阿诺德家族基金会的试点资助以及位于安德森癌症中心的干细胞与发育生物学中心共同资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| 非必需氨基酸 | Invitrogen | 11140 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 抗体 | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog 抗体 | 细胞信号技术公司 | 4903S | |
| Tra-1-60 抗体 | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 抗体 | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 小鼠胚胎成纤维细胞 | Globalstem | GSC-6201G | |
| 客观指标 | 尼康仪器公司 | MBW10010 | |
| Matrigel | BD 生物科学 | 354277 | |
| mTeSR1 | 干细胞技术 | 05850 | |
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | 罗氏集团 | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 物体标记 | 尼康仪器公司 | MBW10010 |
参考文献
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